支氣管哮喘患兒外周血Th17和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞變化及其活動(dòng)狀態(tài)相關(guān)性分析

夏治 湯文 黃成嬌 許慧

(湖北省婦幼保健院兒童重癥醫(yī)學(xué)科,湖北 武漢 430070)

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支氣管哮喘患兒外周血Th17和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞變化及其活動(dòng)狀態(tài)相關(guān)性分析

夏治 湯文 黃成嬌 許慧

(湖北省婦幼保健院兒童重癥醫(yī)學(xué)科,湖北 武漢 430070)

目的 探討支氣管哮喘患兒外周血Th17和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞( CD4+CD25+Treg)變化及其活動(dòng)狀態(tài)相關(guān)性。方法 選取80例患兒為觀察組研究對(duì)象，另選取健康個(gè)體40例作為對(duì)照組。將80例患兒分為急性期組和緩解期組，另將患兒劃分為輕度組、中度組、重度組。對(duì)所有患兒進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)和流式細(xì)胞數(shù)檢測(cè)，得出外周血Th17和CD4+CD25+Treg表達(dá)水平。比較觀察組和健康對(duì)照組的外周血Th17、CD4+CD25+Treg以及不同病情患兒、不同時(shí)期患兒外周血Th17、CD4+CD25+Treg。結(jié)果 觀察組患兒Th17、CD4+CD25+Treg分別為(2.86±0.45)，(5.36±0.73)，健康對(duì)照組為(1.05±0.31)，(7.13±0.88)，觀察組Th17明顯升高，CD4+CD25+Treg明顯降低(P<0.05)?；純杭膊∮奢p到重，外周血Th17呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而CD4+CD25+Treg呈下降趨勢(shì)，重度患兒Th17明顯高于中度和輕度患兒，CD4+CD25+Treg明顯低于中度和輕度患兒(P<0.05)。哮喘急性期和緩解期患兒Th17均明顯升高，急性期Th17為(2.29±0.88)，緩解期為(1.62±0.40)，急性期患兒Th17明顯高于緩解期組，哮喘急性期和緩解期患兒CD4+CD25+Treg均明顯降低，兩組分別為(5.41±0.82)，(6.12±0.89)，CD4+CD25+Treg明顯低于緩解期組(P<0.05)。結(jié)論 Th17表達(dá)與支氣管哮喘患兒疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，CD4+CD25+Treg與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，CD4+CD25+Treg和Th17可作為診斷支氣管哮喘的臨床指標(biāo)。

支氣管哮喘； Th17； CD4+CD25+； CD4+CD25+Treg； 活動(dòng)狀態(tài)

支氣管炎臨床上又名哮喘，研究[1]認(rèn)為該病是一種免疫調(diào)節(jié)異常性疾病。Th17細(xì)胞是一種新型效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群，外周血Th17和CD4+CD25+的表達(dá)可能與哮喘疾病有重要關(guān)系[2]。為了探討支氣管哮喘患兒外周血Th17和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞( CD4+CD25+Treg)變化及其活動(dòng)狀態(tài)相關(guān)性，我院嘗試開(kāi)展本研究，并取得了不錯(cuò)的效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2015年8月于我院接受治療的80例患兒為觀察組研究對(duì)象，另選取健康個(gè)體40例作為對(duì)照組。本研究方案報(bào)送本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)并獲得批準(zhǔn)后展開(kāi)工作。本研究參與人員均明確本研究的目的及其意義，簽署書面知情同意書。所有患兒在入院之前均符合全國(guó)兒童哮喘防治協(xié)作組制定的關(guān)于兒童哮喘疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除心、肝、腎等嚴(yán)重疾病及非首發(fā)患兒。按照患兒病情，將80例患兒分為急性期組和緩解期組，在急性期組中，男性患兒為23例，女性患兒為17例，平均年齡為(4.15±1.24)歲；在緩解期組中，男性患兒為22例，女性患兒為18例，平均年齡為(4.34±1.04)歲。對(duì)照組中，男性23例，女性17例，平均年齡為(4.22±1.12)歲。另外，根據(jù)《兒童支氣管哮喘診斷及防治指南》將患兒劃分為輕度、中度、重度，三組中男性患兒、女性患兒比分別為9∶18，10∶17，9∶17，平均年齡分別為(4.17±1.05)歲，(4.21±1.09)歲，(4.20±1.13)歲，各組患兒一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 器材 采用美國(guó)Biosource公司生產(chǎn)的PerCP-小鼠抗人CD4單克隆抗體(mAb)IgG1，異硫氰酸熒光素-抗人IL-17mAbgG、同型對(duì)照IgG1。采用ebioscience公司生產(chǎn)的人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞熒光抗體標(biāo)記試劑盒等。

