山楂消脂膠囊中大黃蒽醌類成分一測(cè)多評(píng)法的建立

李影雄，李子鴻，劉東文，陳淑映，王汝上

1.佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000；2.廣州康臣藥物研究有限公司，廣東 廣州 510663

山楂消脂膠囊中大黃蒽醌類成分一測(cè)多評(píng)法的建立

李影雄1，李子鴻1，劉東文1，陳淑映1，王汝上2

1.佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000；2.廣州康臣藥物研究有限公司，廣東 廣州 510663

目的 建立山楂消脂膠囊中大黃蒽醌類成分一測(cè)多評(píng)法的分析方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察。方法 以大黃素為內(nèi)參照物，建立蘆薈大黃素、大黃酸和大黃酚與大黃素間的相對(duì)校正因子。分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定山楂消脂膠囊中4種蒽醌類成分的含量，以驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的合理性、可行性和可重復(fù)性。結(jié)果 一測(cè)多評(píng)法的計(jì)算結(jié)果與外標(biāo)法的實(shí)測(cè)值之間無顯著差異。結(jié)論 一測(cè)多評(píng)法可作為一種質(zhì)量評(píng)價(jià)模式用于山楂消脂膠囊中蒽醌類成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

一測(cè)多評(píng)法；高效液相色譜法；山楂消脂膠囊；蒽醌；相對(duì)校正因子

山楂消脂膠囊是佛山市中醫(yī)院院內(nèi)制劑（批準(zhǔn)文號(hào)：粵藥制字Z20060045），由山楂和大黃2味中藥組成，具有行氣化痰、消積除滯、清熱涼血作用，臨床主要用于高脂血癥、肥胖癥等患者[1]。山楂消脂膠囊可通過抗炎癥反應(yīng)，降低同型半胱氨酸水平，穩(wěn)定冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，從而減少非急性期冠心病痰瘀證患者急性心血管事件的發(fā)生[2-3]。大黃是該藥的主要成分之一，主要含大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素等蒽醌類成分[4]。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅采用薄層法進(jìn)行定性鑒別，為更好地有效控制山楂消脂膠囊的質(zhì)量，本研究采用一測(cè)多評(píng)法[5-7]同時(shí)測(cè)定方中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素4個(gè)成分的含量，為該制劑提供快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

Agilent1260和Agilent1200型高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，Agilent ChemStations數(shù)據(jù)處理軟件（安捷倫科技有限公司）；Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.5 mm，5 μm）、Alltima C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）和Synergi Hydro-Rp（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；KQ3200DB型數(shù)控超聲儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；BS224S分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

山楂消脂膠囊10批（佛山市中醫(yī)院，批號(hào)分別為0431304、0431305、0431306、0431307、0431308、0431309、0431310、0431311、0431312、0431313）；對(duì)照品蘆薈大黃素（批號(hào)110795-201007）、大黃酸（批號(hào)0757-200206）、大黃酚（批號(hào)110796-201319）、大黃素（批號(hào)110756-200110）均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，默克公司）；超純水（本實(shí)驗(yàn)室制備）；其他溶劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.5 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（80∶20），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長254 nm，進(jìn)樣量20 μL。理論板數(shù)按大黃素峰面積計(jì)算應(yīng)不低于4000。色譜圖見圖1。

圖1 山楂消脂膠囊中蒽醌類成分HPLC圖

2.2 供試品溶液的制備

取山楂消脂膠囊內(nèi)容物粉末約30 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，回流提取60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾。精密取續(xù)濾液5 mL，置圓底燒瓶減壓蒸干，加鹽酸（8→100）及三氯甲烷各10 mL，加熱回流60 min，放冷，置分流漏斗萃取，取有機(jī)層，酸液再用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，合并有機(jī)層，減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆薈大黃素1.01 mg、大黃酸1.03 mg、大黃素0.97 mg、大黃酚1.02 mg，置50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度分別為0.020 2、0.020 6、0.019 4、0.020 4 mg/mL的混合對(duì)照品溶液作為母液，備用。分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液10.0、5.0、2.5、1.0、0.5 mL置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為線性關(guān)系考察及含量分析用混合對(duì)照品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按山楂消脂膠囊處方工藝制備缺大黃的陰性樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述不同濃度的混合對(duì)照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，以測(cè)得的峰面積和被測(cè)物的進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸，得到各成分的回歸方程及線性范圍。結(jié)果表明，各對(duì)照品在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。

