豫北地區(qū)主要淡水魚類感染嗜水氣單胞菌的流行病學調(diào)查

賀文旭，毛會麗，楊利敏，符運棟，曾 輝，關(guān)建義

( 新鄉(xiāng)醫(yī)學院 生命科學技術(shù)學院，河南 新鄉(xiāng) 453003 )

豫北地區(qū)主要淡水魚類感染嗜水氣單胞菌的流行病學調(diào)查

賀文旭，毛會麗，楊利敏，符運棟，曾 輝，關(guān)建義

( 新鄉(xiāng)醫(yī)學院 生命科學技術(shù)學院，河南 新鄉(xiāng) 453003 )

對豫北地區(qū)嗜水氣單胞菌引起的細菌性敗血病進行流行病學調(diào)查，分離鑒定致病性嗜水氣單胞菌菌株，并對致病性嗜水氣單胞菌菌株進行毒力驗證和藥敏試驗。采集4個養(yǎng)殖場病魚標本及水樣，每月進行流行病學調(diào)查，利用生理生化及分子生物學方法檢測嗜水氣單胞菌的分布狀況。結(jié)果顯示，篩選出52株為嗜水氣單胞菌，其中32株為致病性嗜水氣單胞菌，20株為非致病性嗜水氣單胞菌，且致病性嗜水氣單胞菌主要分布在7—9月份,毒力驗證試驗表明，32株致病性菌株的毒力大小差異明顯，篩選出強毒株XDMG(4)，為后期試驗的疫苗株做準備；藥敏試驗表明，不同菌株對同一種藥物的藥敏結(jié)果不同，但大部分藥物的藥敏結(jié)果基本一致，70%以上的致病性菌株對頭孢哌酮、氟本尼考、菌必治、阿米卡星等抗菌藥物表現(xiàn)為高度敏感，對青霉素類藥物表現(xiàn)為高度耐藥性，耐藥率達100%，對氨基糖苷類(不包括阿米卡星)、磺胺類、四環(huán)素等藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，具有多重耐藥性。本試驗旨在豐富本地區(qū)的魚類細菌性敗血病的病原資料，并為該菌引起的人類疾病的防控提供科學依據(jù)。

嗜水氣單胞菌；16S rDNA；藥敏試驗；細菌性敗血病

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)廣泛存在于自然界中，是一種條件致病菌，是典型的人-獸-魚共患病病原菌，其感染淡水魚類引起爆發(fā)性出血病，死亡率極高，主要癥狀表現(xiàn)為頭部、鰭條、腹部等部位充血，嚴重的眼球突出，在水面上漫游，無食欲，不久即死亡。因此引起了國內(nèi)外學者對該菌的高度關(guān)注[1-3 ]。

檢測嗜水氣單胞菌多采用傳統(tǒng)的生理生化鑒定[4-6]和免疫學方法[7-9]，但因嗜水氣單胞菌的諸多生化特征不穩(wěn)定[10]， 加之其血清型復(fù)雜[11]， 采用傳統(tǒng)方法鑒定時易發(fā)生誤判。近年來，眾多學者采用分子生物學方法完成病原菌的快速檢測[12-16]。為查明嗜水氣單胞菌對豫北地區(qū)淡水魚類的危害情況，掌握病害的流行規(guī)律、爆發(fā)條件以及發(fā)病癥狀等情況，對新鄉(xiāng)市新發(fā)養(yǎng)殖場、延津東屯糧所漁場、衛(wèi)輝市東湖養(yǎng)殖場、原陽縣黃寺漁場進行了流行病學調(diào)查和分析，針對嗜水氣單胞菌的16S rDNA和Aer基因設(shè)計兩對引物，采用雙重PCR法檢測到若干嗜水氣單胞菌，并分析其毒性及耐藥性，為掌握嗜水氣單胞菌引起的敗血癥流行性特征和探索更有效的防治方法提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

患細菌性敗血病的病魚，取自河南省豫北地區(qū)4個養(yǎng)殖場，取樣時間2009年10月至2010年10月。

嗜水氣單胞菌J-1標準株，由南京農(nóng)業(yè)大學惠贈。

銀鯽(Carassiusauratusgibelio)購自河南衛(wèi)輝市東湖水產(chǎn)養(yǎng)殖場，選取健康銀鯽100尾，每尾質(zhì)量(30±2) g，體長約14 cm，試驗前水族箱中馴養(yǎng)1周，養(yǎng)殖用水為曝氣后的自來水，水溫(28±1) ℃，試驗期間水族箱保持充氣，日投餌2次，早晚各1次，換水時間為投餌后3 h，日換水量為40%。證實無病后用于試驗。