1.3 方法 細(xì)胞分離培養(yǎng)：抽取患兒清晨空腹靜脈血5～10 mL，離心(頻率為2 000 r/min，25 min)后，分離PBMC，然后經(jīng)Hank洗滌液洗滌2次后重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基(含有100 mL/L胎牛血清)，然后用錐蟲(chóng)藍(lán)染色進(jìn)行活性檢驗(yàn)。之后將其培養(yǎng)與24孔板中，向培養(yǎng)孔中注入終濃度PMA 50 μg/L、離子霉素750 μg/L、高爾基體阻斷劑莫能星2.0 μmol/L，混合均勻后，將其置入二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，4 h后轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至裝有1.5 mL的EP試管內(nèi)，重復(fù)上述離心操作8 min，然后分離取出上清液，選取PBS液洗滌2次，選取2×106 PBMC進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)Th17細(xì)胞的檢測(cè)。流式細(xì)胞數(shù)檢測(cè)：首先將細(xì)胞均分至對(duì)照管和觀察管，加入110 μL的PerCP-小鼠抗人CD4 mAbIgG，混合均勻，靜置于室溫中，20 min后，將細(xì)胞表面抗原染色。注入Cytofix/Cytoperm液200 μL，置于4 ℃低溫靜置20 min細(xì)胞固定后，進(jìn)行洗滌操作，然后染色胞內(nèi)細(xì)胞因子。分別向觀察管中注入110 μL的FITC-抗人IL-17mAbIgG1；對(duì)照管中注入同型對(duì)照抗體，然后在4 ℃低溫下靜置避光孵育，約30 min后，用洗滌液洗滌2次，用300 μL洗滌液重懸細(xì)胞，24 h內(nèi)選取FCM進(jìn)行檢測(cè)。選用CD4直方圖設(shè)門區(qū)分Th細(xì)胞，以散點(diǎn)圖IIL-17染色養(yǎng)性表示Th17細(xì)胞，用Cellsquest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。再選取PBMC懸液，分別置于對(duì)照管和觀察管中，洗滌后細(xì)胞重懸于200 μL洗液中，加入FITC抗人CD4 mAb和APC抗人CD25 mAb，進(jìn)行孵育，操作同上。洗滌后，再加入Fix/Perm液固定/穿膜，同樣進(jìn)行孵育，操作同上。然后在進(jìn)行Perm/Wash液洗滌，留200 μL懸浮細(xì)胞。再向觀察管中加入PE抗人Foxp3抗體，向?qū)φ展苤屑尤胪蛯?duì)照抗體，重復(fù)上述孵育過(guò)程，延長(zhǎng)孵育時(shí)間為60 min后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。用CD4、CD25設(shè)門區(qū)分出CD4+、CD25+細(xì)胞，用散點(diǎn)圖表示Foxp3+細(xì)胞。

1.4 觀察指標(biāo) (1)兩組患兒外周血Th17、CD4+CD25+Treg比較。包括：80例觀察組患兒及40例健康對(duì)照組患兒外周血Th17、CD4+CD25+Treg總體情況比較。(2)不同病情患兒外周血Th17、CD4+CD25+Treg比較。包括：輕度、中度重度患兒外周血Th17、CD4+CD25+Treg水平比較。(3)不同時(shí)期患兒外周血Th17、CD4+CD25+Treg比較。包括：哮喘急性期患兒、哮喘緩解期患兒外周血Th17、CD4+CD25+Treg水平比較。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患兒外周血Th17、CD4+CD25+Treg比較 觀察組患兒Th17、CD4+CD25+Treg分別為(2.86±0.45),(5.36±0.73)，健康對(duì)照組為(1.05±0.31),(7.13±0.88)，觀察組Th17明顯升高，CD4+CD25+Treg明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 不同病情患兒外周血Th17、CD4+CD25+Treg比較 患兒疾病由輕到重，外周血Th17呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而CD4+CD25+Treg呈下降趨勢(shì)，重度患兒Th17明顯高于中度和輕度患兒，CD4+CD25+Treg明顯低于中度和輕度患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同病情患兒外周血Th17、CD4+CD25+Treg比較(%)

