雷諾嗪對(duì)大鼠急性心肌梗死早期左心室功能及梗死區(qū)心肌損傷的影響

張祥宇 江力勤 蔣芬芬 張冉 張建勤

雷諾嗪對(duì)大鼠急性心肌梗死早期左心室功能及梗死區(qū)心肌損傷的影響

張祥宇 江力勤 蔣芬芬 張冉 張建勤

目的觀察雷諾嗪（Ran）對(duì)大鼠急性心肌梗死早期左心室功能的影響，并探討可能的機(jī)制。方法60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組（分別注射低、中、高劑量Ran0.05mg/kg、0.5mg/kg、5mg/kg），每組各12只；制作急性心肌梗死模型；1h后用多導(dǎo)生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測量左心室收縮末期壓力（LVSP）、左心室舒張末曲壓力（LVEDP）、左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率（±dp/d tmax），采用ELISA法檢測超氧化物歧化酶（SOD）單位活性、丙二醛（MDA）濃度,比色法測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。結(jié)果與對(duì)照組比較，應(yīng)用Ran組LVEDP、±dp/d tmax、MDA、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均降低（均P＜0.05）；LVSP和SOD單位活性均升高（均P＜0.05）。結(jié)論Ran對(duì)急性心肌梗死早期左心室功能具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能與Ran升高梗死心肌的SOD單位活性,降低MDA濃度,降低缺血心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)。

雷諾嗪；急性心肌梗死；超氧化物歧化酶；丙二醛；鈣離子濃度

急性心肌梗死是指在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上，發(fā)生冠狀動(dòng)脈血供急劇減少或中斷，使相應(yīng)的心肌嚴(yán)重而持久的缺血所致的部分心肌急性壞死。急性心肌梗死后心臟舒縮能力顯著減弱或不協(xié)調(diào)。表現(xiàn)為急性心力衰竭，發(fā)生率約32%~48%。雷諾嗪（Ran）由美國食品藥品管理局（FDA）2006年批準(zhǔn)用于慢性心絞痛的治療，多項(xiàng)臨床研究顯示，Ran可改善慢性心絞痛患者的運(yùn)動(dòng)耐量、心絞痛發(fā)作時(shí)間，降低慢性心絞痛患者心肌缺血事件的發(fā)生率[1-3]，Sharon等[4]證明Ran可減少急性心肌梗死后心肌的瘢痕面積，提高心功能。Ran對(duì)急性心肌梗死早期心功能的影響目前研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎SD大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支制作急性心肌梗死模型，頸外靜脈注射低、中、大劑量Ran，觀察Ran對(duì)急性心肌梗死早期心功能的影響，并探討可能的影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑60只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體重250~350g，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（蘇）2001-0003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)操作符合浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法要求。鹽酸雷諾嗪（美國Sigma公司，批號(hào)：093M4708V），戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，批號(hào)：20141010），0.9%氯化鈉溶液（杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：C1409252），肝素鈉注射液（山東信宜制藥有限公司，批號(hào)：110903），SOD檢測試劑盒，MDA檢測試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司，批號(hào)：201501），細(xì)胞鈣離子濃度比色法定量檢測試劑盒（美國GenMed公司，GNS50097.1）。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器眼科手術(shù)器械（上海醫(yī)療器械廠生產(chǎn)），大鼠手術(shù)臺(tái)，6/0縫線，小型動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟軟件有限公司，型號(hào)：HX-101E），BL-420/820生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司生產(chǎn)），臺(tái)式小型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司，型號(hào):5417R），微量子紫外分光光度計(jì)（美國Thermo scientific公司，型號(hào)：NanoDrop ND-2000），全波長讀數(shù)儀（美國Thermoscientific公司，型號(hào)：MultiskanGO），移液器（德國Eppendorf公司，型號(hào)：Research），電子分析天平（瑞士Mettler-Tloledo公司，型號(hào)：MS403s/ MS204s）。

1.3方法

1.3.1分組60只健康雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為：假手術(shù)組、對(duì)照組（結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，注射0.9%氯化鈉溶液）、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組12只，后3組分別注射Ran 0.05mg/kg、0.5mg/kg、5mg/kg[5-6]，同時(shí)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。

