丹蔞片和血府逐瘀顆粒對動脈粥樣硬化大鼠脂質代謝和炎癥反應影響的比較研究

陳潔　繆靜　徐曉明　戴金　毛威

丹蔞片和血府逐瘀顆粒對動脈粥樣硬化大鼠脂質代謝和炎癥反應影響的比較研究

陳潔繆靜徐曉明戴金毛威

目的觀察丹蔞片和血府逐瘀顆粒對動脈粥樣硬化大鼠脂質代謝和炎癥反應的影響。方法40只雄性Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、阿托伐他汀鈣組、丹蔞片組、血府逐瘀顆粒組，每組8只。正常組大鼠喂食基礎飼料，余4組均采用高脂飲食聯(lián)合維生素D3腹腔注射的方法復制大鼠動脈粥樣硬化模型。模型組、阿托伐他汀鈣組、丹蔞片組、血府逐瘀顆粒組分別給予生理鹽水、阿托伐他汀鈣混懸液、丹蔞片混懸液、血府逐瘀顆?；鞈乙汗辔父深A8周。干預結束后，檢測大鼠血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、脂蛋白相關磷脂酶A2（LP-PLA2）水平，采用熒光定量PCR法檢測大鼠胸主動脈內IL-6、TNF-α、MCP-1、LP-PLA2 mRNA表達。結果與正常組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C和IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL、LP-PLA2水平升高（均P＜0.05），胸主動脈內炎癥因子IL-6、TNF-α、MCP-1和LP-PLA2 mRNA表達上調（均P＜0.05）。與模型組比較，阿托伐他汀鈣組與丹蔞片組均能降低動脈粥樣硬化模型大鼠血清中TC、TG、LDL-C和IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL、LP-PLA2水平（均P＜0.05），胸主動脈內IL-6、TNF-α、MCP-1和LP-PLA2 mRNA表達下調（P＜0.05），組間比較差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。血府逐瘀顆粒組能降低血清中TC和炎癥因子IL-6、TNF-α、MCP-1，抑制胸主動脈內IL-6、TNF-α、MCP-1 mRNA表達（均P＜0.05），而血清中的TG、LDL-C、ox-LDL、LP-PLA2水平和胸主動脈內LP-PLA2 mRNA表達與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。結論丹蔞片和血府逐瘀顆粒均能抑制動脈粥樣硬化大鼠炎癥因子的表達，丹蔞片調節(jié)脂質代謝的作用優(yōu)于血府逐瘀顆粒。

動脈粥樣硬化；炎癥反應；脂質代謝；丹蔞片；血府逐瘀顆粒

冠心病是當今最主要的致死性疾病之一，在祖國醫(yī)學中屬“胸痹”、“心痛”范疇，病因病機復雜，治法繁多[1]。其中活血化瘀法和痰瘀同治法是目前應用最廣，研究最多的治法，活血化瘀法主要以“活血祛瘀，通脈止痛”為主，血府逐瘀湯是臨床上較常用的活血化瘀方劑；而痰瘀同治法主張“化痰祛瘀、化痰為先”，丹蔞片是根據(jù)痰瘀同治方劑所制的代表藥物。目前公認，冠心病的病理基礎是動脈粥樣硬化，脂質代謝和炎癥反應與動脈粥樣硬化關系密切，因此，我們以血府逐瘀顆粒和丹蔞片為觀察藥物，從脂質代謝和炎癥反應角度探討和比較活血化瘀和痰瘀同治不同中醫(yī)治法對動脈粥樣硬化的影響，現(xiàn)報道如下。

1　實驗材料和方法

1.1實驗動物SPF級健康雄性Wistar大鼠40只，體重（160±10）g，由中國科學院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[SCXK（滬）2012-0002]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心屏障系統(tǒng)大鼠飼養(yǎng)室[SYXK（浙）2013-0184]，實驗期間按實驗動物使用的“3R”原則給以人道主義關懷。

1.2藥物和試劑阿托伐他汀鈣（商品名：立普妥，20mg×7片，國藥準字H20051408）由美國輝瑞制藥有限公司提供；丹蔞片由吉林康乃爾藥業(yè)有限公司惠贈成品藥粉；血府逐瘀顆粒由內蒙古康恩貝藥業(yè)有限公司提供；維生素D3注射液購自上海通用藥業(yè)股份有限公司。血清生化指標檢測試劑：總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）均購自上海申能德賽診斷技術有限公司；ELISA檢測試劑盒：白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、脂蛋白相關磷脂酶A2（LP-PLA2）均購自上海西唐生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自日本TaKaRa公司。