1.2 主要儀器及試劑

Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Markers購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；

16S rDNA上下游引物、Aer上下游引物購自上海生物工程有限公司；糖發(fā)酵試劑盒、氧化酶試劑盒、藥敏紙片購自杭州天和微生物制劑有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。配制LB營養(yǎng)肉湯、LB瓊脂平板、脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板、滅菌堿性蛋白胨水、草酸銨結(jié)晶紫染液、革蘭氏碘液、復(fù)紅酒精染液。

1.3 方法

1.3.1 細菌性敗血病流行性調(diào)查

2009年10月—2010年10月，分別在新鄉(xiāng)市新發(fā)養(yǎng)殖場、延津縣東屯糧所漁場、衛(wèi)輝市東湖養(yǎng)殖場、原陽縣黃寺漁場進行細菌性敗血病流行病學調(diào)查。填寫水產(chǎn)動物流行病學調(diào)查表(表1)。

表1 流行病調(diào)查

注：1.命名規(guī)則：新鄉(xiāng)填X，樣本采樣次數(shù)①②③④⑤，水樣(W)，魚種(鯽魚J、鯉魚Li、鰱魚L、草魚C、麥穗魚M)，器官(肝 G 脾 P 腎 Sh 鰓 S).2.新發(fā)養(yǎng)殖場魚塘來源填A(yù)， 延津東屯糧所漁場來源填B，衛(wèi)輝市東湖漁場來源填D，原陽黃寺漁場來源填E.粗體標示的為致病性菌株，其他為非致病性菌株.

1.3.2 嗜水氣單胞菌的分離

1.3.2.1 病原菌的分離

按照常規(guī)方法，無菌條件下對試驗魚體進行病原菌的分離：先將試驗魚消毒后，自試驗魚肝、腎、脾、鰓部等部位分離病原菌，將其研磨并涂布接種于LB固體培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)24 h，使之形成單個菌落，觀察菌落形態(tài)特征，挑取優(yōu)勢菌株，劃線純化后，接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，4 ℃保藏。

1.3.2.2 水樣的分離

用孔徑為0.22 μm的硝酸纖維素微孔濾膜過濾水樣(細菌阻隔在濾膜上)。取出濾膜，置含有滅菌堿性蛋白胨水的試管中，28 ℃培養(yǎng)24 h，劃線接種于LB平板。28 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.3 致病性嗜水氣單胞菌的鑒定

1.3.3.1 菌落形態(tài)觀察

嗜水氣單胞菌在普通瓊脂平板上28 ℃培養(yǎng)24 h后的菌落為光滑、微凹、圓整、無色或淡黃色，有特殊芳香氣味。

1.3.3.2 生化鑒定

參照致病性嗜水氣單胞菌生理生化鑒定方法的國家標準，分別進行氧化酶試驗、致病性嗜水氣單胞菌鑒別培養(yǎng)、革蘭氏染色、吲哚試驗、糖發(fā)酵試驗、脫脂奶平板試驗。

1.3.3.3 嗜水氣單胞菌的16S rDNA擴增和Aer基因檢測

無菌操作沾取常見生化指標陽性的培養(yǎng)物于10 mL LB液體培養(yǎng)基中。28 ℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)10～12 h。參照說明書，用試劑盒提取嗜水氣單胞菌的基因組，-20 ℃保存。根據(jù)已發(fā)表的16S rDNA、Aer序列和文獻設(shè)計并合成引物。引物序列見表2。

多重PCR擴增體系(25 μL)：2×Taq plus PCR Master Mix 12.5 μL，16S rDNA上下游各1 μL，Aer上下游引物各1 μL。然后加入制備好的PCR模板1.0 μL，最后加入超純水補足至25 μL即可。設(shè)陰性對照 (以無菌雙蒸水代替DNA模板)和陽性對照(J-1標準株為模板)。94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存。取8 μL產(chǎn)物，點樣于 1.0%瓊脂糖凝膠電泳板孔中，120 V電壓，電泳20 min，于凝膠成系統(tǒng)下拍照判定，只16S rDNA特異條帶(685 bp)判定為嗜水氣單胞菌，與Aer基因(301 bp)同有的判定為致病性嗜水氣單胞菌。

