板栗愈傷組織誘導(dǎo)及外植體褐化研究

劉杜玲，呂平會(huì)，彭少兵，楊 艷，何佳林

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

板栗愈傷組織誘導(dǎo)及外植體褐化研究

劉杜玲，呂平會(huì)，彭少兵，楊 艷，何佳林

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

以‘泰山1號(hào)’板栗新梢莖段為試材，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和單因素試驗(yàn)法，研究了不同培養(yǎng)基、消毒時(shí)間、外植體、激素、蔗糖含量、抗氧化劑及光照條件對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及外植體褐化的影響。結(jié)果表明：‘泰山1號(hào)’板栗愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是WPM培養(yǎng)基；用0.1%HgCl2消毒13～15 min，外植體褐化率明顯降低；以莖段（帶頂芽）為外植體，蔗糖濃度為30 g·L-1，愈傷組織誘導(dǎo)率最高；愈傷組織誘導(dǎo)最佳激素組合為：6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1；100 mg·L-1VC和6 g·L-1PVP能有效抑制外植體褐化；先暗培養(yǎng)兩周再進(jìn)行光培養(yǎng)，可顯著降低外植體褐化率。

板栗；愈傷組織誘導(dǎo)；外植體褐化；培養(yǎng)基篩選

板 栗Castanea mollissimaBl.是我國(guó)三大木本糧食樹種之一。其堅(jiān)果營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，富含淀粉、糖、蛋白質(zhì)、脂肪及多種維生素和礦物質(zhì)，甘甜可口，并具有保健功效[1]。泰山1 號(hào)板栗具有早熟、個(gè)大、豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、較耐貯藏、抗逆性強(qiáng)和適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，已在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益[2]。但傳統(tǒng)的繁殖方法繁殖系數(shù)低，育苗速度慢，滿足不了板栗生產(chǎn)對(duì)優(yōu)質(zhì)苗木的大量需求，制約了板栗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。組織培養(yǎng)是經(jīng)濟(jì)林樹種繁殖的主要方式[3]，是苗木規(guī)模化、良種化、工廠化的重要途徑。然而在板栗組培過(guò)程中，愈傷組織誘導(dǎo)和外植體褐變是板栗組織培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵，這方面的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道較多。Xing等[4]以美洲板栗不同基因型的成年樹和一年生苗木為試材，在改良后的MS培養(yǎng)基中添加500 mg·L-1PVP，莖尖褐化壞死率低于23%。羅麗華等[5]的研究表明，在WPM培養(yǎng)基中加入VC（抗壞血酸)）100 mg·L-1、適當(dāng)?shù)墓庹占拜^低的溫度有利于減輕褐變。Yang等[6]的研究表明，在培養(yǎng)基中添加2, 4, 5-T對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳。蘇冬梅等[7]和陳建華等[8]的研究表明，培養(yǎng)基為WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1、外植體為胚，其愈傷組織誘導(dǎo)率最高，其次為莖段。本研究以‘泰山1號(hào)’板栗新梢莖段為外植體，采用正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)法，研究了不同培養(yǎng)基、消毒時(shí)間、外植體、激素配比、抗氧化劑、蔗糖含量及光照條件對(duì)外植體褐化及愈傷組織誘導(dǎo)的影響，旨在篩選對(duì)板栗愈傷組織誘導(dǎo)、抑制外植體褐變的最佳處理，為‘泰山1號(hào)’板栗無(wú)菌培養(yǎng)系建立提供依據(jù)，為板栗再生體系的建立與種質(zhì)創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為8年生板栗良種‘泰山1號(hào)’，于2015年5月4日在寶雞市陳倉(cāng)區(qū)坪頭鎮(zhèn)安坪村板栗良種生產(chǎn)基地采取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害的新梢。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)和單因素試驗(yàn)法，研究不同培養(yǎng)基、消毒時(shí)間、外植體、激素配比、抗氧化劑、蔗糖含量及光照條件對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及外植體褐化的影響。培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)采用WPM、MS、DKW培養(yǎng)基，其余試驗(yàn)均采用WPM培養(yǎng)基。培養(yǎng)基均添加蔗糖 30 g·L-1、6-BA1.0 mg·L-1、NAA0.2 mg·L-1、瓊脂 8 g·L-1，pH 值為 5.8（除激素配比試驗(yàn)外）。各試驗(yàn)處理均接種40個(gè)外植體，重復(fù)2次；激素配比試驗(yàn)每處理30個(gè)樣本，重復(fù)3次。培養(yǎng)室溫度(20±2) ℃，光照時(shí)間12 h /d，光照強(qiáng)度1 800～2 000 lx，接種后先暗培養(yǎng)2周再進(jìn)行光培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料消毒處理

