超濾對(duì)身痛逐瘀湯活血化瘀效果的影響

劉曉霞，王繼龍，魏舒暢，宋曉春，金輝

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

超濾對(duì)身痛逐瘀湯活血化瘀效果的影響

劉曉霞，王繼龍，魏舒暢，宋曉春，金輝

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

目的 研究超濾對(duì)身痛逐瘀湯活血化瘀效果的影響，考察超濾技術(shù)用于身痛逐瘀湯純化的可行性。方法 以小鼠微血管動(dòng)靜脈管徑、小鼠凝血時(shí)間、耳廓循環(huán)障礙小鼠毛細(xì)血管開(kāi)放量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察身痛逐瘀湯提取液未超濾及不同超濾方法對(duì)活血化瘀效果的影響。結(jié)果 身痛逐瘀湯具有較好的活血化瘀效果，20、50 nm膜超濾液與未濾液相比其活血化瘀效果無(wú)明顯差異。結(jié)論 超濾技術(shù)可用于身痛逐瘀湯的純化工藝，所選膜孔徑應(yīng)不小于20 nm。

身痛逐瘀湯；超濾；活血化瘀；小鼠

身痛逐瘀湯為臨床常用的經(jīng)典活血化瘀名方，由秦艽、川芎、桃仁、紅花、羌活、沒(méi)藥、當(dāng)歸、五靈脂、香附、牛膝、地龍、甘草組成，具有活血祛瘀、祛風(fēng)除濕、通痹止痛功效，主要用于瘀血夾風(fēng)濕、經(jīng)絡(luò)痹阻造成的肩痛、臂痛、腰腿痛或周身疼痛經(jīng)久不愈者，臨床應(yīng)用比較廣泛[1-2]。目前，該處方在臨床上均以湯劑使用，由于服用體積大、雜質(zhì)多、外觀差及使用不方便，不利于臨床應(yīng)用。超濾屬膜分離技術(shù)，可有效除去中藥復(fù)方中大分子雜質(zhì)，改善制劑外觀、減小服用劑量。本研究以活血化瘀效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察身痛逐瘀湯水提取液超濾前后活血化瘀效果的變化情況，研究超濾技術(shù)應(yīng)用于該經(jīng)典方純化的可行性，為該方進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

HH-S型恒溫水浴鍋，金壇市正基儀器有限公司；L400低速臺(tái)式離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；BS1103型Sartorius電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；SHZ-DIII型循環(huán)水式真空泵，上海予華儀器設(shè)備有限公司；SJM陶瓷超濾設(shè)備，合肥世杰膜工程有限公司；10、20、50 nm超濾膜，合肥世杰膜工程有限公司；FeriFiux5000激光多普勒微循環(huán)系統(tǒng)，瑞典Perimed公司。

秦艽、川芎、桃仁、紅花、羌活、沒(méi)藥、當(dāng)歸、香附、牛膝、地龍、甘草藥材購(gòu)于蘭州黃河藥材市場(chǎng)，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)魏舒暢教授鑒定，分別為麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.的干燥根、川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖、桃仁Prunus persica（L.）Batsch的干燥成熟種子、紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花、羌活Notopterygium incisumTing ex H.T.Chang的干燥根莖及根，沒(méi)藥Commiphora myrrha Engl.的干燥樹(shù)脂、當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根、香附Cyperus L.的干燥根莖、牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根、地龍Pheretima vulgaris Chen的干燥體、甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根莖及根。泊洛沙姆（藥用級(jí)，南京威爾化工有限公司，批號(hào)20130405）。

昆明種小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，甘肅中藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（甘）2011-0001。

2 方法

2.1 身痛逐瘀湯的提取

按處方比例稱(chēng)取藥材2.0 kg，加入6倍量水，采用共水蒸餾法提取川芎、紅花、羌活、沒(méi)藥、當(dāng)歸、香附的揮發(fā)油，提取5 h，收集揮發(fā)油，得揮發(fā)油5.2 mL。另器收集提完揮發(fā)油的水提取液，藥渣再加8倍量水提取1 h，合并2次提取液。秦艽、桃仁、五靈脂、牛膝、地龍、甘草100 ℃回流提取2次，每次加10倍量水，每次提取1.5 h。將2組提取液合并，300目篩過(guò)濾，得總提取液28.6 L，備用。

2.2 身痛逐瘀湯提取液的超濾

取1.6 L上述提取液，3000 r/min離心（水平轉(zhuǎn)子平均半徑20 cm）20 min，收集上清液，取樣200 mL，測(cè)定出膏率。剩余提取液均分為3份，每份9.0 L。分別用10、20、50 nm超濾膜在45 ℃、0.10 MPa壓強(qiáng)下超濾，并在截留液體積剩下1.0 L時(shí)加水2.0 L稀釋截留液，繼續(xù)超濾，總共稀釋3次。最后1次稀釋后超濾至截留液體積1.0 L時(shí)棄去截留液，收集超濾透過(guò)液[3-4]。分別取3種超濾液，取樣200 mL，蒸去溶劑，干燥后測(cè)定出膏率及除雜率。出膏率（%）＝（提取物質(zhì)量÷原藥材質(zhì)量）×100%。除雜率（%）＝[（未超濾樣品出膏率－超濾樣品出膏率）÷未超濾樣品出膏率]×100%。

