羥基磷灰石聚合物載生長因子的研究現(xiàn)狀△

齊軍強(qiáng)，王浩田，葉曉健，許國華*

（1.海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院，上海 200001；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院，上海 200336）

隨著骨損傷或骨缺損增加，骨組織工程受到了極大的關(guān)注。理想的骨修復(fù)方案是開發(fā)一種具有良好生物活性和機(jī)械性能的生物材料，以保持組織功能［1］。目前，骨修復(fù)材料主要依賴于生物陶瓷和聚合物［2］。羥基磷灰石（hydroxyapatite,HA）具有良好生物活性和相容性，常被用于骨修復(fù)［3，4］。然而，HA 具有高脆性、無法控制的降解速度等缺點(diǎn)。聚合物具有良好的相容性、韌性和降解性，與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性類似，和HA 復(fù)合后的材料具有與天然骨相匹配的機(jī)械性能、可控的降解速度及優(yōu)異的生物活性，因此，HA/聚合物復(fù)合材料得到了廣泛研究［3，5，6］。

在骨重塑和愈合過程中，許多生長因子參與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化、成熟。骨是一種高度礦化和血管化的組織，成骨和成血管對于骨修復(fù)是必不可少的，因此，負(fù)載生長因子的骨修復(fù)材料得到了廣泛的研究［7，8］。本文對各種HA/聚合物復(fù)合材料作為生長因子載體用于骨修復(fù)的最新研究進(jìn)行綜述。

1 載單因子HA/聚合物復(fù)合材料

1.1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic proteins-2,BMP-2）是一種在骨發(fā)生、骨誘導(dǎo)、骨修復(fù)方面發(fā)揮重要作用的生長因子，可通過Smad1/5/8 信號通路上調(diào)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨鈣蛋白（osteocalcin,OCN） 和骨橋蛋白（osteopontin,OPN）的表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）和成骨細(xì)胞的分化。美國食品和藥物管理局已于2002 年11 月批準(zhǔn)其臨床使用［9，10］。

由于BMP-2 半衰期短、消失快，靶向緩釋可以減少骨誘導(dǎo)所需的BMP-2 劑量，同時(shí)避免大劑量BMP-2 帶來的副作用。Mohammadi 等［11］制備了負(fù)載BMP-2 的HA-可降解聚左乳酸復(fù)合材料，可實(shí)現(xiàn)BMP-2 體外緩釋21 d，皮下異位成骨實(shí)驗(yàn)證實(shí)載BMP-2 的材料比未負(fù)載BMP-2 的材料更能增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）的聚集和初級骨化中心形成。Linh 等［12］通過膠原涂層和BMP-2 偶聯(lián)對HA 支架表面進(jìn)行改性，支架可實(shí)現(xiàn)BMP-2 持續(xù)緩釋，同時(shí)顯著提高了脂肪干細(xì)胞成骨分化能力，具有良好的促分化能力。Zhao 等［13］通過聚多巴胺涂層將BMP-2 負(fù)載于聚乳酸-羥基乙酸/HA 支架上，可實(shí)現(xiàn)BMP-2 的緩釋。支架可模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)顯著促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞的黏附和增殖，使MC3T3-E1 細(xì)胞的ALP 活性、成骨相關(guān)基因mRNA 表達(dá)和鈣沉積均顯著增加。劉勇等［14］將BMP-2 負(fù)載于聚多巴胺涂層的絲素蛋白/HA，與BMSCs 共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與絲素蛋白/HA、絲素蛋白/HA/聚多巴胺支架相比，絲素蛋白/HA/聚多巴胺/BMP-2 支架上細(xì)胞數(shù)量最多，增殖能力最強(qiáng)，ALP 活性最高，成骨誘導(dǎo)能力顯著高于其他兩組支架。Bal等［15，16］發(fā)現(xiàn)BMP-2 在聚乳酸-聚乙二醇/HA 復(fù)合材料中可緩釋25 d。載不同劑量BMP-2［0 μg（對照）、3 μg（低劑量）、10 μg（高劑量）］的聚乳酸-聚乙二醇/HA 復(fù)合材料促進(jìn)大鼠脊柱融合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，術(shù)后8 周μCT、手動(dòng)觸診試驗(yàn)和組織學(xué)均顯示低、高劑量組91.6%（11/12）的標(biāo)本呈骨性融合，證實(shí)低劑量BMP-2 負(fù)載于聚乳酸-聚乙二醇/HA 復(fù)合材料可實(shí)現(xiàn)BMP-2 緩釋，提高骨修復(fù)效果。Lee 等［17］開發(fā)了一種載BMP-2 和阿倫磷酸鈉的序貫給藥復(fù)合支架，BMP-2 通過激活成骨細(xì)胞促進(jìn)成骨，而阿倫磷酸鈉抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，兩者可協(xié)同促進(jìn)骨再生。Chao 等［18］研究低劑量BMP-2 聯(lián)合HA/β-磷酸三鈣/膠原復(fù)合物修復(fù)種植體周圍臨界尺寸缺陷發(fā)現(xiàn)，含0.2 mg/ml BMP-2 的HA/β-磷酸三鈣/膠原復(fù)合物具有較強(qiáng)的成骨能力，可修復(fù)比格犬牙槽骨置入物周圍的缺損，穩(wěn)定置入物。