表2 16S rDNA與4種毒力基因PCR擴增引物序列

1.3.4 致病性菌株的半致死密度的測定及回歸檢測

取上述鑒定為致病性嗜水氣單胞菌的32株代表株分別接種于營養(yǎng)肉湯28 ℃搖床培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)物利用血小球計數(shù)板計數(shù)，每株菌的試驗組分5組，每組10尾魚，將菌液以10-1、10-2、10-3、10-4倍比稀釋，每個稀釋度菌液對銀鯽進行腹腔注射，每尾注射0.2 mL,同時設(shè)生理鹽水對照。試驗魚蓄養(yǎng)于已消過毒的水族箱里，自來水已曝氣24 h，充氣，水溫控制在28 ℃，定期清污換水、投喂食物。每日記錄每組魚的死亡情況，參考Reed-Muench法計算半數(shù)致死密度，半數(shù)致死密度越低的菌株毒性越強。同時對瀕死病魚進行病原菌分離鑒定。

1.3.5 藥敏試驗

采用紙片擴散法，取100 μL菌懸液(經(jīng)顯微鏡計數(shù)約109cfu/mL)涂布于LB平板，用無菌鑷子將30種不同的抗生素紙片輕輕貼在平板表面，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后測定抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈直徑的大小，以及抗生素紙片產(chǎn)品的說明，判定該菌株對抗生素的敏感性。

1.3.6 菌種保藏

無菌操作挑取所保留斜面培養(yǎng)基上的菌種1～2環(huán)接種于10 mL LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28 ℃，培養(yǎng)12 h；將12 h培養(yǎng)液按1∶100比例轉(zhuǎn)接于10 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28 ℃再培養(yǎng)7 h。在超凈工作臺內(nèi)操作，將最終的培養(yǎng)液與20%的滅菌脫脂奶稀釋液按1∶1比例混合。將菌種和保護介質(zhì)混合液分裝至滅菌的冷凍干燥管，分裝量以到達冷凍干燥管1/2為宜，冰箱-20 ℃預(yù)冷凍2 h，然后置于冰箱-70 ℃冷凍10 h，真空冷凍干燥后將干燥好的菌種置于-70 ℃低溫保藏。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學調(diào)查結(jié)果與分析

通過對豫北地區(qū)4個養(yǎng)殖場實地調(diào)查，僅延津東屯糧所漁場魚塘在魚體未檢測到致病性嗜水氣單胞菌，只在水體中檢測到非致病性的嗜水氣單胞菌。其他3個在魚體中均檢測到致病性嗜水氣單胞菌，其比例分別為：新發(fā)養(yǎng)殖場漁場12.5%、衛(wèi)輝市東湖漁場71.9%和原陽黃寺漁場15.6%。其中衛(wèi)輝市東湖漁場最高。

嗜水氣單胞菌引起的細菌性敗血病具有明顯的季節(jié)性，流行時間為6-10月，5月開始出現(xiàn)少量的感染，6—9月為感染的爆發(fā)期，整個養(yǎng)殖場水面出現(xiàn)大片的死魚，10月后開始減少，同時檢測水體的溫度也發(fā)現(xiàn)，水溫持續(xù)25 ℃或者持續(xù)28 ℃以上感染最為嚴重，但有時水溫在20 ℃以下，也檢測到嗜水氣單胞菌但均為非致病性的。說明該病與季節(jié)溫度變化的關(guān)系密切相關(guān)。其次，養(yǎng)殖場感染的魚類主要為鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、鯽魚(Carassiusauratus)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、麥穗魚(Pseudorasboraparva)和鯉魚(Cyprinuscarpio)等，致病性嗜水氣單胞菌在這些魚中的分離率分別為43.8%、28.1%、12.5%、12.5%和3.1%?；疾◆~游動緩慢，基本不攝食；離群獨游于水面上；體表均有充血、出血現(xiàn)象，鰓絲出血明顯，不同程度脫鱗，剖檢時可見鰓部有小鞘指環(huán)蟲(Dactylogyrusvaginulatus)、顯著車輪蟲(Trichodinanobillis)、大中華鳋(Sinergasilusmajor)等寄生蟲感染；肝臟、脾臟、腎臟不同程度腫大出血；腸道不同程度積水，腸內(nèi)無或有少量食物，表現(xiàn)為典型敗血癥感染癥的特征。

根據(jù)調(diào)查表的數(shù)據(jù)顯示，4個養(yǎng)殖場的水質(zhì)pH值波動不大，氨氮和亞硝酸鹽含量變化較大，在養(yǎng)殖初期不明顯，隨著溫度的上升，魚攝食量增加，自然導致投喂飼料量及其排泄量增加，其氨氮和亞硝酸鹽含量隨之增大、水體呈低溶解氧狀態(tài)，再加上其養(yǎng)殖模式為精養(yǎng)高產(chǎn)模式，從而導致魚體抗病力下降也是導致細菌性敗血病爆發(fā)的原因。