1.3.2造模大鼠稱重，3%戊巴比妥鈉2.5ml/kg腹腔注射麻醉，腱反射消失后仰臥位固定，全身肝素化。頸前區(qū)備毛，分離右頸外靜脈；分離氣管，甲狀軟骨下氣管軟骨換切開氣管，自制內(nèi)徑2mm、長5cm的氣管導(dǎo)管從環(huán)狀軟骨下2~3個(gè)軟骨環(huán)下插入，深度1cm。連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，設(shè)置潮氣量6 ml/kg，頻率80次/min，吸呼1∶2。胸前區(qū)備毛，常規(guī)消毒，對(duì)照組、低劑量組、中劑量組，高劑量組分別頸外靜脈單次注射0.9%氯化鈉溶液2.5ml/kg， Ran0.05mg/kg、0.5mg/kg、5mg/kg，10min后，沿左鎖骨中線縱行切開皮膚，在第4~5肋間鈍性分離肌層，打開胸腔，剪開心包，輕壓右側(cè)胸廓，擠出心臟。選擇在左心耳和肺動(dòng)脈圓錐之間，距離冠狀動(dòng)脈起始處2~3mm，以6/0無損傷逢合針結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支；將心臟回納入胸腔，閉合胸腔，心電圖1~5min內(nèi)見ST段明顯抬高，為造模成功[7]。心電圖監(jiān)測心率，心室率＜250次/min，結(jié)扎前已經(jīng)出現(xiàn)室性心律失常為不符合實(shí)驗(yàn)要求，需排除。

1.3.3多導(dǎo)生物機(jī)能系統(tǒng)測定大鼠左心室功能冠狀動(dòng)脈結(jié)扎1h后測量左心室功能。分離大鼠頸動(dòng)脈，用自制頸動(dòng)脈插管穿刺頸動(dòng)脈，連接換能器和多導(dǎo)生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，在多導(dǎo)生物機(jī)能系統(tǒng)檢測下將動(dòng)脈插管插入左心室，測量左心室收縮末期壓力（LVSP）、左心室舒張末曲壓力（LVEDP）、左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率（±dp/dtmax）。

1.3.4 ELISA法測定SOD活性、MDA濃度每組按隨機(jī)數(shù)字表法選取6只大鼠，取左心室梗死區(qū)心肌組織，稱重PBS清洗，液氮冷凍后碾碎成粉末，加入裂解液，勻漿，2 500g離心20min，收集上清液，按試劑盒說明書加樣450nm波長測各孔吸光度，計(jì)算SOD活性單位、MDA濃度。

1.3.5比色法測鈣離子濃度每組按隨機(jī)數(shù)字表法選取6只大鼠，測定梗死區(qū)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。取梗死區(qū)心肌組織稱重，清洗，液氮冷凍后碾碎成粉末，加入裂解液，孵育30min，16 000g離心5min，取上清液，分光光度儀選570nm波長，按試劑盒說明書進(jìn)行比色法測鈣離子濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

對(duì)照組2只，低劑量Ran組1只大鼠結(jié)扎左前降支后1h內(nèi)出現(xiàn)心室顫動(dòng)死亡，對(duì)照組1只大鼠結(jié)扎后心率較低，予以排除，其余56只大鼠結(jié)扎后1h內(nèi)心電圖監(jiān)測心率符合入組標(biāo)準(zhǔn)。

2.1各組大鼠左心室功能指標(biāo)比較見表1。

由表1可見，對(duì)照組與假手術(shù)組比較，LVSP、+dp/dtmax下降，-dp/dtmax、LVEDP升高（均P＜0.05）；低劑量組與對(duì)照組比較，LVEDP下降（P＜0.05）；高劑量組與中劑量組比較、中劑量組與對(duì)照組比較，LVSP、±dp/dtmax均升高，LVEDP下降（均P＜0.05）。

表1 各組大鼠左心室功能指標(biāo)比較

2.2各組大鼠SOD、MDA及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度比較見表2。

表2 各組大鼠SOD、MDA及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度比較

由表2可見，對(duì)照組與假手術(shù)組比較，MDA升高（P＜0.05），高劑量組與中劑量組比較、中劑量組與低劑量組比較、低劑量組與對(duì)照組比較，MDA均下降（均P＜0.05）。對(duì)照組與假手術(shù)組比較，SOD下降（P＜0.05），低劑量組與對(duì)照組比較，SOD升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中劑量組與低劑量組比較、高劑量組與中劑量組比較，SOD均升高（均P＜0.05）。對(duì)照組與假手術(shù)組比較，鈣離子濃度升高（P＜0.05），低劑量組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），高劑量組與中劑量組比較、中劑量組與低劑量組比較，鈣離子濃度均下降（均P＜0.05）。

3 討論

急性心肌梗死時(shí)，心肌細(xì)胞出現(xiàn)缺血損傷，Na+電流改變，晚鈉電流增加引起心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位0相上升速度和幅度下降，繼發(fā)動(dòng)作電位時(shí)程及復(fù)極異常，Ca2+電流改變引起動(dòng)作電位時(shí)程和復(fù)極及心肌細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)異常，易誘發(fā)折返和后除極。此種電重構(gòu)在急性心肌缺血時(shí)（冠狀動(dòng)脈結(jié)扎1h）較梗死1周時(shí)更顯著[8]。Ran為晚鈉電流阻滯劑，是新型抗心絞痛藥物。Dhalla等[9]證實(shí)Ran可阻滯包括晚鈉電流在內(nèi)的多種離子通道電流，具有抗心律失常效應(yīng)。多項(xiàng)研究顯示，Ran可減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，增加心肌舒張功能，對(duì)心率和血壓無顯著影響[10]。Morrow等[11]在一項(xiàng)將Ran應(yīng)用于非ST段抬高型心肌梗死，B型腦鈉肽（BNP）＞80pg/ml的心力衰竭患者心血管相關(guān)事件發(fā)生率進(jìn)行研究，結(jié)果證實(shí)Ran可降低慢性心絞痛患者的心血管相關(guān)死亡率、心肌再梗死發(fā)生率。