2.3 藥效評(píng)價(jià)用藥液的制備

將離心所得上清液及超濾液減壓濃縮成濃度為1.0 g原藥材/mL的濃縮液，將“2.1”項(xiàng)所得揮發(fā)油加入2倍量的泊洛沙姆研勻，再將揮發(fā)油與泊洛沙姆的混合物按比例分別加入4種濃縮液中混勻，得到藥效評(píng)價(jià)用藥液。藥液中泊洛沙姆的濃度為1.04%。

2.4 超濾對(duì)活血化瘀作用的影響

2.4.1 小鼠耳廓微循環(huán)實(shí)驗(yàn) 取小鼠60只，雌雄各半，按體質(zhì)量、性別隨機(jī)分成6組，對(duì)照組及模型組給予含1.0%泊洛沙姆的生理鹽水灌胃，其余4組分別給予“2.3”項(xiàng)下未超濾液及10、20、50 nm超濾的濃縮液0.2 mL灌胃。每日2次，連續(xù)7 d，于末次給藥后立即腹腔注射20%烏拉坦（0.1 mL/10 g）麻醉，將除模型組外的其余5組小鼠一側(cè)耳廓置微循環(huán)顯微鏡載物臺(tái)，滴涂液體石蠟，用10×10倍鏡、透射光、測(cè)微尺測(cè)量給藥后5、45 min小鼠耳廓微動(dòng)脈、微靜脈管徑（測(cè)2次）。測(cè)量結(jié)束后，將模型組及給藥組小鼠于耳廓滴加1∶1000腎上腺素0.1 mL/只致微循環(huán)障礙，對(duì)照組耳廓滴加等體積生理鹽水[5-7]。觀察造模后15、30 min小鼠耳廓微循環(huán)。

2.4.2 小鼠凝血實(shí)驗(yàn) 取50只小鼠，按體質(zhì)量、性別隨機(jī)分為5組，對(duì)照組給予含1.0%泊洛沙姆的生理鹽水灌胃，其余4組分別給予“2.3”項(xiàng)下未超濾液及10、20、50 nm超濾濃縮液0.2 mL灌胃，每日2次，連續(xù)7 d，于末次給藥1.0 h后，用內(nèi)徑1.0 mm毛細(xì)玻璃管在小鼠內(nèi)眥球后采血，測(cè)定凝血時(shí)間[8]。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 超濾對(duì)身痛逐瘀湯出膏率的影響

隨超濾膜孔徑減小，身痛逐瘀湯水提取液的出膏率依次降低，除雜率提高，見(jiàn)表1。

表1 不同處理方法出膏率、除雜率比較（%）

3.2 超濾對(duì)身痛逐瘀湯活血化瘀作用的影響

3.2.1 對(duì)小鼠微血管靜脈及動(dòng)脈口徑的影響 身痛逐瘀湯未超濾液及20、50 nm超濾液均可明顯增大小鼠微血管靜脈及動(dòng)脈管徑，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與10 nm超濾組比較，身痛逐瘀湯50 nm超濾組小鼠微血管靜脈及動(dòng)脈管徑顯著增大（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 不同處理方法小鼠微血管靜脈口徑比較（±s，μm）

表2 不同處理方法小鼠微血管靜脈口徑比較（±s，μm）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與10 nm超濾組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01（下同）

組別 只數(shù) 5 min 45 min對(duì)照組 10 32.20±2.68 33.18±2.79未超濾組 10 36.44±2.66 47.21±3.12**△△50 nm超濾組 10 35.78±2.94 45.09±2.77**△20 nm超濾組 10 35.22±2.73 43.78±3.43**△10 nm超濾組 10 33.93±3.06 37.54±3.61

組別 只數(shù) 5 min 45 min對(duì)照組 10 18.67±2.46 19.22±2.77未超濾組 10 22.61±2.10 26.93±3.06**△50 nm超濾組 10 22.78±2.21 26.23±2.85**△20 nm超濾組 10 21.67±2.54 24.76±2.11*10 nm超濾組 10 20.21±2.97 22.76±2.11

3.2.2 對(duì)耳廓循環(huán)障礙小鼠毛細(xì)血管開(kāi)放量的影響 身痛逐瘀湯未超濾液及10、20、50 nm超濾液均有增加血管開(kāi)放量的趨勢(shì)，未超濾液及20、50 nm超濾液均可顯著增加毛細(xì)血管開(kāi)放量，與10 nm超濾組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表4。