1.3主要儀器和設備7020型全自動生化分析儀購自日本日立公司；Thermo多功能酶標儀購自美國Thermo公司；PTC-200型PCR儀、iQ5型RT-PCR儀購自美國BIO-Rad公司。

1.4方法

1.4.1實驗分組和建模雄性Wistar大鼠40只，適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、阿托伐他汀鈣組、丹蔞片組、血府逐瘀顆粒組，每組8只。正常組喂食基礎飼料，其余4組參照文獻[2]采用高脂飲食+維生素D3腹腔注射方法復制大鼠動脈粥樣硬化模型，高脂飼喂（1.25％膽固醇、0.5％3號膽鹽、10％蛋黃粉，10％蔗糖、10％豬油、68.25％基礎飼料），同時在喂食開始時一次性腹腔注射維生素D340萬U/kg，之后隔日腹腔注射10萬U/kg×3次。

1.4.2給藥方法造模4周后，根據(jù)人和動物體表面積折算的等效劑量比率表計算，以臨床等效劑量給藥，實施灌胃干預措施8周。正常組和模型組分別給予0.9％氯化鈉溶液10ml/（kg·d）灌胃，阿托伐他汀鈣組給予阿托伐他汀鈣0.18mg/ml，10ml/ （kg·d）灌胃，丹蔞片組給予丹蔞片45mg/ml，10ml/ （kg·d）灌胃，血府逐瘀顆粒組給予血府逐瘀顆粒100mg/ml，10ml/（kg·d）灌胃。

1.4.3相關指標檢測灌胃8周后，5組大鼠禁食不禁水12h，4％水和氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉，直接心臟取血，取血完畢后，立即游離整段胸主動脈，橫向切取胸主動脈并放入液氮冷凍罐中凍存，備組織RNA提取使用。（1）血清生化指標及IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL和LP-PLA2檢測：用全自動生化儀測定大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C等指標。采用ELISA法分別測定血清中IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL和LP-PLA2含量。操作步驟按照試劑盒說明進行。（2）胸主動脈內IL-6、TNF-α、MCP-1和LP-PLA2 mRNA測定：用總RNA提取試劑盒提取大鼠胸主動脈總RNA，用紫外分光光度儀測定其吸光度（A260）值總RNA的濃度，并用逆轉錄試劑盒合成cDNA，操作步驟按日本TaKaRa公司產(chǎn)品操作說明書進行。將cDNA用實時熒光定量PCR儀進行擴增，PCR擴增條件為：95℃變性5min；（95℃×10s，60℃×30s，72℃×30s）×40個循環(huán)后；72℃延伸7 min。以GAPDH為內參基因，用Primer 5.0軟件設計引物，大鼠IL-6、TNF-α、MCP-1、LP-PLA2和GAPDH mRNA序列的引物見表1。所有信息由Bio-Rad iQ5 PCR儀收集，根據(jù)Ct值，通過2-△△Ct法計算各個基因的相對表達量。

表1　實時熒光定量PCR引物序列

1.5統(tǒng)計學處理應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，進行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗后，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2　結果

2.1各組大鼠血清生化指標比較見表2。

表2　各組大鼠血清生化指標比較（mmol/L）

由表2可見，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平較正常組升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。阿托伐他汀鈣組、丹蔞片組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平均較模型組降低（均P＜0.05），但前兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而血府逐瘀顆粒組大鼠血清僅TC降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），LDL-C和TG水平與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。模型組大鼠血清HDL-C水平雖較正常組降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3個藥物組大鼠的血清HDL-C水平雖有升高趨勢，但與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.2各組大鼠血清IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL 和LP-PLA2水平比較見表3。

由表3可見，與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL、LP-PLA2水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。阿托伐他汀鈣組、丹蔞片組大鼠血清IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL、LP-PLA2水平均較模型組降低（均P＜0.05），但前兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。血府逐瘀顆粒組大鼠血清僅IL-6、MCP-1降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），ox-LDL、LP-PLA2水平與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.3大鼠胸主動脈內IL-6、TNF-α、MCP-1和LP-PLA2 mRNA水平見表4。