LVSP、+dp/dtmax反映左心室收縮功能，LVEDP反映心室壁僵硬度，-dp/dtmax主要反映左心室舒張功能。急性心肌梗死時(shí)，左心室功能急聚下降，發(fā)生急性心力衰竭。研究顯示，Ran可增加慢性心力衰竭患者的心肌收縮力，改善急性心力衰竭時(shí)心功能，對(duì)血壓和心率影響不顯著[12-13]。本實(shí)驗(yàn)中Ran可改善急性心肌梗死大鼠的心室收縮舒張功能，對(duì)心室壁的僵硬度具有改善作用，與Morrow等[11]、Figueredo等[14]的研究結(jié)果相符。

急性缺血時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)ATP減少，H+濃度增加，Na+-H+交換增加，細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高，Na+-Ca2+泵交換增加，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加；晚鈉電流生成增加，晚鈉電流使Na+-Ca2+泵活動(dòng)增加，細(xì)胞Ca2+超載造成心肌組織過氧化物生成增多，加重心肌細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)中Ran小劑量干預(yù)心肌缺血早期心肌細(xì)胞，測得心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度較缺血心肌無明顯差異，中、大劑量Ran可降低缺血心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，可降低鈣離子超載導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷，增強(qiáng)心功能，Ran保護(hù)心功能作用可能和其阻滯缺血心肌組織的晚鈉電流，減輕心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載相關(guān)。

MDA是脂質(zhì)過氧化終末代謝產(chǎn)物，急性心肌缺血時(shí)，MDA生成增加，MDA值能夠反映心肌脂質(zhì)過氧化程度從而間接反映心肌缺氧損傷。SOD在體內(nèi)清除氧自由基抗氧化酶系統(tǒng)起主要作用，SOD活性能反映機(jī)體內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化的能力。心肌組織缺血、缺氧時(shí)，氧自由基生成增加，心肌組織SOD活性可明顯降低，MDA濃度增加，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組SOD活性單位較假手術(shù)組顯著降低，Ran低劑量對(duì)缺血心肌組織SOD、MDA影響不顯著，中、大劑量可升高缺血心肌組織SOD活性，降低MDA濃度，表明Ran可改善心肌缺血時(shí)的過氧化物損傷，可保護(hù)心肌組織?？赡芘cRan降低梗死區(qū)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度相關(guān)。

綜上所述，Ran對(duì)急性心肌梗死早期左心室心功能有保護(hù)作用。Ran保護(hù)心功能的作用可能與Ran可減輕梗死區(qū)心肌細(xì)胞內(nèi)Ran濃度，減輕心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載造成的心肌氧化損傷相關(guān)。

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The effects of ranolazine on left ventricular function of and infarction myocardium of rat following the acute myocardial infarction

ZHANG Xiangyu,JIANG Liqin,JIANG Fenfen,et al.Department of Cardiology,the Second Hospital of Jiaxing,Jiaxing 314000,China

Objective To exp lore the effects of ranolazine on left ventricular function of rat during the early period after acute m yocard ial infarction and its mechanism s.Methods 60 SD rats were random ly d ivided into sham surgery group, control group,low dosage group(ranolazine,0.05mg/kg),m idd le dosage group(0.5mg/kg),and high dosage g roup (5mg/kg).LVSP,LVEDP,dp/d tmax were measured by multi-channel biology function laboratory system,SOD activity and MDA concentration were measured by ELISA,and intracellular calcium ion concentration was measured by colorimetric method one hour after estab lish of acute myocardial infarction model.Results LVEDP,±dp/d tmax,MDA and intracellular calcium ion concentration decreased,LVSP and SOD activity increased in ranolazine treated g roups com pared to control group(all P＜0.05).Conclusion Ranolazine can p rotect left ventricular function of rat during early phase of acute myocardial infarction.This may be due to ranolazine increasing SOD activity and reducing concentrations of MDA and intracellular calcium ion.

Rnolazine;Acute m yocard ial infarction;SOD;MDA;Calcium concentration

2016-03-29）

（本文編輯：馬雯娜）

嘉興市科技計(jì)劃（項(xiàng)目編號(hào):2015AY23025，2013AY21043-6）

314000浙江省嘉興市第二醫(yī)院心內(nèi)科

江力勤，E-mail:jiangliqin1961@sina.com

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