miRNA-186靶向Twist-1促胃癌侵襲、遷移的機制研究

徐繼 何徐軍 葉再元 喻曉芬

●論 著

miRNA-186靶向Twist-1促胃癌侵襲、遷移的機制研究

徐繼 何徐軍 葉再元 喻曉芬

目的 檢測miRNA-186在胃癌中的表達情況，觀察miRNA-186表達改變對人胃癌細胞株侵襲、遷移能力的影響并分析可能的分子機制。方法 RT-PCR法檢測40例胃癌患者胃癌及配對的正常胃黏膜組織中miRNA-186的表達水平，同時檢測miRNA-186在胃癌細胞株和正常胃黏膜上皮細胞中的表達水平。在胃癌細胞中分別轉(zhuǎn)染miRNA-186模擬物（mimic）、抑制物（inhibitor）以上調(diào)、下調(diào)miRNA-186的表達，應(yīng)用Transwell試驗觀察其對胃癌細胞侵襲、遷移能力的影響。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miRNA-186可能的靶基因，并經(jīng)雙熒光素酶試驗及Western blot試驗驗證靶基因，分析其促轉(zhuǎn)移的分子機制。結(jié)果 胃癌組織相較于正常胃黏膜組織、胃癌細胞株相較于正常胃黏膜上皮細胞株的miRNA-186表達水平均降低（均P＜0.05）。在胃癌細胞中，分別上調(diào)、下調(diào)miRNA-186的表達水平，能夠抑制、促進胃癌細胞的侵襲、遷移能力。miRNA-186與Twist-1之間存在反向調(diào)控的關(guān)系，Twist-1是miRNA-186的靶基因。同時發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miRNA-186的表達時，Twist-1和N-cadherin表達上調(diào)，E-cadherin表達下調(diào)，而當(dāng)上調(diào)miRNA-186的表達時，Twist-1和N-cadherin表達下調(diào)，E-cadherin表達上調(diào)。結(jié)論 在胃癌組織中miRNA-186的表達水平降低，可能通過靶向調(diào)控Twist-1的表達，改變E-cadherin和N-cadherin的表達水平，導(dǎo)致胃癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而促進胃癌細胞的侵襲、遷移。

胃癌 miRNA-186 Twist-1 侵襲 遷移

胃癌是發(fā)病率居全球第4位、病死率居我國第2位的惡性腫瘤[1]。由于胃癌患者就診時多已處于疾病晚期（Ⅲ或Ⅳ期），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高達50%～75%，同時常有遠處轉(zhuǎn)移，術(shù)后5年生存率不足40%[2-3]。因此，深入研究有關(guān)胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制有重要的臨床意義。微小RNA（miRNA）是一段長度在22nt左右的非編碼RNA核苷酸序列，其通過結(jié)合靶基因的3’UTR區(qū)影響mRNA轉(zhuǎn)錄，抑制蛋白質(zhì)翻譯而發(fā)揮作用[4]。研究表明，多種miRNA的異常表達與胃癌細胞的增殖、侵襲、遷移密切相關(guān)，如miRNA-223、miRNA-21、miRNA-27a、miRNA-141等[5-9]。miRNA-186是新近發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生相關(guān)的miRNA，如膀胱癌、腸癌、非小細胞型肺癌和胰腺癌等[10-13]，其與胃癌的相關(guān)研究報道少見。本研究采用RT-PCR法分析miRNA-186在胃癌中的表達情況；在胃癌細胞中上調(diào)和下調(diào)miRNA-186表達，利用Transwell試驗分析其對細胞侵襲、遷移能力的影響；應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測相關(guān)靶基因,雙熒光素酶試驗和Western blot試驗進一步分析miRNA-186影響胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的可能分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃癌細胞株BGC-823、MKN-45、MKN-28、7901、BGC-803、AGS和正常胃黏膜上皮細胞株GES-1均購自上海中國科學(xué)院細胞庫；1640培養(yǎng)基購自美國Hyclon公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；細胞侵襲試劑盒（ECM554）和細胞遷移試劑盒（3422）購自美國Millipore公司；PCR引物由華大基因公司合成；Lipofectamine 3000試劑盒購自美國Invitrogen公司，Trizol試劑盒、Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit、Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBRRKit購自日本TaKaRa公司；miRNA-186 inhibitor and mimic購自美國Qiagen公司；Twist-1 3’-UTR報告載體pYr-MirTarget-Twist-1-3U及熒光素酶報告系統(tǒng)購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司；Twist-1、GAPDH、E-cadherin、N-cadherin抗體購自美國Abcam公司；PVDF膜、超敏化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒等常規(guī)試劑均購自于杭州捷程生物技術(shù)有限公司。