表1 大黃蒽醌線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一份山楂消脂膠囊供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素峰面積RSD分別為0.078%、0.13%、0.16%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批山楂消脂膠囊內(nèi)容物，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素峰面積的RSD分別為0.87%、0.81%、0.65%、0.73%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份山楂消脂膠囊供試品溶液，分別于樣品制備后的0、1、2、4、8、16、24、48 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素峰面積RSD分別為0.23%、0.31%、0.15%、0.46%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品粉末15 mg，精密稱定，平行6份，分別按樣品含量∶對(duì)照品＝1∶1的大概比例加入一定量對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算各成分的回收率及RSD。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素的回收率分別為101.3%、100.1%、98.8%、101.6%，RSD分別為1.43%、1.67%、1.28%、1.73%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)

2.10 校正因子計(jì)算

精密吸取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，進(jìn)樣分析，以大黃素為內(nèi)標(biāo)，分別計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸和大黃酚對(duì)大黃素的相對(duì)校正因子（f），結(jié)果見表3。

表3 山楂消脂膠囊中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚對(duì)大黃素的相對(duì)校正因子（n＝3）

2.11 校正因子的系統(tǒng)適應(yīng)性考察

2.11.1 不同儀器及不同色譜柱考察 精密吸取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，進(jìn)樣分析，按“2.10”項(xiàng)下方法計(jì)算校正因子，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，采用不同儀器和不同色譜柱，所得相對(duì)校正因子無明顯差異。

表4 不同儀器和色譜柱測(cè)得的相對(duì)校正因子

2.11.2 色譜峰定位 利用內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間，計(jì)算出各待測(cè)成分色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間（Rt），結(jié)果見表5。結(jié)果表明各成分相對(duì)保留時(shí)間均＜3。

表5 不同儀器和色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留時(shí)間表6 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法對(duì)山楂消脂膠囊中蒽醌類成分含量測(cè)定（mg/g）

2.12 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法含量測(cè)定比較

先采用外標(biāo)法對(duì)10批山楂消脂膠囊中4種蒽醌類成分進(jìn)行同步測(cè)定，再用所建立的一測(cè)多評(píng)法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表6?？梢?，2種方法測(cè)得的結(jié)果無顯著差異，相對(duì)誤差均＜3%，說明所建立的方法具有較好的可信度。

表5 不同儀器和色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留時(shí)間表6 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法對(duì)山楂消脂膠囊中蒽醌類成分含量測(cè)定（mg/g）

3 討論

在中藥多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)中，多采用指紋圖譜技術(shù)來體現(xiàn)中藥的整體性，但難以對(duì)每個(gè)成分進(jìn)行定量。一測(cè)多評(píng)法的研究思路側(cè)重于對(duì)主要成分或藥效成分間的相互關(guān)系及定量關(guān)系，校正因子的運(yùn)用能夠?qū)崿F(xiàn)在對(duì)照品短缺情況下多指標(biāo)成分的含量測(cè)定，是中藥多組分同步測(cè)定的發(fā)展方向，也是未來重點(diǎn)推廣的技術(shù)[8]。

本研究采用二極管陣列檢測(cè)器在190～490 nm波長下對(duì)混合對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行掃描。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸和大黃酚對(duì)大黃素在254 nm波長處均有明顯吸收，因此選擇254 nm作為檢測(cè)波長，與2010年版《中華人民共和國國藥典》保持一致。

