改良Gallyas-Braak嗜銀染色在阿爾茨海默氏病中的應(yīng)用

曹莉 曹穎 文安智 官志忠

(1．水城礦業(yè)集團(tuán)總醫(yī)院病理科，貴州 六盤水 553001； 2．貴州省人民醫(yī)院病理科,貴州 貴陽(yáng) 550002；3．貴州醫(yī)科大學(xué)病理教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004 )

?

改良Gallyas-Braak嗜銀染色在阿爾茨海默氏病中的應(yīng)用

曹莉1曹穎2△文安智2官志忠3

(1．水城礦業(yè)集團(tuán)總醫(yī)院病理科，貴州 六盤水 553001； 2．貴州省人民醫(yī)院病理科,貴州 貴陽(yáng) 550002；3．貴州醫(yī)科大學(xué)病理教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004 )

阿爾茨海默??； 改良Gallyas-Braak嗜銀染色； 老年斑； 神經(jīng)原纖維纏結(jié)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病是一組原因不明、具有選擇性神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞變性特征的疾病，包括阿爾茨海默病(AD)、多系統(tǒng)萎縮、Pick病及進(jìn)行性核上性麻痹等。這些變性疾病有各自特殊的組織學(xué)病變，需經(jīng)特殊嗜銀染色或相應(yīng)蛋白的免疫組織化學(xué)染色才能顯示。國(guó)外多采用修訂的Gallyas-Braak嗜銀染色方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的Bodian或Bielschowsky嗜銀染色方法顯示AD 腦組織中神經(jīng)細(xì)胞外老年斑(SP)、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)、膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)包涵體等改變[1-2]。近年來國(guó)內(nèi)對(duì)該方法也逐漸引起重視[3-4]。我們參照文獻(xiàn)[3]在AD患者尸解腦標(biāo)本中進(jìn)行了檢測(cè)并做了進(jìn)一步的改進(jìn)，取得了良好的效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 AD患者及老年同齡對(duì)照者尸體解剖后腦海馬組織標(biāo)本由荷蘭Amsterdam 腦庫(kù)提供。其中AD患者10例，男性3例，女性7例，平均年齡為(81.8±7.3)歲，經(jīng)美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病語(yǔ)言障礙卒中研究所和阿爾茨海默病及相關(guān)疾病協(xié)會(huì)(NINCDS-ADRDA)診斷標(biāo)準(zhǔn)及病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診AD，死后尸體解剖平均延遲時(shí)間為(4.9±1.1) h；老年同齡對(duì)照者8例，男性4例，女性4例，平均年齡為(79.8±12.8)歲，經(jīng)臨床和病理學(xué)診斷排除神經(jīng)系統(tǒng)疾患，死后尸體解剖平均延遲時(shí)間為(7.1±2.8) h。腦組織固定于中性甲醛液，脫水后石蠟包埋，分別制作4 μm及8 μm石蠟切片待下一步檢測(cè)。

1.2 試劑 Gallyas-Braak 嗜銀染色試劑購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司；鼠抗Aβ1-42單克隆抗體、兔抗PHF-1多克隆抗體及EnVision檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)于Dako、Sternberger及Dako公司。

1.3 Gallyas-Braak 嗜銀染色試劑原液配制 (1)硝酸鑭液：將0.5 g硝酸鑭、2 g醋酸鈉加入100 mL蒸餾水；(2) 堿性碘化銀液：將4 g氫氧化鈉、10 g碘化鉀加入50 mL蒸餾水中，攪拌至清亮，加入1% 的硝酸銀3.5 mL，大力攪拌待沉淀消失，加蒸餾水將體積調(diào)至100 mL；(3) 顯影原液 I∶50 g無水碳酸鈉加入1 000 mL蒸餾水中；顯影原液Ⅱ：依次將2 g硝酸銨、2 g硝酸銀、10 g硅鎢酸加入1 000 mL蒸餾水；顯影原液Ⅲ：依次將2 g硝酸銨、2 g硝酸銀、10 g硅鎢酸、6.1 mL 40%的甲醛溶液加入1 000 mL蒸餾水中。將配置好的顯影原液Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ保存在黑色瓶中。使用前現(xiàn)取適量顯影原液 Ⅱ 加入等量顯影原液Ⅰ中，劇烈攪拌，再加入等量顯影液 Ⅲ，劇烈攪拌至澄清。

