PEDV疫苗株與野毒株RT-PCR鑒別診斷方法的建立及臨床應(yīng)用

宋予震 ， 董 青 ， 梁中濤 ， 霍 軍

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 ， 河南鄭州450011 ； 2.雛鷹農(nóng)牧集團(tuán) ， 河南三門(mén)峽472100)

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PEDV疫苗株與野毒株RT-PCR鑒別診斷方法的建立及臨床應(yīng)用

宋予震1， 董 青1， 梁中濤2， 霍 軍1

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 ， 河南鄭州450011 ； 2.雛鷹農(nóng)牧集團(tuán) ， 河南三門(mén)峽472100)

根據(jù)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)疫苗株和野毒株在ORF3基因上的差異，我們?cè)O(shè)計(jì)了一對(duì)引物用于建立PEDV疫苗株和野毒株的RT-PCR鑒別診斷方法，其中疫苗株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為213 bp，野毒株為262 bp。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，該引物對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的擴(kuò)增均為陰性。2014年3月至2015年4月期間利用該方法對(duì)河南省51家豬場(chǎng)的581份腹瀉樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PEDV總陽(yáng)性率為54.9%(391/581)，其中野毒株陽(yáng)性率84.9%(332/391)，疫苗株陽(yáng)性率為15.1%(59/391)，說(shuō)明當(dāng)前腹瀉樣本中的PEDV檢出率依然較高，且在這些PEDV陽(yáng)性病料中以野毒感染為主。

豬流行性腹瀉病毒 ； 鑒別診斷 ； 臨床應(yīng)用

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的以仔豬腹瀉、嘔吐和脫水為主要癥狀的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。2010年底，豬腹瀉疫情在我國(guó)大范圍流行，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PED的廣泛流行使得豬場(chǎng)大范圍高強(qiáng)度使用腹瀉苗進(jìn)行免疫預(yù)防，目前國(guó)內(nèi)主要使用的PED 疫苗既有滅活苗也有弱毒苗，但存在一次免疫后保護(hù)期短、抗體效價(jià)不高，以及母豬防疫時(shí)保定不到位等缺陷，需要多次免疫才能產(chǎn)生足夠的抗體。PED疫苗的高強(qiáng)度免疫接種以及接種過(guò)程中造成的散毒等情況對(duì)PEDV 野毒是一種免疫壓力，但同時(shí)也是激發(fā)PEDV 野毒進(jìn)行基因重組、遺傳變異的刺激因素。本研究旨在建立一種可以區(qū)分PEDV 野毒株與疫苗株的RT-PCR 方法，并通過(guò)對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，為PEDV 的診斷提供快速、簡(jiǎn)便、有效的方法，同時(shí)調(diào)查PEDV 在免疫壓力的情況下疫苗株與野毒株的共存情況。

1 材料與方法

1.1 毒株 豬流行性腹瀉疫苗株(CV777株)與豬流行性腹瀉野毒株(CH/ZZ/11株)以及兩個(gè)毒株的相關(guān)pMD-ORF3質(zhì)粒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬偽狂犬病病毒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 臨床樣本 581份腹瀉樣品(糞便或小腸組織及內(nèi)容物)。

1.3 主要試劑 QIAamp Viral RNA Mini Kit，購(gòu)自Qiagen公司；RNA酶抑制劑、dNTP Mix ture、反轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物等，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；2×PCR Reagent，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；其他常用試劑，購(gòu)自Sigma公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上的豬流行性腹瀉疫苗株以及野毒株ORF3基因序列，利用Primer Primier7.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物P1和P2。上游引物P1：5′-CTTGTCTGTGGATGCTGTCCA-3′，下游引物P2：5′-GACTCAACAAAGCCTGCCAAT-3′，預(yù)期疫苗株的目的基因大小為213 bp，野毒株目的基因大小為262 bp，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.5 樣品處理以及病毒RNA的提取 取適量糞便病料使用PBS(0.01 mol/L，pH值7.2)10倍稀釋，小腸組織及內(nèi)容物加適量PBS后研碎后制備成10%混懸液，將病料混懸液渦旋震蕩后，10 000 r/min(4 ℃)離心15 min，收集上清，按照QIAamp Viral RNA Mini Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取，所提取的RNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 cDNA的合成和PCR 參考鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)說(shuō)明書(shū)合成cDNA，20 μL體系：RNase free ddH2O 11 μL，RNA模板2 μL，5×PrimeScriptBuffer 4 μL，dNTP Mix ture(10 mmol each)1 μL，隨機(jī)引物(20 pmol/μL)1μL，RNase抑制劑(40 U/μL)0.5 μL，M-MLV(200 U/μL)0.5 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。