外植體消毒參照郭素娟等[9]的方法，將已消毒的‘泰山1號(hào)’嫩梢基部及上部葉片和頂芽除去，切割成長(zhǎng)0.5 cm左右?guī)в幸秆康男《?，葉片切割成0.5 cm2的小塊，接種于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上（試驗(yàn)處理均以帶腋芽莖段為外植體，除不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)外）。

1.3.2 培養(yǎng)基篩選

將已滅菌的外植體分別接種在WPM、MS、DKW培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15 d后觀察外植體褐化及愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.3.3 外植體消毒時(shí)間比較

將新梢用0.1% HgCl2消毒處理10～12 min、13～ 15 min、16～ 18 min、19～21 min，接種4 d后觀察統(tǒng)計(jì)外植體的褐化率及存活率。

1.3.4 外植體篩選

以帶腋芽莖段、帶頂芽莖段和葉片為外植體，接種于WPM培養(yǎng)基，15 d后觀察外植體褐化及愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.3.5 激素配比試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)，在基本培養(yǎng)基（WPM）中添加不同濃度的NAA（0、0.1、0.2 mg·L-1）和 6-BA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1）， 以 不添加為對(duì)照（CK），接種20 d后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.3.6 蔗糖誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)

在培養(yǎng)基中添加不同濃度（20、30、40 g·L-1）蔗糖，以不添加為對(duì)照（CK），接種20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.3.7 抗氧化劑試驗(yàn)

在培養(yǎng)基中添加不同濃度的PVP（聚乙烯毗咯烷酮）（0、2、4、6 g·L-1）和VC（抗壞血酸）（0、100、150、200 mg·L-1），以不添加為對(duì)照（CK），接種20 d～25 d后統(tǒng)計(jì)外植體褐化率。

1.3.8 光照處理試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)光培養(yǎng)、暗培養(yǎng)14 d后再光培養(yǎng)兩個(gè)處理。光強(qiáng)為2 000 Lx、光照時(shí)數(shù)為12 h/d，20 d后觀察統(tǒng)計(jì)外植體褐化及愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

愈傷組織誘導(dǎo)率(%) = (形成愈傷組織的外植體數(shù)/ 接種外植體數(shù)) ×100%；外植體褐化率(%)= (外植體褐化數(shù)/接種外植體數(shù)) × 100%。用Excel 2015進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS21.0進(jìn)行方差分析，Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對(duì)外植體褐化和愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表1知，將外植體接種于MS、DKW、WPM 3種培養(yǎng)基后，外植體啟動(dòng)時(shí)間相近，初次褐化時(shí)間也相近；MS培養(yǎng)基外植體褐化率（80%）和DKW培養(yǎng)基外植體褐化率（83%）相近，都略高于WPM培養(yǎng)基的褐化率（71.6%）；愈傷組織誘導(dǎo)率最高（10.1%）的是WPM培養(yǎng)基。方差分析結(jié)果表明，3種培養(yǎng)基之間外植體褐化時(shí)間差異不顯著（P＞0.05），外植體褐化率及愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著（P＜0.05）。經(jīng)Duncan分析知，WPM與MS、DKW之間外植體褐化率、愈傷組織誘導(dǎo)率差異均顯著，但MS與DKW之間差異不顯著。故‘泰山1號(hào)’板栗組織培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基為WPM。