40例胃癌組織及配對的正常胃黏膜組織標(biāo)本取自2010年1月至10月在浙江省人民醫(yī)院行手術(shù)切除治療的胃癌患者（年齡38～73歲），冷藏于－80°C冰箱，保存于浙江省胃腸病學(xué)重點實驗室生物樣本庫?；颊呶赴㏕NM分期Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期12例，Ⅳ期12例。本研究得到浙江省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞株BGC-823、MKN-45、MKN-28、7901、BGC-803、AGS和正常胃黏膜上皮細胞株GES-1常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基（含青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml），置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 mRNA提取、cDNA合成、RT-PCR檢測miRNA-186表達水平 按照Trziol試劑盒使用說明書提取組織標(biāo)本和各細胞株的mRNA；采用Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit進行miRNA cDNA的合成；采用Mir-XTMmiRNA RT-PCR SYBRRKit檢測miRNA-186的表達水平。miRNA-186及RNU6b引物分別為5’-GCCCAAAGGTGAATTTTTTG-3’、5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；以95℃5 min、95℃10 s、60℃20 s、72℃20 s共40個循環(huán)進行RT-PCR檢測反應(yīng)，并分析其熔化曲線。組織標(biāo)本及各細胞株的miRNA-186相對表達水平采用2－ΔΔCt法進行計算。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染miRNA-186抑制物（inhibitor）和模擬物（mimic） 分別以每孔5×105個細胞的密度將胃癌MKN-28細胞（低表達miRNA-186）和7901細胞（高表達miRNA-186）鋪于6孔板中；常規(guī)培養(yǎng)24h后待其貼壁，利用Lipofectamine 3000試劑盒將MKN-28細胞和7901細胞分別轉(zhuǎn)染miRNA-186 inhibitor和 mimic及相應(yīng)的陰性對照，所有轉(zhuǎn)染步驟均按照試劑盒說明書執(zhí)行，轉(zhuǎn)染24h后收集細胞用于后續(xù)研究。

1.2.4 Transwell試驗檢測細胞侵襲、遷移能力 分別利用預(yù)先鋪有或者沒有ECMatrix基質(zhì)膠的膜孔徑為8μm的侵襲、遷移試劑盒分別進行細胞侵襲、遷移試驗。分別將上述轉(zhuǎn)染了miRNA-186 inhibitor、mimic及相應(yīng)陰性對照的胃癌7901及MKN-28細胞用無血清1640培養(yǎng)基調(diào)整至適當(dāng)細胞濃度，分別鋪于侵襲、遷移試劑盒的上室（均為每孔10×104個細胞），下室分別加入含30%胎牛血清的1640培養(yǎng)基；培養(yǎng)24h和48h后取出小室，95%乙醇固定10min，用棉簽小心拭除上室未穿過微孔膜的細胞，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察各組穿過微孔膜的胃癌細胞，分析上調(diào)和下調(diào)miRNA-186表達對胃癌細胞侵襲、遷移能力的影響。