PCR體系為20 μL：2×PCR Reagent10 μL，cDNA1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；然后94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.7 特異性試驗(yàn) 分別取CSFV、PRRSV、TGEV、PoRV、PRV的cDNA或DNA為模板，以PEDV疫苗株和PEDV野毒株為陽(yáng)性對(duì)照，以滅菌ddH2O作為陰性對(duì)照，PCR反應(yīng)體系及條件同1.6。

1.8 敏感性試驗(yàn) 測(cè)定疫苗株和野毒株的pMD-ORF3質(zhì)粒濃度，調(diào)整為統(tǒng)一濃度后按1∶1體積進(jìn)行混合，并使用滅菌ddH2O對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行連續(xù)的10倍稀釋，使用稀釋的質(zhì)粒作為模板按照1.6的PCR反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)，以滅菌ddH2O作為陰性對(duì)照，確定本方法的敏感性。

1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在不同時(shí)間，使用不同的已知PEDV陽(yáng)性和陰性的病料或疫苗進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，陰性樣本與陽(yáng)性樣本各20份，檢驗(yàn)本方法的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

1.10 臨床樣本檢測(cè) 對(duì)河南省鄭州、新鄉(xiāng)、駐馬店、信陽(yáng)、許昌、三門(mén)峽、周口、漯河、洛陽(yáng)9個(gè)地區(qū)51家豬場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查采樣，2014年3月至2015年4月共采集腹瀉仔豬樣本581份，對(duì)這些病料使用本方法進(jìn)行PEDV檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)病料中PEDV疫苗株和野毒株所占的比例。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化 本研究建立的PCR方法由于采用隨機(jī)引物以及2×PCR Reagent，因此主要對(duì)退火溫度和時(shí)間、延伸時(shí)間、P1和P2引物濃度進(jìn)行摸索和優(yōu)化。最終確定引物濃度為20 pmol/μL，添加劑量為1 μL，最佳PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；然后94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。所建立的RT-PCR方法能擴(kuò)增出疫苗株213 bp大小的片段，也能擴(kuò)增出野毒株262 bp大小的片段，與預(yù)期目的基因大小一致(圖1)。

圖1 目的基因的RT-PCR擴(kuò)增

M：DL-2 000 DNA Marker；1：陰性對(duì)照；2：PEDV疫苗株擴(kuò)增產(chǎn)物；3：PEDV疫苗株和野毒株混合物擴(kuò)增產(chǎn)物；4：PEDV野毒株擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果以滅菌ddH2O做陰性對(duì)照，用10倍稀釋的混合pMD-ORF3質(zhì)粒做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表示，本方法可以檢測(cè)出20.6 pg/μL的混合pMD-ORF3質(zhì)粒(兩種質(zhì)粒添加到PCR反應(yīng)體系中各10.3 pg)，并且該方法對(duì)兩種質(zhì)粒的敏感性相當(dāng)(圖2)。

圖2 RT-PCR敏感性試驗(yàn)

M：DL-2 000 DNA Marker；1：121 ng；2：20.6 ng；3：2.06 ng；4：206 pg；5：20.6 pg；6：2.06 pg；7：0.206 pg；8：ddH2O

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 利用本方法對(duì)CSFV、PRRSV、TGEV、PoRV、PRV的cDNA或DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果對(duì)這些病毒的擴(kuò)增均為陰性，表示本方法特異性良好(圖3)。

圖3 RT-PCR特異性試驗(yàn)

M：DL-2 000 DNA Marker；1：陰性對(duì)照；2：PEDV疫苗株；3：PEDV野毒株；4：豬瘟病毒；5：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；6：豬傳染性胃腸炎病毒；7：豬輪狀病毒；8：豬偽狂犬病病毒