BMP-2 的使用劑量過低不能誘導(dǎo)骨缺損愈合，劑量過高則會(huì)導(dǎo)致囊腫樣骨形成和明顯的軟組織腫脹［19］，同時(shí)各種復(fù)合材料對BMP-2 的緩釋效果存在差異，所以應(yīng)根據(jù)具體的復(fù)合材料選擇合適的BMP-2 負(fù)載劑量，使得材料能誘導(dǎo)骨形成修復(fù)缺損而無不良并發(fā)癥出現(xiàn)。

1.2 血管內(nèi)皮生長因子

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是最重要的血管生長因子之一，主要作用是誘導(dǎo)新生血管形成。此外，VEGF 具有間接促進(jìn)MSCs 分化為成骨細(xì)胞的能力［20］。血管新生是早期骨修復(fù)的重要環(huán)節(jié)，支架復(fù)合VEGF 可有效地提高成骨效能［21］。因此VEGF 在骨組織工程中越來越受到重視。

Knaack 等［22］發(fā)現(xiàn)肝素修飾的膠原蛋白/HA 多孔支架可仿生骨基質(zhì)，能可控釋放VEGF，刺激血管形成，促進(jìn)骨再生。Quinlan 等［23］將包裹VEGF 的海藻酸鹽微粒整合到膠原-HA 支架，可持續(xù)釋放VEGF長達(dá)35 d。當(dāng)復(fù)合支架置入大鼠顱骨缺損處，與空白組和無VEGF 的支架相比，缺損區(qū)新生血管增多，骨組織也/明顯增加，說明增強(qiáng)的骨生成與血管生成相關(guān)。Liu 等［24］采用選擇性激光燒結(jié)技術(shù)和共沉淀法制備的多孔聚己內(nèi)酯/HA/VEGF 支架具有良好的細(xì)胞相容性和生物活性，可顯著促進(jìn)大鼠皮下新生血管的形成，增強(qiáng)大鼠顱骨缺損處的骨再生。Chen 等［25］發(fā)現(xiàn)VEGF 涂層的HA/磷酸鈣/聚己內(nèi)酯支架可顯著增強(qiáng)人MSCs 和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管生成因子（血管性血友病因子和血管生成素-1）和成骨相關(guān)蛋白（BMP-2、OPN 和OCN）表達(dá)。對照HA/磷酸鈣/聚己內(nèi)酯支架，VEGF 負(fù)載支架可顯著改善兔股骨缺損的骨再生，置入8 周后見明顯的血管生成、骨組織再生和礦化。Jin 等［26］發(fā)現(xiàn)與HA/VEGF/MSCs 支架和HA/MSCs 支架相比，涂有5 層膠原蛋白/肝素多層薄膜的HA/VEGF/MSCs 支架可顯著促進(jìn)內(nèi)皮分化標(biāo)志物CD31、胎肝激酶-1 和血管性血友病因子的表達(dá)，支持更多細(xì)胞的生長，且植入大鼠背部肌肉28 d 后可見更多數(shù)量的血管。劉定坤［27］制得內(nèi)部載VEGF、外層載萬古霉素的HA/海藻酸鈉/殼聚糖復(fù)合支架，HA 質(zhì)量占比為40%、海藻酸鈉/殼聚糖含量為60%的復(fù)合支架具有最佳的力學(xué)性能、孔隙率、降解率等理化性能。HA 質(zhì)量占比為60%、海藻酸鈉/殼聚糖含量為40%的復(fù)合支架具有最佳的VEGF 緩釋效果，且對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出顯著的抑菌活性，是一種性能優(yōu)異的多功能支架。