表1 培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和外植體褐化的影響?Table 1 Effects of different culture medium on callus induction and explant browning

2.2 消毒時(shí)間對(duì)外植體褐化率及存活率的影響

由表2可知，隨消毒時(shí)間延長(zhǎng)，外植體褐化率、存活率降低。消毒10～12 min褐化率55.0%；消毒13～15 min褐化率為35.0%，較10～12 min褐化率下降20%；消毒16～18 min、19～21 min褐化率降為30.0%。消毒13～15 min外植體存活率為45.0%；消毒16～18 min外植體存活率為30.0%，較13～15 min下降15%。方差分析表明，消毒13～15 min外植體褐化率與消毒10～12 min差異顯著（P＜0.05），與消毒16～18 min差異不顯著（P＞0.05），但存活率差異顯著（P＜0.05）。故外植體消毒以13～15 min為好，褐化率較低（35.0%）且存活率達(dá)45.0%。

表2 消毒時(shí)間對(duì)外植體褐化率及存活率的影響Table 2 Effects of different sterilization time on the browning rate and survival rate of explants

2.3 不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果見表3。由表3知，帶頂芽莖段褐變程度較輕（淺褐色），其愈傷組織誘導(dǎo)率最高（43.3%），產(chǎn)生量也大；帶腋芽莖段誘導(dǎo)率次之（23.3%）；葉片的誘導(dǎo)率最差（0.0%）。方差分析結(jié)果顯示，不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率有極顯著的影響（P＜0.01）。

2.4 激素種類及濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

NAA和6-BA對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果見表4。由各因素（6-BA、NAA、CK）的極差（R）知，6-BA的極差最大（17.2），NAA次之（13.8），對(duì)照最小（5.6），故影響板栗愈傷組織誘導(dǎo)的主次因素為：6-BA＞NAA＞CK，即6-BA對(duì)于愈傷組織誘導(dǎo)作用最大。由愈傷組織誘導(dǎo)率的平均值知，NAA的3水平愈傷組織誘導(dǎo)率最高（61.6%），6-BA的2水平愈傷組織誘導(dǎo)率最高（67.2%）。由各因素不同水平對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響及正交試驗(yàn)方差分析（表5）知，6-BA和NAA各水平間差異顯著（P＜0.05）。經(jīng)多重比較知，6-BA的2水平與1、3水平差異顯著，愈傷組織誘導(dǎo)率比1水平和3水平約高17%；NAA的1水平和3水平差異不顯著，但均與2水平差異顯著。經(jīng)綜合分析，板栗愈傷組織誘導(dǎo)最佳激素組合為：NAA 0.2 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1。X1、X2、X3分別為各因素水平的平均值；R為極差。

表3 不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響?Table 3 Effects of different explants on callus induction

表4 激素種類及濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 4 Effects of hormone kinds and concentration on callus induction

表5 NAA和6-BA不同水平對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 5 Effects of different levels of NAA and 6-BA on callus induction

2.5 蔗糖含量對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表6知，添加蔗糖與不添加蔗糖（對(duì)照）、不同蔗糖含量愈傷組織誘導(dǎo)率均高于對(duì)照，且與對(duì)照差異極顯著（P＜0.01）；蔗糖含量為30 g·L-1時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高（13.3%）。多重比較結(jié)果顯示，蔗糖含量30 g·L-1與20 g·L-1之間愈傷組織誘導(dǎo)率差異極顯著，30 g·L-1與 40 g·L-1之間差異不顯著。故在培養(yǎng)基中添加30 g·L-1蔗糖對(duì)莖段愈傷組織的誘導(dǎo)效果最佳。

表6 蔗糖含量對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 6 Effects of sucrose content on callus induction