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 不同時(shí)間使用本方法對(duì)20份PEDV陰性樣本、20份PEDV陽(yáng)性樣本(5份疫苗株或疫苗株傳代細(xì)胞毒、15份野毒株病料樣本)重復(fù)檢測(cè)3次，3次檢測(cè)結(jié)果均一致，表示本方法重復(fù)性和穩(wěn)定性均好。

2.5 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 對(duì)采集的51家豬場(chǎng)581份腹瀉樣本使用本方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，51家豬場(chǎng)全部為PEDV陽(yáng)性場(chǎng)，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為100%，581份樣本的PEDV陽(yáng)性率為54.9%(391/581)，391份PEDV陽(yáng)性樣本中野毒株陽(yáng)性率84.9%(332/391)，疫苗株陽(yáng)性率為15.1%(59/391)二者均為陽(yáng)性的樣本2份，占PEDV陽(yáng)性病料的0%(2/391)。

3 討論

2010年10月份開(kāi)始，PED在我國(guó)呈現(xiàn)暴發(fā)流行，給我國(guó)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，我國(guó)各地市均有腹瀉疫情報(bào)道[1-2]如Sun等[3]報(bào)道，中國(guó)南方10省暴發(fā)的PED疫情導(dǎo)致超過(guò)100萬(wàn)頭仔豬死亡。2013年美國(guó)和古巴也陸續(xù)開(kāi)始流行PED[4-5]，PED的流行對(duì)生豬及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的貿(mào)易交流帶來(lái)諸多不便。

ORF3基因編碼223個(gè)或224個(gè)氨基酸，是PEDV惟一的附屬基因。Wang等[6]的研究表明，ORF3能夠編碼一種離子通道蛋白，該離子通道的功能對(duì)病毒的感染性和致病性有重要影響。ParkS等[7]研究表明，ORF3基因是PEDV毒力的決定性因素之一。對(duì)GenBank中PEDV疫苗株與野毒株的ORF3基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)弱毒株在ORF3基因中存在連續(xù)數(shù)十個(gè)堿基的缺失，但是不同毒株之間ORF3基因的相似性在97.8%以上，周兵強(qiáng)[8]等對(duì)ORF3的基因進(jìn)行分群后發(fā)現(xiàn)2010年以后國(guó)內(nèi)流行的絕大多數(shù)毒株的同源性高，同屬于基因3群，疫苗株CV777株屬于基因2群。ORF3基因在疫苗株和野毒株之間的差異性以及ORF3基因的相對(duì)保守性為本研究提供良好的理論基礎(chǔ)。

由于RNA聚合酶缺乏矯正功能，所以RNA病毒容易發(fā)生變異和重組，自從SARS暴發(fā)后，人們開(kāi)始越來(lái)越關(guān)注冠狀病毒的變異情況?；贠RF3的基因分型結(jié)果，一般認(rèn)為與CV777株在同一亞群的毒株為疫苗株演化而來(lái)，為人為或者自然情況下野毒株與疫苗株發(fā)生基因重組或基因缺失導(dǎo)致。2010年以來(lái)，絕大多數(shù)豬場(chǎng)采用腹瀉疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，相當(dāng)一部分發(fā)生過(guò)PED疫情的豬場(chǎng)在使用腹瀉疫苗免疫的同時(shí)，使用腹瀉仔豬病料進(jìn)行返飼或制備自家滅活苗，高強(qiáng)度的疫苗毒株與野毒株同時(shí)存在加速了PEDV的演化，同時(shí)也加速了野毒株與疫苗株之間的基因重組。

本研究中疫苗株的陽(yáng)性率較李長(zhǎng)龍等[9]建立的野毒株與疫苗株鑒別PCR方法檢測(cè)的臨床樣本中疫苗株比例略高(15/2)，除收集病料的地區(qū)不同外，推測(cè)主要原因?yàn)槔铋L(zhǎng)龍等收集的是2013年的腹瀉病料，本研究收集的為2014年初至2015年初的病料，隨時(shí)間推進(jìn)，腹瀉樣本中疫苗株的陽(yáng)性率有上升趨勢(shì)。