組別 只數(shù) 造模前 造模后15 min 造模后30 min對(duì)照組 10 6.22±1.16 6.54±1.16 6.61±1.16模型組 10 6.31±1.12 4.21±1.04 4.15±1.71未超濾組 10 8.69±1.35 6.83±1.22△△6.27±1.32△△50 nm超濾組 10 8.74±1.50 6.79±1.31△△6.41±1.11△20 nm超濾組 10 8.55±1.66 6.43±1.29△6.42±1.34△10 nm超濾組 10 7.39±1.54 5.22±1.41 5.05±1.48

3.2.3 對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響 身痛逐瘀湯未超濾液及20、50 nm超濾液均可明顯增延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間，與10 nm超濾組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表5。

?

4 討論

純化是中藥提取物制備過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，其臨床療效是多成分、多靶點(diǎn)整體作用的結(jié)果，因此活性成分的組成、含量和各成分之間的比例變化均會(huì)影響處方療效。超濾屬于膜分離技術(shù)，可通過(guò)調(diào)節(jié)膜孔徑截留分子量不同的物質(zhì)，在中藥復(fù)方純化過(guò)程中，在選擇性除去提取液中大分子惰性物質(zhì)、有效改善提取物溶劑性和液體產(chǎn)品澄明度的同時(shí)保證中藥復(fù)方活性成分的組成及比例基本不變[4]。

目前中藥復(fù)方純化工藝研究多選用某一種或一類(lèi)化學(xué)成分為工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)，由于評(píng)價(jià)指標(biāo)代表性不強(qiáng)、與處方臨床療效之間的關(guān)系不明確，使優(yōu)選所得工藝不能很好保證療效。本研究采用與身痛逐瘀湯臨床作用相關(guān)的藥效學(xué)數(shù)據(jù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察超濾技術(shù)用于身痛逐瘀湯的可行性，工藝的可靠性?xún)?yōu)于采用化學(xué)指標(biāo)所得結(jié)果。

將身痛逐瘀湯水提液3000 r/min離心旨在除去不溶性雜質(zhì)，得到澄明的藥液。該條件下離心力為500×g，處方中多糖等可溶性大分子成分在低速離心條件下不會(huì)沉降，從而保證提取液療效。結(jié)果顯示，該水提液有較好的活血化瘀作用。

本研究超濾過(guò)程是在較低壓力和較高溫度條件下進(jìn)行的，有利于消除濃差極化對(duì)超濾過(guò)程的影響，盡可能減少活性成分的損失，以便考察超濾技術(shù)的可行性。將身痛逐瘀湯水提取液用50、20 nm孔徑的超濾膜超濾后活血化瘀作用未見(jiàn)明顯差異。但經(jīng)10 nm超濾膜超濾后活血化瘀作用減弱，與未濾液比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示用超濾技術(shù)純化身痛逐瘀湯是可行的，但膜孔徑不能小于10 nm。

超濾純化的除雜力度較小，但除掉的是對(duì)澄明度、溶解性影響較大的大分子物質(zhì)，因此對(duì)提高制劑的品質(zhì)有顯著意義。20 nm超濾液與50 nm超濾液相比藥效略有降低，但未見(jiàn)明顯差異；從除雜效果看，20 nm膜超濾略?xún)?yōu)于50 nm膜，其超濾液的澄明度可能優(yōu)于50 nm膜超濾液，更有利于液體制劑的制備。

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Effects of Ultrafiltration Process on Activating Blood and Removing Stasis Efficacy of Shentong Zhuyu Decoction

LIU Xiao-xia, WANG Ji-long, WEI Shu-chang, SONG Xiao-chun, JIN Hui

(Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

Objective To study the effects of ultrafiltration process on activating blood and removing blood stasis efficacy of Shentong Zhuyu Decoction; To investigate the feasibility of applying ultrafiltration technology in purifying Shentong Zhuyu Decoction. Methods The mice micro artery and vein diameter, clotting time and opening capillary of auricle microcirculation of mice were used as indexes to observe the effects of different ultrafiltration process on activating blood and removing blood stasis efficacy of Shentong Zhuyu Decoction. Results Shentong Zhuyu Decoction showed satisfying efficacy of activating blood and removing blood stasis. There was no significant difference between the non-ultrafiltration process and ultrafiltration processed by 20 and 50 nm ultrafiltration membranes. Conclusion Ultrafiltration technology can be applied to purifying Shentong Zhuyu Decoction, and the membrane pore size must be more than 20 nm.

Shentong Zhuyu Decoction; ultrafiltration process; activating blood and removing stasis; mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.020

R283.5

A

1005-5304(2016)01-0086-03

2015-06-02）

（

2015-06-30；編輯：陳靜）

甘肅省高校基本科研費(fèi)項(xiàng)目（BH2012-018）

魏舒暢，E-mail：wshch006@163.com