血管生成對骨組織修復(fù)具有重要意義，增強(qiáng)血管化的骨再生支架具有可行性和廣闊的應(yīng)用前景。過量的VEGF 可誘導(dǎo)大量血管生成，使血管通透性增加，繼而引起全身性低血壓和水腫［28］，因此，在構(gòu)建骨修復(fù)材料時(shí)適宜劑量的VEGF 具有重要意義。

2 載雙因子HA/聚合物復(fù)合材料

自然骨愈合是受多種生長因子調(diào)控的復(fù)雜過程，血管生成起著至關(guān)重要的作用。VEGF 雖然具有成血管-成骨作用，但單獨(dú)使用不足以高效促進(jìn)骨再生［29，30］?；赩EGF 的成血管特性和BMP-2 的成骨性能，VEGF 和BMP-2 的雙重遞送得到廣泛研究，以構(gòu)建生長因子的控制釋放與骨自然愈合過程相協(xié)調(diào)的釋放系統(tǒng)［23，24］。

Li 等［33］在兔橈骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與單純納米HA/絲素蛋白/聚己內(nèi)酯支架、單純BMP-2/VEGF 和空白對照組相比，載BMP-2/VEGF 雙因子支架組術(shù)后12 周可見明顯的板層新骨形成，骨小梁排列規(guī)則，新生骨組織內(nèi)無明顯間隙，骨缺損修復(fù)完成，BMP-2 和OCN 表達(dá)水平最高。Chen 等［34］利用殼聚糖和透明質(zhì)酸鈉逐層涂層改性HA 支架，支架的抗壓強(qiáng)度從3.5 MPa 提高到了6.0 MPa。BMP-2 和VEGF 負(fù)載于復(fù)合支架可實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放，在體外14 d可累積釋放80%，促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞生長和成骨分化。顯微CT、I 型膠原和凝集素的免疫化學(xué)染色結(jié)果表明，載BMP-2/VEGF 的復(fù)合支架具有良好的成骨和成血管能力，能很好地促進(jìn)新骨形成，修復(fù)兔臨界尺寸顱骨缺損。同樣有研究表明，負(fù)載BMP-2 和VEGF 的多孔絲素蛋白/HA 復(fù)合支架在大鼠顱骨缺損模型中對血管化和骨再生具有協(xié)同效應(yīng)［35］。生物材料控制生長因子有序釋放的特性在骨修復(fù)與再生領(lǐng)域也受到廣泛關(guān)注。Godoy-Gallardo 等［36，37］通過聚多巴胺涂層將BMP2 和VEGF 分層負(fù)載于聚已內(nèi)酯/HA支架的內(nèi)外層，VEGF 體外釋放快速，而BMP-2 的釋放更緩慢、更持久，符合骨愈合過程和骨組織工程應(yīng)用的需要。載雙因子的復(fù)合支架與BMSCs 和人內(nèi)皮祖細(xì)胞共培養(yǎng)可明顯上調(diào)成骨（OCN、ALP）和血管生成（內(nèi)皮衍生超極化因子-1、VEGF-A 和VEGF-R2）基因的表達(dá)，成骨活性顯著優(yōu)于只負(fù)載BMP2 的支架，是一種高效的骨修復(fù)材料。Dou等［38］將VEGF 和載BMP-2 的O-羧甲基殼聚糖微球負(fù)載于HA/膠原蛋白支架，成功制得載雙因子復(fù)合支架，BMP-2 體外緩釋可達(dá)21 d，而VEGF 在14 d 內(nèi)達(dá)到釋放的峰值。即VEGF 在BMP-2 之前達(dá)到了一個(gè)釋放高峰，實(shí)現(xiàn)了生長因子的順序釋放，并與人骨生長的模式一致。