由表4可見，與正常組比較，模型組大鼠胸主動脈內IL-6、TNF-α、MCP-1、LP-PLA2 mRNA表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），阿托伐他汀鈣組、丹蔞片組、血府逐瘀顆粒組胸主動脈內IL-6、TNF-α、MCP-1 mRNA表達均較模型組降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。阿托伐他汀鈣組、丹蔞片組大鼠胸主動脈LP-PLA2 mRNA表達下調，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。但是，血府逐瘀顆粒組大鼠LP-PLA2 mRNA表達下調不明顯，與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3　各組大鼠血清IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL和LP-PLA2水平比較

表4　各組大鼠胸主動脈IL-6、TNF-α、MCP-1和LP-PLA2 mRNA水平比較

3　討論

動脈粥樣硬化病因病機復雜，治法繁多，在其復雜的病機和治法領域，血瘀證和活血化瘀療法一直是中醫(yī)藥防治動脈粥樣硬化研究中應用最早、使用最多、研究最深入的領域，在20世紀七、八十年代占主導地位。血瘀證的研究主要集中在炎癥、血流動力學、血小板功能、微循環(huán)等方面，研究證明，血瘀證與血液循環(huán)和微循環(huán)障礙、血液高黏滯狀態(tài)、血小板活化和黏附聚集、血栓形成、炎癥反應等多種病理生理改變有關[3-4]。活血化瘀類中藥具有抑制血小板聚集、抗凝、抗血栓形成、抑制炎癥反應、改善微循環(huán)等生理功能[5-6]。

但是，血瘀證的理論并不能解釋動脈粥樣硬化的病因和早期識別動脈粥樣硬化的危險因素，單純的活血化瘀法已不能滿足現(xiàn)代早防早治動脈粥樣硬化的要求。痰瘀理論的提出彌補了血瘀證的不足?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，動脈粥樣硬化的病因和危險因素眾多，有高血脂、高血壓、高血糖、高齡、缺乏運動、吸煙等，但最重要的是高脂血癥和脂質代謝異常，既是動脈粥樣硬化重要的促發(fā)因素，又是動脈粥樣硬化發(fā)展的推動因素。在長期高脂血癥情況下，增高的脂蛋白對動脈內膜產(chǎn)生損傷，內皮受損后，促發(fā)多種炎癥因子和黏附分子產(chǎn)生，促進單核細胞黏附內皮細胞，并移行進入血管壁，分化為巨噬細胞，后者吞噬大量脂質轉變?yōu)榕菽毎?堆積在動脈粥樣硬化病灶處，促使粥樣硬化斑塊的形成和不穩(wěn)定化。痰瘀理論認為，“痰濁”、“血瘀”是動脈粥樣硬化的重要病因[7]，“痰濁”是指長期飲食不節(jié)或肥胖少動，損傷脾胃，脾胃虛衰導致津液代謝失常，停聚體內，內生為痰濁。這種病理產(chǎn)物一旦形成，流竄停滯于機體各個組織器官中，引起血液黏稠性增高，流動性降低，從而產(chǎn)生瘀血，最終導致疾病發(fā)生[8]。痰瘀理論很好地揭示了動脈粥樣硬化的病因，與現(xiàn)代醫(yī)學認為高脂高糖、缺少運動、肥胖等危險因素具有高度的一致性。隨著人們生活水平的提高，不健康飲食和不良的生活習慣，必然導致痰瘀型患者的增加。

血府逐瘀顆粒是根據(jù)活血化瘀經(jīng)典方——血府逐瘀湯制成，丹蔞片是痰瘀同治的經(jīng)典方。臨床研究證實，血府逐瘀湯能明顯改善冠心病心絞痛患者的臨床癥狀，降低血漿超敏C反應蛋白，改善血液流變學[9-10]。丹蔞片能減少冠心病患者心絞痛發(fā)作頻率、疼痛持續(xù)時間、硝酸甘油用量等，降低炎癥因子及抗氧化作用[11]。實驗中，我們分別用血府逐瘀顆粒和丹蔞片干預高脂喂養(yǎng)的動脈粥樣硬化大鼠，結果發(fā)現(xiàn)兩組對IL-6、TNF-α、MCP-1等炎癥因子的表達均有很好的抑制作用，無論是血清中因子水平還是胸主動脈中的基因表達均下降，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義，而與阿托伐他汀鈣組相比，差異無統(tǒng)計學意義。說明活血化瘀和痰瘀同治兩種中醫(yī)治療方案均有很好的抑炎功效。