1.2.5 miRNA-186靶基因預(yù)測及雙熒光素酶試驗 利用生物信息學(xué)軟件（miRBase Targets、TargetScan Release 5.0、PicTar databases）預(yù)測Twist-1是miRNA-186的一個靶基因。分別將Twist-1 3’-UTR區(qū)miRNA-186的結(jié)合位點序列（WT序列，野生型序列）及突變型序列（MUT序列，去除了miRNA-186結(jié)合位點的Twist-1 3’-UTR序列）插入到pYr-MirTarget-Twist-1-3U的報告載體中。雙熒光素酶檢測詳細操作步驟參見Promega公司的官方Protocol，簡要如下：將人293細胞按每孔2×103個細胞分別鋪于96孔板中，分為NC組（共轉(zhuǎn)染pYr-MirTarget報告質(zhì)粒、miRNA-186 mimics）、WT組（共轉(zhuǎn)染pYr-MirTarget-Twist-1-3U報告質(zhì)粒、miRNA-186 mimics）、MUT組（共轉(zhuǎn)染pYr-MirTarget-Twist-1-MUT-3U報告質(zhì)粒、miRNA-186 mimics）；每組設(shè)3個復(fù)孔，48h后利用多功能酶標(biāo)儀進行雙熒光素酶檢測，按照說明書配制PLB細胞裂解液、LARⅡ檢測液、Stop&Glo檢測液；在96孔中加入20μl細胞裂解液，然后加入100μl的LARⅡ溶液，混合后放入發(fā)光檢測儀檢測第1次發(fā)光值（海腎熒光值）；接著加入Stop&Glo檢測液，終止第1次發(fā)光，同時開始第2次發(fā)光，混合后放入發(fā)光檢測儀檢測第2次發(fā)光值（螢火蟲熒光值）；將第2次發(fā)光值除以第1次發(fā)光值，得到海腎/螢火蟲的雙熒光素酶檢測值。

1.2.5 Western blot法檢測蛋白表達水平 分別收集上述轉(zhuǎn)染了miRNA-186 inhibitor、mimic及相應(yīng)對照的胃癌7901及MKN-28細胞，利用RIPA裂解液在冰上裂解細胞60min，4℃15 000r/min離心30min，小心吸取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。取30μg蛋白，10% SDS-PAGE膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至0.45μm的PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h，分別加Twist-1（1∶1 000稀釋）、GAPDH（1∶3 000稀釋）、E-cadherin（1∶2 000稀釋）和N-cadherin（1∶1 000稀釋）一抗4℃振蕩孵育過夜，TBST洗滌3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1h，TBST洗滌3次，膜上加入ECL試劑，利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc MP，Bio-rad）檢測Western blot條帶信號。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗或配對t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-186在胃癌組織及胃癌細胞株中的表達水平 見圖1。

圖1 miRNA-186在胃癌組織及胃癌細胞株中的表達水平（a：在胃癌組織與正常胃黏膜組織中的表達水平比較；b：在不同胃癌細胞株與正常胃黏膜上皮細胞株GES-1中的表達水平比較）

由圖1可見，miRNA-186在胃癌組織中的表達水平明顯低于在正常胃黏膜組織中的表達水平 [（0.0013± 0.0002）vs（0.0066±0.0008），P＜0.05]；miRNA-186在胃癌細胞株BGC-803、MKN-45、7901、MKN-28、BGC-823、AGS中的表達水平均低于在正常胃黏膜上皮細胞株GES-1中的表達水平（均P＜0.05），且不同胃癌細胞株間兩兩比較，miRNA-186在胃癌細胞株7901中相對高表達（均P＜0.05），而在胃癌細胞株MKN-28中相對低表達（均P＜0.05）。

2.2 miRNA-186對胃癌7901、MKN-28細胞侵襲、遷移能力的影響 見圖2。

由圖2可見，與陰性對照相比，胃癌7901細胞轉(zhuǎn)染miRNA-186 inhibitor后侵襲、遷移能力均顯著增強，即每視野穿膜細胞數(shù)均顯著增加（均P＜0.05）；胃癌MKN-28細胞轉(zhuǎn)染miRNA-186 mimics后侵襲、遷移能力均顯著減弱，即每視野穿膜細胞數(shù)均顯著減少（均P＜0.05）。

2.3 miRNA-186靶基因預(yù)測與驗證 見圖3。

由圖3可見，生物信息學(xué)軟件預(yù)測到在Twist-1的3’-UTR區(qū)有1個miRNA-186的結(jié)合位點。Western blot結(jié)果顯示胃癌細胞中上調(diào)miRNA-186的表達能夠顯著抑制Twist-1的表達（P＜0.05），當(dāng)抑制miRNA-186的表達時可上調(diào)的Twist-1（P＜0.05）。雙熒光素酶試驗結(jié)果顯示W(wǎng)T組中的熒光素酶活性明顯低于NC組（P＜0.05）；而MUT組的熒光素酶活值與NC組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