2.6 抗氧化劑對(duì)外植體褐化率的影響

在培養(yǎng)基中添加不同濃度的抗壞血酸（VC）及聚乙烯吡喏烷酮（PVP）后，外植體褐變率均低于對(duì)照，且與對(duì)照差異顯著（表7）。當(dāng)加入VC 100 mg·L-1后，外植體褐化率最低（53.8%）。方差分析結(jié)果表明，不同濃度VC對(duì)外植體褐化的影響差異極顯著（P＜0.01）。進(jìn)行多重比較知，添加VC后外植體褐化率（53.8%～65.2%）顯著低于對(duì)照（80.0%）；添加 100 mg·L-1VC 與添加 50 mg·L-1、150 mg·L-1VC之間外植體褐化率差異極顯著，但50 mg·L-1與 150 mg·L-1之間差異不顯著?？梢姡琕C為100 mg·L-1時(shí)抑制外植體褐化效果明顯。

表7 抗氧化劑對(duì)外植體褐化的影響Table 7 Effects of antioxidants on the browning of explants

由表7還可知，在培養(yǎng)基中加入PVP 6 g·L-1后，外植體褐化率最低（64.6%）。進(jìn)行多重比較可知，6 g·L-1與 2 g·L-1、4 g·L-1之間外植體褐變率差異極顯著，2 g·L-1與4 g·L-1之間外植體褐變率差異不顯著。故在培養(yǎng)基中添加PVP 6 g·L-1對(duì)外植體褐化有明顯的抑制作用。

2.7 光照條件對(duì)外植體褐化及愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同光照處理對(duì)外植體褐化和愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表8。由表8知，對(duì)接種后的培養(yǎng)基進(jìn)行“暗培養(yǎng)+全光照”處理后，外植體褐化率（51.67%）低于全光照處理（63.67%），且愈傷組織誘導(dǎo)率（17.54%）高于全光照處理（11.32%）。方差分析結(jié)果顯示，光照條件對(duì)外植體褐化率的影響差異極顯著（P＜0.01），對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響差異不顯著（P＞0.05）。因此在板栗組培時(shí)，先暗培養(yǎng)14 d再進(jìn)行光培養(yǎng)可以降低外植體的褐變率，且愈傷組織誘導(dǎo)率較高。

表8 光照條件對(duì)外植體褐化及愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 8 Effects of light conditions on the browning of explants and callus induction

3 結(jié)論與討論

基本培養(yǎng)基提供了植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)元素，由于各種植物組織培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求不同，因此對(duì)基本培養(yǎng)基的優(yōu)化和篩選顯得尤為重要[10-11]。本研究將外植體接種于MS、DKW、WPM 3種培養(yǎng)基上，研究不同培養(yǎng)基對(duì)外植體褐化和愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，WPM培養(yǎng)基的褐化率最低，愈傷組織誘導(dǎo)率最高。這與蘇冬梅等[7]、陳建華等[8]、徐晨等[12]在板栗組培上的研究結(jié)果一致，但與孫小兵[1]的研究結(jié)果不一致。

外植體消毒獲得無(wú)菌材料是決定植物組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。本研究表明，外植體用0.1%HgCl2消毒13～15 min，褐化率較低而存活率最高，這與袁云香[13]在枇杷葉莢蒾上的研究結(jié)果基本一致。但與馮金玲等[14]、周新華等[15]和陳容等[16]的研究結(jié)果不盡一致，這可能是由于消毒劑濃度、試驗(yàn)材料或消毒方式不同所致。

一般認(rèn)為外植體來(lái)源不同，其愈傷組織誘導(dǎo)率存在一定差異。本研究將‘泰山1號(hào)’帶腋芽莖段、帶頂芽莖段、葉片接種于培養(yǎng)基后，發(fā)現(xiàn)帶頂芽莖段褐變程度較輕，其愈傷組織誘導(dǎo)率最高，產(chǎn)生量也大。這主要是由于頂芽莖段幼嫩，木質(zhì)化程度低，其細(xì)胞再生能力強(qiáng)，故褐化率低。這一結(jié)果與蘇冬梅等[7]在板栗、胡愛雙等[3]在平歐雜種榛、劉建軍等[17]在銀杏上的研究結(jié)果一致。