ox-LDL是LDL-C氧化后的產(chǎn)物，通過受體發(fā)揮促炎、促泡沫細胞形成、促發(fā)動脈粥樣硬化的作用，比天然的LDL-C起著更重要的地位[12]。LP-PLA2是最近發(fā)現(xiàn)的一種炎性標記物，是連接動脈粥樣硬化脂質代謝和炎癥反應的關鍵酶[13-14]，其主要作用是水解ox-LDL上的氧化磷脂，生成溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸[15]，后兩者為促炎介質，能刺激黏附分子和炎性細胞因子的產(chǎn)生。ox-LDL可以上調LP-PLA2的表達[16]，LP-PLA2反過來又增強ox-LDL的促炎、促動脈粥樣硬化的作用。動脈粥樣硬化患者往往同時伴有ox-LDL、LP-PLA2升高，LP-PLA2已成為防治動脈粥樣硬化的一個重要靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，血府逐瘀顆粒組大鼠血清中除TC與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義外，LDL-C、TG、ox-LDL、LP-PLA2下降均不明顯，與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義，胸主動脈組織內LP-PLA2表達也沒有明顯下降。但是，丹蔞片組大鼠血清中TC、LDL-C、TG、ox-LDL、LP-PLA2水平均明顯下降，胸主動脈LP-PLA2表達下調，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義，說明丹蔞片能降低LDL-C、減少LDL-C氧化和ox-LDL生成，抑制LP-PLA2靶點的表達，而血府逐瘀顆粒對血脂的調節(jié)和LP-PLA2靶點的抑制作用不明顯。丹蔞片調節(jié)脂質代謝的作用優(yōu)于血府逐瘀顆粒。

綜上所述，血府逐瘀顆粒（活血化瘀法）有很好的抑炎、抗血小板聚集、抗血栓作用，決定了其治療側重于斑塊破裂后，治療急性心血管事件為主，丹蔞片（痰瘀同治法）即治痰又治瘀，其良好的血脂調節(jié)作用決定其更適用于斑塊破裂前，穩(wěn)定斑塊，減少破裂，可早期預防和治療動脈粥樣硬化。根據(jù)疾病不同的時期，采用不同的中醫(yī)療法，辯證施治方為上策。

[1]楊秋梅.淺談中醫(yī)防治冠心病的治療方案[J].健康必讀雜志,2013, 3（3）∶347-348.

[2]劉艷,王坤根,葉武,等.痰瘀共治對大鼠動脈粥樣硬化斑塊的影響及其可能機制[J].中華中醫(yī)藥學刊,2008,26（7）∶1466-1469.

[3]陳可冀,李連達,翁維良,等.血瘀證與活血化瘀研究[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2005,3（1）∶1-2.

[4]馬曉娟,殷惠軍,陳可冀.血瘀證與炎癥相關性的研究進展[J].中國中西醫(yī)結合雜志,2007,27（7）∶669-672.

[5]劉群峰,蔡光先.血府逐瘀湯治療冠心病心血瘀阻證研究進展[J].光明中醫(yī),2012,27（10）∶2130-2132.

[6]杜朝陽,何佳,胡業(yè)彬.活血化瘀中藥干預動脈粥樣硬化作用機制研究進展[J].實用中醫(yī)藥雜志,2014,30（11）∶1067.

[7]趙步長,伍海勤,王一民,等.動脈粥樣硬化中醫(yī)淺析[J].光明中醫(yī), 2012,27（12）∶2518-2522.

[8]支艷,馬建偉,魏漢林,等.試論中醫(yī)痰瘀相關理論[J].中醫(yī)臨床研究, 2011,3（2）∶58-60.

[9]蔡興芬,陳龍勝,吳春美.血府逐瘀湯聯(lián)合西藥治療冠心病心絞痛的療效觀察及其對血液流變學影響[J].中國中醫(yī)藥科技,2015,22 （3）∶317-318.

[10]邱衛(wèi)東,楊晨雨.血府逐瘀湯加減對不穩(wěn)定型心絞痛患者療效及血漿超敏C反應蛋白的影響[J].中醫(yī)臨床研究,2012,4（6）∶14-15.