注：輕度組和中度組相比，△P<0.05；輕度組與重度組相比，*P<0.05。

2.3 不同時(shí)期患兒外周血Th17、CD4+CD25+Treg比較 哮喘急性期和緩解期患兒Th17均明顯升高，急性期Th17為(2.29±0.88)，緩解期為(1.62±0.40)，急性期患兒Th17明顯高于緩解期組，哮喘急性期和緩解期患兒CD4+CD25+Treg均明顯降低，兩組分別為(5.41±0.82),(6.12±0.89)，CD4+CD25+Treg明顯低于緩解期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

研究[3]顯示，支氣管哮喘主要特征是氣道炎癥、氣道重塑。而且隨著氣道炎癥的持續(xù)，氣道重塑進(jìn)一步發(fā)展，是導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的原因之一。兒童由于免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，CD4+T細(xì)胞各亞群的表達(dá)與成年人有所不同，CD4+T細(xì)胞各亞群對(duì)支氣管哮喘患兒免疫系統(tǒng)的作用具有重要意義[4]。Th17細(xì)胞應(yīng)答和氣道中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)對(duì)支氣管哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性具有主導(dǎo)作用，而且原因可能是Th2及Th17等多種因素共同作用的結(jié)果[5]。國(guó)外研究[6]通過(guò)建立小鼠模型，發(fā)現(xiàn)Th17具有增強(qiáng)哮喘小鼠氣道炎癥及高反應(yīng)性的作用。IL-17主要產(chǎn)生于Th17細(xì)胞，能夠有效促進(jìn)支氣管纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞核平滑肌細(xì)胞的活化，進(jìn)而促進(jìn)IL-6、TL-8及粒細(xì)胞集落刺激因子等含量增加，進(jìn)而對(duì)中性粒細(xì)胞在起到局部的浸潤(rùn)增殖發(fā)揮促進(jìn)作用，增強(qiáng)氣道內(nèi)炎癥反應(yīng)。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，重度支氣管哮喘患兒和重度支氣管哮喘患兒外周血Th17細(xì)胞與血漿IL-17的含量均明顯升高，而間歇—輕度哮喘患兒卻未出現(xiàn)大量表達(dá)，提示Th17細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)與支氣管哮喘病情程度有密切聯(lián)系。并且，Th17細(xì)胞可有道Th2活性，引起是中性粒細(xì)胞聚集及TgE產(chǎn)生，因此Th17間接參與了氣道重塑過(guò)程，Th17表達(dá)與氣道重塑的嚴(yán)重程度或疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

在陽(yáng)性率檢查方面，有研究[9]發(fā)現(xiàn)急性期支氣管哮喘患兒感染支原體陽(yáng)性表達(dá)率為20%，還有研究[10]發(fā)現(xiàn)其感染衣原體陽(yáng)性表達(dá)率為21%、12%。而且，患兒疾病由輕到重，外周血Th17呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，急性期明顯比緩解期高，患病患兒明顯比健康者高，而CD4+CD25+Treg呈現(xiàn)的趨勢(shì)剛好相反，可見(jiàn)，Th17細(xì)胞核CD4+CD25+Treg細(xì)胞具有聯(lián)合介導(dǎo)細(xì)胞免疫損傷的功能，加之支氣管哮喘患兒自身Th17/Treg失衡，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致氣道壁增厚，上皮下纖維化，平滑肌增生肥大，黏液腺分泌亢進(jìn)且微血管生成。一項(xiàng)報(bào)道[11]顯示，同各國(guó)對(duì)支氣管哮喘患兒痰液和外周血進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg表達(dá)明顯減少，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，中重度患兒CD4+CD25+Treg較少較輕度患兒更明顯，重度患者CD4+CD25+Treg減少最明顯，而臨床癥狀研究發(fā)現(xiàn)，患病小鼠CD4+CD25+Treg較少的同時(shí)過(guò)敏原誘導(dǎo)的氣道反應(yīng)性明顯增加，由此提示CD4+CD25+Treg表達(dá)減少可能引起哮喘的病情加劇。有學(xué)者[12]認(rèn)為，Th17和CD4+CD25+Treg細(xì)胞的分化之間存在關(guān)聯(lián)，在患兒體內(nèi)可能存在著Th17/Treg平衡，而Th17/Treg失衡在多種自身免疫疾病中普遍存在，Th17/Treg一旦失衡，對(duì)患者機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有促進(jìn)作用，這在一定程度上加重了疾病的程度。本研究中，支氣管哮喘中度、重度患兒明顯高于健康對(duì)照組，而CD4+CD25+Treg卻明顯低于健康對(duì)照組，可見(jiàn)，在支氣管哮喘患兒中存在Th17/Treg失衡現(xiàn)象。

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