本次采集樣品的51家豬場(chǎng)中，34家為基礎(chǔ)母豬數(shù)大于500頭的中大型豬場(chǎng)，17家為基礎(chǔ)母豬數(shù)在100～500頭之間的小型豬場(chǎng)。34家中大型豬場(chǎng)采集的387份腹瀉病料樣品中PEDV陽(yáng)性病料為299份，病料陽(yáng)性率76.5%(299/391)，PEDV陽(yáng)性病料中疫苗株陽(yáng)性48份，占全部疫苗株病料比例的81.4%(48/59)。17家小型豬場(chǎng)采集的131份腹瀉病料樣品中PEDV陽(yáng)性病料92份，病料陽(yáng)性率23.5%(92/391)，PEDV陽(yáng)性病料中疫苗株陽(yáng)性11份，占全部疫苗株病料比例的18.6%(11/59)。檢測(cè)出的2份既有疫苗毒又有野毒的病料來(lái)源于1家大型豬場(chǎng)。結(jié)合這些豬場(chǎng)PED免疫情況，產(chǎn)生這種結(jié)果的主要原因與規(guī)?；i場(chǎng)強(qiáng)化PED疫苗免疫有關(guān)。規(guī)?；i場(chǎng)在疫苗免疫、抗PEDV抗體制備、自家苗制備、PED治療等措施方面優(yōu)于小型豬場(chǎng)；同時(shí)PED具有潛伏期長(zhǎng)、周期流行性，PED疫苗具有一次免疫后效果差、需要多次加強(qiáng)免疫的特點(diǎn)。導(dǎo)致規(guī)?；i場(chǎng)PEDV疫苗毒和流行毒共存時(shí)間長(zhǎng)，因此規(guī)?；i場(chǎng)腹瀉病料中PEDV陽(yáng)性率低于小型豬場(chǎng)，但是疫苗株的陽(yáng)性率高于小型豬場(chǎng)。同一病料中檢測(cè)出疫苗毒和野毒，表示兩者可同時(shí)感染。

本方法可區(qū)分PEDV疫苗株和野毒株，具有簡(jiǎn)便、快捷、高效的特點(diǎn)。隨著分子診斷在規(guī)?；i場(chǎng)的普及，本方法不僅可應(yīng)用于科研單位進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，還可應(yīng)用于規(guī)?；i場(chǎng)臨床診斷，對(duì)PEDV的免疫和強(qiáng)毒感染情況區(qū)分具有重要意義。

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Development and Clinical Application of RT-PCR Differential Diagnosis Method for Vaccine Strains and Wild Strains of PEDV

SONG Yu-zhen1， DONG Qing1， LIANG Zhong-Tao2， HUO Jun1

(1.Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou 450011，China；.Truein Agro-Pastoral Group，Sanmenxia 472100，China)

Based on the genetic differences of ORF3 of the pig epidemic diarrhea virus(PEDV)vaccine strains and wild strains，we designed a pair of primers to establish a RT-PCR method for the differential diagnosis of PEDV vaccine strains and wild strains，of which the PCR amplification product length of the vaccine strains was 213 bp，and the wild strains was 262 bp.Specific test results showed that the amplification reactions of the primers to the pig infectious gastroenteritis virus，porcine rotavirus，swine fever virus，pig pseudo rabies virus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus were negative.We used this method to test 581 diarrhea samples from 51 pig farms of Henan province during the period of March 2014 to April 2015，and the results showed that the total positive rate of PEDV was 54.9%(391/581)，of which the positive rate of wild strains was 84.9%(332/391)，and the vaccine strains was 15.1%(59/391).All of these results indicate that the detection rate of PEDV in the current diarrhea sample is still high，and the PEDV positive samples mainly are wild strain infections.

Porcine Epizootic Diarrhea(PED) ； Differential Diagnosis ； Clinical Application

HUO Jun

2015-10-14

河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院——雛鷹農(nóng)牧經(jīng)濟(jì)技術(shù)研發(fā)中心研究項(xiàng)目(CYXYXM201401)

宋予震(1979-)，男，副教授，碩士，從事預(yù)防獸醫(yī)研究工作，E-mail：zzmzsong@163.com

霍軍，E-mail：huojun@tom.com

S852.65

A

0529-6005(2016)10-0006-03