[11]王師菡,王階,李霽,等.丹蔞片治療痰瘀互阻型冠心病心絞痛的療效評價[J].中國中西醫(yī)結合雜志,2012,32（8）∶1051-1055.

[12]MitraS,GoyalT,MehtaJL.OxidizedLDL,LOX-1andatherosclerosis [J].CardiovascDrugsTher,2011,25（5）∶419-429.

[13]Vittos O,Toana B,Vittos A,et al.Lipoprotein-associated phospholipase A2（Lp-PLA2）:a review of its role and significance as a cardiovascularbiomarker[J].Biomarkers,2012,17（4）:289-302.

[14]Rosenson R S,Stafforini D M.Modulation of oxidative stress, inflammation,and atherosclerosis by lipoprotein-associated phospholipaseA2[J].JLipidRes,2012,53（9）∶1767-1782.

[15]Tellis C C,Tselepis A D.Pathophysiological role and clinical significance of lipoprotein-associated phospholipase A2（Lp-PLA2）bound to LDL and HDL[J].Curr Pharm Des,2014,20（40）∶6256-6269.

[16]WangWY,LiJ,YangD,etal.OxLDLstimulateslipoprotein-associated phospholipase A2 expression in THP-l monocytes via PI3K and p38MAPK pathways[J].Cardiovasc Res,2010,85（4）∶845-852.

（本文編輯：馬雯娜）

Comparison of lipid metabolism and inflammatory reaction in atherosclerotic rats receiving treatment with Danlou tablets or Xuefu Zhuyu granules

CHEN Jie,MIAO Jing,XU Xiaoming,et al.Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310006,China
Corresponding author:MAO Wei,E-mail:maoweilw@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of Chinese medicine Danlou tablets and Xuefu Zhuyu granules on blood lipid metabolism and inflammatory reaction in rat model of atherosclerosis.MethodsForty male Wistar rats were randomly divided into five groups,namely normal control group,model control group,atorvastatin group,Danlou group and Xuefu Zhuyu group.Normal control group was given basic forage,while other four groups were given high fat forage plus intraperitoneal injection of vitamin D3to establish atherosclerosis model,and then mRNAs in thoracic aorta of atorvastatin group and Danlou group were significantly decreased(all P＜0.05);and there were no significant differences between atorvastatin group and Danlou group(P＞0.05).Serum TC,IL-6,TNF-α,MCP-1 levels and expressions of IL-6,TNF-α,MCP-1 mRNA in thoracic aorta of Xuefu Zhuyu group were significant decreased (all P＜0.05)compared with model control group,while there were no significant differences in serum TG,LDL-C,ox-LDL, LP-PLA2 levels and expression of LP-PLA2 mRNA in thoracic aorta between two groups(P＞0.05).ConclusionBoth Danlou tablets and Xuefu Zhuyu granules can inhibit expression of inflammatory factors and relieve inflammatory reaction. Danlou tablets showed a stronger effect in regulating lipid metabolism than Xuefu Zhuyu granules.

intragastric administration of saline,atorvastatin suspension,Danlou tablet suspension and Xuefu Zhuyu granule suspension for 8 wk,respectively. After intervention,serum lipid and IL-6,TNF-α,MCP-1,ox-LDL,LP-PLA2 levels were measured by ELISA method,the expression of IL-6,TNF-α,MCP-1,LP-PLA2 mRNAs in thoracic aorta were detected by real-time fluorescent quantitative PCR(RT-fqPCR).ResultsCompared with normal control group,serum TC,TG,LDL-C,IL-6,TNF-α, MCP-1,ox-LDL and LP-PLA2 levels and the expressions of IL-6,TNF-α,MCP-1 and LP-PLA2 mRNAs in thoracic aorta of model group were significantly increased(all P＜0.05).Compared with model control group,serum TC,TG, LDL-C,IL-6,TNF-α,MCP-1,ox-LDL and LP-PLA2 levels and the expressions of IL-6,TNF-α,MCP-1 and LP-PLA2

Atherosclerosis;Inflammatory reaction;Lipid metabolism;Danlou tablets;XuefuZhuyu granules

浙江省中醫(yī)藥管理局基金項目（2014ZB043），吳階平基金項目（320.6750.12397）

310006浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院心內科，浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院（繆靜）

毛威，E-mail:maoweilw@163.com

（2015-12-06）