在愈傷組織誘導(dǎo)的諸因素中，激素種類及其濃度配比是影響板栗愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的主要因素。本研究表明，板栗愈傷組織誘導(dǎo)的最佳激素組合為：NAA 0.2 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1。這與蘇冬梅等[7]在板栗、郭彥彤等[18]在柚木上的研究結(jié)果基本一致。

在植物組織培養(yǎng)中，糖的用量影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)量，是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素之一。本研究表明，在WPM+6-BA1.0 mg·L-1NAA0.2 mg·L-1中添加 30 g·L-1的蔗糖對(duì)莖段愈傷組織的誘導(dǎo)效果最佳，該結(jié)果與白芝蘭等[19]在野生毛桃、孫源蔚等[20]在中國(guó)李上的研究結(jié)果一致。

防止外植體褐變死亡是板栗組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。有研究表明，在培養(yǎng)基中加入吸附劑與抗氧化劑可以減輕褐變[21]。本研究表明，分別在 培養(yǎng) 基 WPM+6-BA1.0 mg·L-1NAA0.2 mg·L-1中添加不同濃度的抗壞血酸（VC）及聚乙烯吡喏烷酮（PVP）吸附劑后，外植體褐變率顯著降低，這與羅麗華[7]的研究結(jié)果一致，但與張建瑛等[22]在核桃楸上的研究結(jié)果不一致，這可能是因植物種類、培養(yǎng)基種類不同所致。

光照時(shí)間不同對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)及外植體褐變的影響存在差異，暗培養(yǎng)有利于減輕褐變及愈傷組織的形成，而全光照下褐變程度加重[23]。本研究表明，對(duì)接種后的培養(yǎng)基先暗培養(yǎng)兩周再進(jìn)行光培養(yǎng)，可以顯著降低外植體的褐化率，且愈傷組織誘導(dǎo)率較高。說(shuō)明全光照既加重了外植體的褐化程度，又不利于愈傷組織的形成。該結(jié)果與張建瑛等[22]在核桃楸、羅麗華等[23]在板栗上的研究結(jié)果一致。

本研究?jī)H對(duì)板栗愈傷組織誘導(dǎo)及外植體褐化進(jìn)行了初步研究，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)均采用單因素（除激素種類及濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響外）試驗(yàn)，且涉及的因素及水平較少。在今后的研究中應(yīng)增加試驗(yàn)因素及各因素的水平，優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步綜合深入研究誘導(dǎo)板栗愈傷組織及遏制外植體褐化的最佳培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，為板栗無(wú)菌培養(yǎng)系的建立提供依據(jù)。

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Research on callus induction and explant browning of chestnut(Castanea mollissima Bl.)

LIU Du-ling, LV Ping-hui, PENG Shao-bing, YANG Yan, HE Jia-lin
(College of Forestry, Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi, China)

The ‘Taishan 1’ stem segment were used as test materials to study the effects of different medium, sterilization time, explants,hormone, sucrose content, antioxidant and light conditions on callus induction and browning of explants by orthogonal test design and single factor test method. The results show that the best medium for callus induction of ‘Taishan 1’ was WPM medium; the browning rate of explants was signi fi cantly decreased by 0.1% HgCl2solution for 13～15 min; the rate of callus induction was highest when stem segment(with bud) was used as explant and sucrose concentration was 30 g·L-1; the best hormone combination for callus induction screened out by orthogonal test was 6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1; 100 mg·L-1VC and 6 g·L-1PVP effectively inhibited the browning of explants; the browning rate of explants was signi fi cantly decreased by two weeks in dark condition then turned to light condition.

chestnut; callus inducement; explant browning; culture medium selection

S722.3+7

A

1673-923X(2016)12-0026-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.12.005

http: //qks.csuft.edu.cn

2015-12-18

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD14B0404）

劉杜玲，副教授，碩士生導(dǎo)師

何佳林，副研究員； E-mail：hejialinhjl@126.com

劉杜玲，呂平會(huì)，彭少兵，等. 板栗愈傷組織誘導(dǎo)及外植體褐化研究 [J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2016, 36(12): 26-30.

[本文編校：文鳳鳴]