大黃素為大黃藥材中的主要成分之一，也是大黃特征性成分代表，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，含量適中，容易取得且價(jià)廉，故選其作為內(nèi)參照物。試驗(yàn)考察了相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間在不同儀器和不同品牌色譜柱的重現(xiàn)性，均能很好地測(cè)定各組分色譜峰。結(jié)果顯示，不同品牌的色譜柱對(duì)大黃蒽醌類成分的選擇性較強(qiáng)，相同色譜條件下，大黃蒽醌類成分在不同色譜柱上的保留行為差異較大；相同色譜條件下，不同型號(hào)儀器對(duì)大黃蒽醌類成分影響不大。但在本色譜條件下，不同色譜柱和不同儀器均能獲得滿意的結(jié)果。對(duì)外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法進(jìn)行比較，通過測(cè)定兩者間的相對(duì)誤差值進(jìn)行評(píng)價(jià)一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示，相對(duì)誤差均＜3%，無顯著差異。

本試驗(yàn)建立的大黃蒽醌類成分的一測(cè)多評(píng)法可同時(shí)測(cè)定多個(gè)蒽醌類成分。選擇大黃素作為內(nèi)參照物，更體現(xiàn)該方法的簡(jiǎn)便、易操作、低成本等特點(diǎn)。采用一測(cè)多評(píng)法同步測(cè)定山楂消脂膠囊中蘆薈大黃素、大黃酸和大黃酚對(duì)大黃素含量，可快速、全面地監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量。

[1] 趙華云,王文會(huì).山楂消脂膠囊對(duì)血脂代謝紊亂患者血管內(nèi)皮功能的影響[J].中藥材,2006,29(6)：629-631.

[2] 趙華云,王文會(huì),陳偉強(qiáng),等.山楂消脂膠囊對(duì)非急性期冠心病痰瘀證患者Hcy及Hs-CRP影響的研究[J].新中醫(yī),2011,43(10)：9-11.

[3] 王文會(huì),趙華云,陳偉強(qiáng),等.山楂消脂膠囊對(duì)非急性期冠心病痰瘀證56例臨床研究[J].中藥材,2012,35(1)：164-167.

[4] 許乾麗,茅向軍,宋曉寧,等.HPLC法同時(shí)測(cè)定六味安消膠囊中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量[J].藥物分析雜志, 2010,30(10)：1841-1844.

[5] 王鈺瑩,馮偉紅,楊菲,等.“一測(cè)多評(píng)”法測(cè)定三黃片中的大黃蒽醌類成分[J].中國中藥雜志,2012,37(2)：212-217.

[6] 蔡海霞,陳君,李萍.一測(cè)多評(píng)法測(cè)定黃芪中4種異黃酮的含量[J].中國中藥雜志,2010,35(20)：2712-2717.

[7] 張德培,羅源生,賀凡珍.酒大黃中5種蒽醌類成分一測(cè)多評(píng)方法的建立[J].中藥材,2012,35(4)：588-590.

[8] 王智民,高慧敏,付雪濤,等.“一測(cè)多評(píng)”法中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式方法學(xué)研究[J].中國中藥雜志,2006,31(23)：1925-1928.

Determination of Four Anthraquinones in Shanzha Xiaozhi Capsules by QAMS

LI Ying-xiong1,

LI Zi-hong1, LIU Dong-wen1, CHEN Shu-ying1, WANG Ru-shang2(1. Foshan Hospital of TCM, Foshan 528000, China; 2. Guangzhou Consun Drug Research Ltd., Guangzhou 510663, China)

Objective To establish a method for the quantitative analysis of multi-component with a single-marker (QAMS) to determine the contents of four rhubarb anthraquinones in Shanzha Xiaozhi capsules; To conduct methodology investigation. Methods Emodin was set as the internal reference substance, and the relative correlation factors of aloe emodin, rhein, chrysophanol to emodin were calculated and evaluated. The contents of these four anthraquinones were determined by the external standard method and QAMS, respectively. Rationality, feasibility and repeatability of the QAMS method were verified by comparing the results obtained from the two different methods. Results The QAMS method and HPLC method did not show significant difference in results. Conclusion QAMS method can be used as a quality assessment model for quantity evaluation of anthraquinones in Shanzha Xiaozhi Capsules.

QAMS; HPLC; Shanzha Xiaozhi Capsules; anthraquinone; relative correlation factor

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.021

R284.1

A

1005-5304(2016)01-0089-04

2015-03-24）

（

2015-04-09；編輯：陳靜）

王汝上，E-mail：resun-com@163.com