同時Western blot結(jié)果顯示，在胃癌7901細胞中，轉(zhuǎn)染miRNA-186 inhibitor下調(diào)miRNA-186表達后，上皮類標(biāo)志物E-cadherin表達顯著下調(diào)（P＜0.05），而間質(zhì)類標(biāo)志物N-cadherin顯著上調(diào)（P＜0.05）。與此相反，在胃癌MKN-28細胞中上調(diào)miRNA-186的表達，N-cadherin的表達下調(diào)（P＜0.05），E-cadherin的表達上調(diào)（P＜0.05）。

圖2 miRNA-186對胃癌7901、MKN-28細胞侵襲、遷移能力的影響（a：7901細胞；b：MKN-28細胞）

圖3 miRNA-186靶基因預(yù)測與驗證（a：miRNA-186靶基因結(jié)合位點及野生型，突變型載體構(gòu)建示意圖；b：雙熒光素酶試驗結(jié)果；c：Western blot結(jié)果）

3 討論

新近研究顯示,miRNA-186在多種腫瘤組織中表達降低，如肺癌、前列腺癌、膀胱癌和腸癌等[10-12,14]。在肺癌中，miRNA-186的表達降低，通過影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移能力促進肺癌的進展和獲得差的預(yù)后[12]。在膀胱癌細胞中外源性上調(diào)其表達后，miRNA-186通過靶向調(diào)控PPM1B基因，將阻滯于細胞G1～S期，從而抑制細胞的增殖[10]。雖然，miRNA-186在大多數(shù)腫瘤中低表達，呈現(xiàn)出抑癌基因的功能，但Goeppert等[15]和Myatt等[16]的研究結(jié)果顯示，在肝癌和子宮內(nèi)膜癌中，miRNA-186分別通過抑制抑癌基因AKAP12和FOXO1的表達促進腫瘤的進展，呈現(xiàn)出癌基因的活性。本研究結(jié)果顯示，與在正常胃黏膜組織中相比，miRNA-186在胃癌組織中的表達顯著降低；下調(diào)miRNA-186的表達能夠顯著增強胃癌細胞的侵襲、遷移能力，而上調(diào)其表達能夠抑制胃癌細胞的侵襲、遷移能力。這提示miRNA-186在胃癌中呈現(xiàn)抑癌基因的功能。通過生物信息數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)Twist-1可能為miRNA-186的1個靶基因。

Twist-1是1個包含堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域和氨基酸基序的轉(zhuǎn)錄因子，與肌肉、軟骨、成骨等細胞的分化有關(guān)，其主要功能是調(diào)節(jié)原腸胚形成和中胚葉發(fā)育，提示其在胚胎發(fā)育和分化過程中發(fā)揮極其重要的作用。此外，Twist-1在調(diào)節(jié)程序性細胞死亡、炎癥過程、形態(tài)發(fā)生及細胞遷移中同樣具有重要意義[17-18]。近年來，大量的研究結(jié)果顯示表明，Twist-1除了在上述過程中的發(fā)揮重要作用外，還參與到腫瘤的起始與擴增、腫瘤微環(huán)境調(diào)控、干細胞樣細胞的形成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等[19]。目前，Twist-1與腫瘤關(guān)系的研究主要集中在其潛在的具有調(diào)節(jié)癌細胞轉(zhuǎn)移能力和炎癥調(diào)節(jié)作用這兩個方面。Pham等[20]發(fā)現(xiàn)，Twist-1是抑制細胞免疫和體液免疫的關(guān)鍵因子，它能夠通過影響轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Runx3和STAT4的活性從而降低Th1細胞產(chǎn)生IFN-γ。與此同時，該研究還發(fā)現(xiàn)Twist-1能夠通過抑制IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而抑制STAT3活化及IL-6反應(yīng)性，進而抑制濾泡輔助性T細胞和輔助性T細胞17的發(fā)育,從而造成腫瘤細胞的免疫逃逸。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮型癌細胞轉(zhuǎn)化成具有遷移能力的間質(zhì)型癌細胞的過程，在此過程中，最具有特征性的變化就是腫瘤細胞上皮極性和分化標(biāo)記物（如E-cadherin）的缺失、間質(zhì)標(biāo)記物（如N-cadherin）的獲得。腫瘤細胞獲得間質(zhì)表型后，具有從原位遷出的能力，使其與基質(zhì)細胞相互作用，浸潤?quán)徑M織，侵入淋巴系統(tǒng)或血液循環(huán)并定植于其他部位，形成轉(zhuǎn)移灶。Twist-1是腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子，Yang等[21]發(fā)現(xiàn)，Twist-1可以直接與E-cadherin啟動子區(qū)的E盒片段進行結(jié)合，從而抑制其表達。與此同時，鈣粘蛋白家族另一成員N-cadherin也被證實是Twist1的直接靶標(biāo)[22]，雖然 Twist-1對其作用方式與前者類似，但效果卻是相反的。本研究發(fā)現(xiàn)Twist-1 3’UTR區(qū)存在與miRNA-186相結(jié)合的結(jié)合位點，利用構(gòu)建野生型和突變型雙熒光素酶報告載體和Western blot試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-186能夠直接靶向負調(diào)控Twist-1的表達。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在胃癌細胞中，下調(diào)miRNA-186的表達，能夠促進胃癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，即E-cadherin表達下調(diào)和N-cadherin表達的上調(diào)。