2.2 分離菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

所得菌株的形態(tài)一致，均為革蘭氏染色陰性、兩端鈍圓、散在或個別成雙排列、無芽孢、大小多在0.4～0.8 μm ×1.0～2.2 μm的桿菌。

2.2.2 理化性狀

生化鑒定結(jié)果為氧化酶試驗陽性、致病性嗜水氣單胞菌鑒別培養(yǎng)陽性、革蘭氏染色陰性、吲哚試驗陽性、糖發(fā)酵試驗陽性。從而初步篩選出107株菌株。

2.3 16S rDNA和Aer基因的PCR擴增結(jié)果

通過對16S rDNA和Aer基因的雙重PCR擴增，判定無任何條帶出現(xiàn)的55株菌株不是嗜水氣單胞菌，只在16S rDNA片段處有條帶的是嗜水氣單胞菌，共20株；而在16S rDNA和Aer片段處均能出現(xiàn)條帶的為致病性嗜水氣單胞菌，共32株。因此判定共有52株是嗜水氣單胞菌。其部分擴增結(jié)果見圖1。

圖1 部分嗜水氣單胞菌16s rDNA、Aer基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜

注：編號1～30為臨床分離株；編號31、32為陰性對照菌：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌；編號33為空白對照，以無菌雙蒸水代替模板；編號34為陽性對照菌：嗜水氣單胞菌J-1標準株.

2.4 致病性菌株的半致死密度的測定及回歸檢測結(jié)果

由表1可見，在32株致病菌株的半致死密度存在一定的差別，其值越小則毒性越強。其中菌株XDMG(4)最小(1.13×105cfu/mL)，說明該菌株毒力最強，可作為后期研究的備用疫苗株。

發(fā)病并死亡的試驗魚胸鰭、腹鰭、臀鰭的基部及肛門充血，與自然發(fā)生的爆發(fā)性出血病癥狀一致。剖檢肝臟進行菌株的分離、培養(yǎng)，得到大量純一的同種菌株，通過對其進行形態(tài)觀察，生理生化特征及16S rDNA基因序列等指標的測定，結(jié)果與原感染菌株完全一致。

2.5 藥敏結(jié)果

分離的52株嗜水氣單胞菌對30種藥物的藥敏結(jié)果顯示：不同菌株對同一種藥物的藥敏結(jié)果不同，有的甚至差別很大，但大部分藥物的藥敏結(jié)果基本一致。70%以上的菌株對頭孢哌酮、氟本尼考、菌必治、阿米卡星等抗菌藥物表現(xiàn)為高度敏感，對青霉素類藥物表現(xiàn)為高度耐藥性，耐藥率達到100%，對氨基糖苷類(除去阿米卡星)、磺胺類、四環(huán)素等藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，具有多重耐藥性。這一結(jié)果，可以為本地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)提供用藥依據(jù)，但其藥物的劑量、效果還待進一步研究。

3 討 論

3.1 豫北地區(qū)嗜水氣單胞菌爆發(fā)流行原因

通過流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，引起豫北地區(qū)細菌性敗血病的病原體主要是致病性嗜水氣單胞菌，發(fā)病的病因與6—9月的高溫季節(jié)、養(yǎng)殖密度過高、水體環(huán)境惡化、寄生蟲衍生繁殖、嗜水氣單胞菌大量滋生等一系列因素息息相關(guān)，造成了該病的爆發(fā)。這與司麗娜等[17]的研究結(jié)果相同。

延津東屯糧所漁場魚塘未在魚體內(nèi)檢測到致病性嗜水氣單胞菌，也未見爆發(fā)性出血病發(fā)生，只在水體中檢測到非致病性的嗜水氣單胞菌。這與該漁場池塘面積小、定期進行殺蟲、清塘消毒殺菌、科學預(yù)防有關(guān)。衛(wèi)輝市東湖漁場在4個漁場中檢測到致病性嗜水氣單胞菌比例是最高的(71.9%)，主要養(yǎng)殖魚類均感染，且死亡率高，這可能與該魚塘面積較大(0.15 hm2)定期進行殺蟲、消毒不便有關(guān)，且在病魚鰓部也檢測到大量中華鳋、指環(huán)蟲等寄生蟲，從而引起嗜水氣單胞菌感染。