在正常骨愈合過程中，VEGF 表達(dá)在早期達(dá)到峰值，而BMP-2 表達(dá)在后期達(dá)到峰值。根據(jù)生長因子之間的協(xié)同和疊加效應(yīng)，VEGF 首先有效誘導(dǎo)血管生成，然后BMP-2 促進(jìn)骨形成，雙因子的順序釋放可顯著促進(jìn)骨再生。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，載雙因子支架中血管的數(shù)量和大小顯著優(yōu)于單純支架和BMP-2 負(fù)載支架。綜上所述，載VEGF 和BMP-2 的復(fù)合緩釋支架可以實(shí)現(xiàn)雙因子的順序釋放，更有效地促進(jìn)新生血管的形成和生長，增強(qiáng)支架的成骨效果，最終加速骨組織修復(fù)。納米HA/聚酰胺66 是一種具有良好生物相容性、力學(xué)性能的骨替代材料，已廣泛應(yīng)用于骨再生領(lǐng)域［39，40］。然而，有限的生物活性阻礙了其在組織工程中的進(jìn)一步應(yīng)用。Li 等［41］將BMP-2 衍生肽和VEGF 模擬肽雙重接枝到聚酰胺66聚合物鏈上，制得多肽修飾的HA/聚酰胺66 支架，BMP-2 衍生肽和VEGF 模擬肽均可持續(xù)釋放并保持生物活性，促進(jìn)BMSCs 的黏附、增殖和成骨分化及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和成血管分化。支架置入SD 大鼠股骨嚴(yán)重骨折處8 周，骨折線消失，小梁骨穿過骨折間隙連接，皮質(zhì)骨連續(xù)。載雙因子的納米HA/聚酰胺66 支架可同時(shí)促進(jìn)血管生成和成骨，為骨不連治療中促進(jìn)骨再生提供了一種有前景的方法。

載BMP-2/VEGF 的新型復(fù)合支架兼具成骨和促血管生成能力，能夠高效增強(qiáng)新骨形成，為臨床應(yīng)用中的骨修復(fù)和再生提供了潛在的解決方案。

3 小結(jié)與展望

迄今為止，HA/聚合物復(fù)合材料作為骨再生支架和生物活性分子可控緩釋載體調(diào)節(jié)骨愈合、促進(jìn)骨缺損修復(fù)取得了一定的進(jìn)展。但應(yīng)用于臨床骨修復(fù)治療還有一定的距離。如何優(yōu)化材料、制備仿生結(jié)構(gòu)、提高材料性能，如何將生長因子與載體材料高效負(fù)載，如何精準(zhǔn)控制釋放生長分子、調(diào)節(jié)信號通路，如何減少或避免不良反應(yīng)等仍然是今后需要繼續(xù)深入研究和解決的問題。骨愈合是涉及多種細(xì)胞、生物分子、調(diào)節(jié)機(jī)制的復(fù)雜過程，臨床中骨損傷或骨缺損的原因存在多樣性，因此，未來骨修復(fù)材料應(yīng)具有高度仿生結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的理化性能和生物活性，可模擬自然骨再生過程實(shí)現(xiàn)生物分子的時(shí)空遞送，同時(shí)兼?zhèn)湔{(diào)節(jié)破骨細(xì)胞、免疫細(xì)胞活性的功能。相信隨著材料學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、骨組織工程學(xué)的發(fā)展及臨床治療的需求，HA/聚合物多功能復(fù)合材料將具有廣闊的前景。