綜上所述，miRNA-186在胃癌組織中表達水平降低，進而顯著促進胃癌細胞的侵襲、遷移能力。此促進作用可能與miRNA-186靶向負調(diào)控Twist-1表達，下調(diào)E-cadherin和上調(diào)N-cadherin表達，進而促進腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變有關(guān)。本研究可能有助于臨床對miRNA-186促胃癌轉(zhuǎn)移的作用機制的了解，研發(fā)新的胃癌治療靶點。

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miRNA-186 promotes invasion and migration of gastric cancer cells by targeting Twist-1

XU Ji,HE Xujun,YE Zaiyuan,et al.Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035,China

Objective To investigate the effects of miRNA-186 on invasion and migration of gastric cancer cells and its possible mechanism. Methods The expression of miRNA-186 in gastric cancer tissue and gastric cancer cell line was detected by qPCR method.A mimic or an inhibitor of miRNA-186 was transfected into the gastric cancer MKN-28 and 7901 cells, respectively and the migration and invasion capacity of transfected cells were investigated using Transwell assays.The target genes of miRNA-186 and corresponding molecules were predicted according to miRBase Targets,TargetScan Release 5.0 and PicTar databases,and indentified by dual luciferase reporter assay and Western-blot assay. Results Among 40 gastric cancer tissue samples and 6 gastric cancer cell lines,the miRNA-186 expression levels were significant decreased compared with normal gastric tissue or cell lines.Transwell assay results indicated that inhibitor the expression of miRNA-186 in 7901 cells by transfecting the miRNA-186 inhibitors,the migration and invasion capacity of the cells was significantly increased,but that in MKN-28 cells transfected with miRNA-186 mimics was significantly decreases.Target gene prediction database and dual luciferase reporter assay indentified that Twist-1 was the target gene of miRNA-186.Western blot showed that the Twist-1 expression level was significantly increased,the cancer epithelial-mesenchymal transformation (EMT)markers E-cadherin was decreased,and the N-cadherin was increased when the expression of miRNA-186 was decreased in transfected 7901 cells.The contrast results were observed when the expression of miRNA-186 was increase in transfected MKN-28 cells. Conclusion MiRNA-186 is down-regulated in gastric cancer tissues,it may promote migration and invasion of gastric cancer cells by targeting Twist-1 and inducing EMT.

Gastric cancermiRNA-186 Twist-1 Invasion Migration

2016-07-20）

（本文編輯：李媚）

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目（2015C33153）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金項目（2013KYBO17）

325035 溫州醫(yī)科大學(xué)（徐繼、葉再元，徐繼系在職研究生，現(xiàn)在浙江省人民醫(yī)院胃腸胰外科工作）；浙江省胃腸病重點實驗室（何徐軍）；浙江省人民醫(yī)院手術(shù)室（喻曉芬）

葉再元，E-mail:xuji120@163.com