3.2 豫北地區(qū)嗜水氣單胞菌的鑒定及耐藥性

通過生理生化和分子生物學檢測快速檢測得到32株致病性嗜水氣單胞菌，且對32株進行毒性試驗和藥敏試驗，證明其致病性和耐藥性存在差異。發(fā)現(xiàn)32株致病性嗜水氣單胞菌均能使試驗魚爆發(fā)與自然發(fā)病魚一致的癥狀，但死亡率不同，特別是菌株XDMG(4)，毒力(半致死密度1.13×105cfu/mL)明顯強于其他菌株，后續(xù)工作將繼續(xù)研究其致病性，為后期基因疫苗的篩選做準備；藥敏試驗結(jié)果證明嗜水氣單胞菌的耐藥情況十分嚴重，這與各養(yǎng)殖廠濫用、亂用藥物有關(guān)，也與耐藥菌株在各個養(yǎng)殖場的互相流通有關(guān)。這就要求在實際生產(chǎn)實踐中科學地合理地使用嗜水氣單胞菌敏感的藥物，如頭孢哌酮、氟本尼考、菌必治、阿米卡星等，并經(jīng)常輪換，預(yù)防耐藥菌株的產(chǎn)生[18-19]。

3.3 豫北地區(qū)嗜水氣單胞菌的防治

在魚類的養(yǎng)殖過程中要堅持以預(yù)防為主、防治結(jié)合的策略，以減少該病的發(fā)生。首先，要做好養(yǎng)殖場的清淤消毒工作，保證魚塘的水質(zhì)優(yōu)良；其次，及時殺蟲、殺菌是防治工作的重中之重，因為寄生蟲的大量繁殖定會造成魚類的鰓部、體表等受傷，傷口又為細菌感染創(chuàng)造了條件，而嗜水氣單胞菌是條件性致病菌，就會趁機造成該病的爆發(fā)；最后，當魚體出現(xiàn)該病時要合理用藥，減少抗生素的應(yīng)用，且積極研制本地區(qū)的基因工程疫苗，才能有效的防治該病的發(fā)生。總之，本試驗對把握豫北地區(qū)嗜水氣單胞菌的流行病學特征具有重要意義，為制備適合本地區(qū)疫苗提供了前期基礎(chǔ)。

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EpidemiologicalInvestigationofAeromonashydrophilaInfectionIsolatedinMajorFresh-waterFishesfromNorthernRegionsinHenan,China

HE Wenxu，MAO Huili, YANG Limin, FU Yundong, ZENG Hui, GUAN Jianyi

( School of Life Science and Technology, Xinxiang Medical University， Xinxiang 453003， China )

To investigate the epidemiology of bacterial septicemia outbreak in fish,Aeromonashydrophilawere isolated and identified from the northern regions of Henan Province, China, and the virulence and drug sensitive characteristics of pathogenic strains were verified. The diseased fish samples and water samples were collected from 4 fish cultured area in the northern regions of Henan Province. Epidemiological investigation were performed once a month, and the distribution ofA.hydrophilawere detected by physiological and biochemical and molecular biological methods. A total of 52A.hydrophilastrains, 32 pathogenic strains, 20 non pathogenic strains, were isolated and the pathogenic strains were primary distributed from July to September. Virulence experiment showed that there were different toxicities among 32 pathogenic strains, through which the highest virulent strain XDMG(4) were screened, which will be as the vaccine strain for further experiments. Drug resistance indicated that differenct sensitivity to the same drug varried with different strains, but most drug resistance was consistent. About 70% pathogenic strains were highly sensitive to Cefoperazone，F(xiàn)lorfenicol，Ceftriaxone Sodium and Amikacin, highly resistant to penicillin drugs，with resistance rate of 100%, and certain extent resistance to Aminoglycosides(except Amikacin), Sulfonamides, and Tetracycline. The different strains showed differences in drug resistance. The findings would help enrich in epidemic data of the bacteria septicemia in this region, and provide scientific theoretical basis for human disease caused byA.hydrophila.

Aeromonashydrophila; 16S rDNA; drug sensitive test; bacterial septicemia

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.015

S917

A

1003-1111(2016)03--0278-06

2015-08-27；

2015-11-10.

國家自然科學基金資助項目(30940008)；2013年國家大學生創(chuàng)新課題(201310472007)；河南省科技廳科技攻關(guān)項目(132102310165)；河南省教育廳科技攻關(guān)項目(2011A240001).

賀文旭(1993-)女，在校本科生；研究方向：病原微生物.E-mail:mhlfff@126.com. 通訊作者： 關(guān)建義(1969-)男，副教授，碩士；研究方向:病原微生物.E-mail:jianyiguan@163.com.