1.4 改良Gallyas-Braak 嗜銀染色步驟 (1) 8 μm 厚石蠟切片脫蠟至水洗；(2) 0.3%高錳酸鉀液 10 min，自來水沖洗后蒸餾水沖洗；(3) 1% 草酸液 1 min，自來水沖洗后蒸餾水沖洗；(4) 硝酸鑭液 1 h，蒸餾水洗 3 次，5 min/次；(5) 堿性碘化銀液 37℃ 溫箱孵育45 min，1% 醋酸洗 3 次，1 min/次；(6) 顯影液顯影約20～30 min，觀察切片變成淡棕色停止； (7) 1% 醋酸洗3 次，1 min/次；(8) 0.5% 氯化金溶液30 s～2 min，蒸餾水沖洗；(9) 1% 硫代硫酸鈉溶液固定 1 min，水洗10 min；(10) 乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 Aβ1-42、PHF-1免疫組化學(xué)染色步驟 Aβ1-42、PHF-1免疫組織化學(xué)染色4 μm厚石蠟切片行Aβ1-42、PHF-1免疫組織化學(xué)組化染色，采用EnVision二步法，按照說明書進(jìn)行操作，一抗Aβ1-42及PHF-1工作濃度分別為1∶50及1∶100， PBS替代一抗作陰性對(duì)照。

1.6 SP及及NFTs計(jì)數(shù)方法[5]于40倍顯微鏡視野下，對(duì)10例AD患者腦海馬CA4、CA3及CA1區(qū)1 mm×1 mm 的鏡下劃線方格內(nèi)的 SP 及 NFTs 計(jì)數(shù)，每張切片數(shù)10個(gè)視野，最后得出每個(gè)部位SP及NFTs每平方毫米平均數(shù) (個(gè)/mm2)。

2 結(jié) 果

2.1 改良Gallyas-Braak 嗜銀染色 AD患者與老齡對(duì)照者正常神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)纖維、膠質(zhì)細(xì)胞均不顯色，10 例AD患者海馬組織見棕褐色SP結(jié)構(gòu)(圖1A)，彌散斑和經(jīng)典斑均可見，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)見棕黑色NFTs (圖1B)，8例老齡對(duì)照者中3例見少量SP，均為彌散斑；8例均未見NFTs。

2.2 Aβ1-42及PHF-1免疫組織化學(xué)染色 10例AD患者海馬組織出現(xiàn)較多細(xì)胞外SP(圖1C)及細(xì)胞內(nèi)NFTs (圖1D)。3例老齡對(duì)照者出現(xiàn)少量 SP，均為彌散斑；8例對(duì)照者均未見NFTs。

注：A．改良Gallyas-Braak嗜銀染色顯示SP(×200倍)；B. 改良Gallyas-Braak 嗜銀染色顯示NFTs(×200倍)；C. Aβ1-42免疫組化染色顯示SP(EnVision×200倍);D.PHF-1免疫組化染色顯示NFTs(EnVision×200倍)。圖1 AD患者海馬組織CA1區(qū)SP及NFTs

2.3 SP、NFTs計(jì)數(shù) 經(jīng)改良Gallyas-Braak 嗜銀染色顯示SP、NFTs 數(shù)量與Aβ1-42、PHF-1免疫組織化學(xué)染色顯示SP、NFTs 數(shù)量大致相同，但改良Gallyas-Braak 嗜銀染色較免疫組化染色方法顯示SP和NFTs 數(shù)量稍少。AD組腦組織中SP、NFTs計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。

表1 AD組腦組織中SP和NFTs計(jì)數(shù)個(gè)/mm2]

3 討 論

嗜銀染色基本原理是將固定后的切片浸染于銀溶液中，再用還原劑處理，使銀顆粒沉著于組織中呈現(xiàn)深棕色或黑色。與傳統(tǒng) Bodian 或 Bielschowsky 嗜銀染色法不同，Gallyas-Braak 嗜銀染色法在浸銀前先使用硝酸鑭浸泡組織片，不顯示正常的神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)，只有異常的嗜銀細(xì)胞結(jié)構(gòu)才能被顯影，有利于觀察異常結(jié)構(gòu)。

我們按照文獻(xiàn)[3]行Gallyas-Braak嗜銀染色，但在AD患者腦組織中無法觀察到SP、NFTs，延長(zhǎng)物理顯影時(shí)間，仍不能見到SP、NFTs，且整張切片背景較淡。推測(cè)是否為堿性碘化銀液常溫浸銀1 min，不能有效地將銀顆粒沉著于組織中。針對(duì)該種情況，我們采用退行性染色方法進(jìn)行染色，即現(xiàn)將組織深染，使其超過所需程度，然后再用分化劑退掉不該著色部分，使該著色部分達(dá)到適宜程度。我們對(duì)浸銀時(shí)間和溫度進(jìn)行了改進(jìn)，選用37 ℃溫箱內(nèi)堿性碘化銀液避光孵育1 h，保證銀顆粒已沉著于組織中后，再利用分化劑氯化金溶液進(jìn)行調(diào)色，在顯影液中顯影約20～30 min，密切觀察切片變成淡棕色時(shí)立即停止顯影。經(jīng)改良后的Gallyas-Braak 嗜銀染色能清楚地顯示 AD 患者腦組織中的 SP、NFTs，彌散型SP和經(jīng)典型SP均可見，且背景較干凈，有助結(jié)果的判定。

我們還對(duì)該批標(biāo)本同期進(jìn)行了Aβ1-42及PHF-1免疫組化染色并與改良Gallyas-Braak 嗜銀染色結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，改良Gallyas-Braak 嗜銀染色法和Aβ1-42、PHF-1免疫組化染色均可顯示細(xì)胞外SP及細(xì)胞內(nèi)NFTs，免疫組化染色更為敏感，顯示的SP及NFTs數(shù)量較改良Gallyas-Braak 嗜銀染色稍多，背景更為清晰。但免疫組化試劑昂貴，操作較復(fù)雜，Gallyas-Braak嗜銀染色試劑便宜，染色方法簡(jiǎn)便，與Aβ1-42及PHF-1蛋白免疫組化染色結(jié)果基本一致，對(duì)某些神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的病理診斷和研究有很大的幫助,值得開展應(yīng)用。

在染色應(yīng)用時(shí)體會(huì)：(1)為取得良好的染色效果，染色劑硝酸鑭液和堿性碘化銀液應(yīng)是新近配制，顯影液使用前現(xiàn)用現(xiàn)配。(2)由于腦組織含水分較多，且銀染色需要石蠟切片較厚(約8 μm，較易顯示軸、樹突)，提高銀染液的溫度，雖然有助于銀顆粒沉著，但嗜銀染色時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，很容易掉片，試驗(yàn)中我們分別采用37 ℃溫箱內(nèi)堿性碘化銀液避光孵育15 min，30 min，45 min及1 h等不同孵育時(shí)間，結(jié)果顯示，孵育15 min和30 min，經(jīng)典SP可顯示，但較小的彌散SP不易顯示；而孵育1 h組織容易掉片；孵育45 min不易掉片，且可染出較小的彌散斑，與免疫組化結(jié)果較為一致；(3)氯化金溶液調(diào)色及物理顯影時(shí)間影響異常嗜銀結(jié)構(gòu)的陽(yáng)性率和正常背景結(jié)構(gòu)著色的抑制程度，需密切觀察并掌握好顯影時(shí)間。

[1] Koichi Inoue, Haruhito Tsutsui, Hiroyasu Akatsu, et al. Metabolic profiling of Alzheimer's disease brains[J]. Sci Rep, 2013,3:2364.

[2] Keiko Nakamura,Fumiaki Mori,Tomoya Kon, et al. Filamentous aggregations of phosphorylated α-synuclein in Schwann cells (Schwann cell cytoplasmic inclusions) in multiple system atrophy[J].Acta Neuropathol Commun,2015,3: 29.

[3] 朱明偉,王魯寧,張笑明.Gallyas-Braak銀染色方法在神經(jīng)組織病變中的應(yīng)用[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2001,30(5):384-385.

[4] 朱明偉, 王魯寧, 劉佳, 等. 神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的脊髓病理觀察[J].中華病理學(xué)雜志, 2015, 41(8): 587-593.

[5] 劉東戈,吳浩強(qiáng),滿開泉,等.阿爾茨海默病患者腦組織病理形態(tài)學(xué)及β-淀粉樣蛋白免疫組織化學(xué)觀察[J].中華病理學(xué)雜志,1999,28(6):405-408.

·經(jīng)驗(yàn)交流·

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260173)

R749.1+6

B

1000-744X(2016)09-0928-02

2016-04-21)

△通信作者，E-mail：caoying0417@163.com