五指毛桃藥物血清對(duì)老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞氧化損傷的影響

楊杰，衛(wèi)東鋒，王文瀟，程衛(wèi)東

1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700

五指毛桃藥物血清對(duì)老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞氧化損傷的影響

楊杰1，2，衛(wèi)東鋒3，王文瀟2，程衛(wèi)東1

1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700

目的 觀察五指毛桃藥物血清對(duì)老齡小鼠衰老所致脾淋巴細(xì)胞氧化損傷的影響，探討其作用機(jī)制。方法 將40只老齡小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和五指毛桃高、中、低劑量組，分別給予0.9%氯化鈉溶液和6.6、4.4、2.2 g/kg五指毛桃水提物灌胃，測(cè)定脾臟指數(shù)，確定五指毛桃水提物的最佳劑量，采用MTT法確定最佳劑量藥物血清干預(yù)老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的最佳稀釋濃度及最佳作用時(shí)間。使用最佳稀釋濃度藥物血清作用老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞48 h后觀察衰老細(xì)胞陽(yáng)性率，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，藥物組老齡小鼠脾臟指數(shù)均明顯提高（P＜0.05，P＜0.01)，以中劑量組效果最佳；五指毛桃藥物血清促進(jìn)老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的最佳濃度為20%，最佳作用時(shí)間為48 h。20%五指毛桃藥物血清明顯降低衰老細(xì)胞陽(yáng)性率（P＜0.01)，提高老齡小鼠T-SOD活性，降低MDA和ROS含量（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 五指毛桃藥物血清能夠提高老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性，其機(jī)制與降低衰老細(xì)胞陽(yáng)性率、增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力有關(guān)。

五指毛桃；藥物血清；脾淋巴細(xì)胞；衰老；氧化損傷；老齡小鼠

五指毛桃以?？崎艑僦参锎秩~榕Ficus hirta Vahl.的干燥根入藥，其味甘、辛，性平，具有補(bǔ)氣健脾、利濕舒筋等功效，常用于治療肺脾氣虛、風(fēng)濕痹痛、肺癆咳嗽等。因其與黃芪作用相當(dāng)，且主要產(chǎn)于我國(guó)嶺南地區(qū)，故又稱“南芪”。以往研究發(fā)現(xiàn)，南芪、北芪均有增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫力的作用，但南芪作用效果較為顯著[1]。五指毛桃中活性成分如黃酮、多糖、多酚、氨基酸均有較強(qiáng)清除自由基的作用，且其中黃酮、氨基酸和多酚相對(duì)于其他植物抗氧化活性更強(qiáng)[2]，對(duì)機(jī)體氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)方法，觀察五指毛桃藥物血清對(duì)老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞氧化損傷的影響，為五指毛桃的臨床應(yīng)用及藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種青齡小鼠50只，6月齡，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g；清潔級(jí)昆明種老齡小鼠60只，18月齡，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半。均由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)SCXK（甘）2009-0004。飼養(yǎng)溫度為（20±2）℃，12 h晝夜交替動(dòng)物房中，自由進(jìn)食。

1.2 藥物

五指毛桃由南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院程衛(wèi)東教授提供并鑒定。五指毛桃水提物制備：將藥材加入適量水中浸泡0.5～1 h，煎煮3次，第1次1.5 h，第2次1 h，第3次0.5 h，合并3次濾液，將所得濾液濃縮至1 g原藥材/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

四甲基偶氮唑鹽（MTT）、刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖，美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，恒生生物工程有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS），天津化學(xué)試劑一廠；EZ-SepTM小鼠淋巴細(xì)胞分離液，深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物制品公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）試劑盒，南京建成生物工程研究所。CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司），XL型流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼COULTER公司），JY92-2D超聲細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及藥物血清和脾淋巴細(xì)胞懸液制備

將40只老齡小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和五指毛桃高、中、低劑量組，每組10只?？瞻讓?duì)照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，藥物組按體質(zhì)量分別給予高、中、低劑量（6.6、4.4、2.2 g/kg）五指毛桃水提物灌胃，1次/d，連續(xù)15 d。末次給藥后，摘取脾臟，計(jì)算脾臟指數(shù)。根據(jù)脾臟指數(shù)選擇五指毛桃水提物最佳劑量（4.4 g/kg）作用于青齡小鼠，1次/d，連續(xù)15 d，末次給藥2 h后，制備藥物血清[3]。

將青齡小鼠和老齡小鼠脫頸處死，無菌取脾臟，嚴(yán)格按照EZ-SepTM小鼠淋巴細(xì)胞分離物說明書操作提取脾淋巴細(xì)胞，各加入適量含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，分別調(diào)整為所需濃度，制備青齡小鼠和老齡小鼠的脾淋巴細(xì)胞懸液。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1 五指毛桃藥物血清與脾淋巴細(xì)胞增殖時(shí)效和量效關(guān)系測(cè)定 將上述制備的老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，加入96孔板中，每孔100 μL。將“2.1”項(xiàng)中制備的各組藥物血清用完全RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋為2.5%、5%、10%、20%、40% 5個(gè)濃度。每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加藥物血清的老齡組和青齡組作為對(duì)照，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入濃度5 g/mL MTT 10 μL，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入100 μL 10%SDS，37 ℃過夜后搖勻，于酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定OD值。根據(jù)MTT結(jié)果選擇藥物血清的最佳稀釋濃度和培養(yǎng)時(shí)間。

2.2.2 衰老脾淋巴細(xì)胞增殖活性測(cè)定 取各組脾淋巴細(xì)胞按照細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書進(jìn)行操作。鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，按公式計(jì)算衰老細(xì)胞陽(yáng)性率。衰老細(xì)胞陽(yáng)性率（%）＝衰老細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.2.3 脾淋巴細(xì)胞總超氧化物歧化酶、丙二醛水平測(cè)定 將“2.1”項(xiàng)中收集的老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞與最佳稀釋濃度的藥物血清培養(yǎng)“2.2.1”項(xiàng)中確定的最佳培養(yǎng)時(shí)間后，收集細(xì)胞，用超聲波細(xì)胞破碎儀在冰上破碎細(xì)胞，嚴(yán)格按照T-SOD和MDA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.2.4 脾淋巴細(xì)胞活性氧水平測(cè)定 將“2.1”項(xiàng)收集的老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞與各組藥物血清共同培養(yǎng)。收集的細(xì)胞嚴(yán)格按照ROS試劑盒說明書處理后，用流式細(xì)胞儀于488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表4 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞T-SOD活性和MDA含量比較（s）

表4 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞T-SOD活性和MDA含量比較（s）

組別 n劑量/（g/kg）T-SOD/（U/mg）MDA/（nmol/mg）青齡組 8 7.51±1.02 1.21±0.46老齡組 8 2.52±0.53**2.65±1.05**空白血清組 8 2.46±0.51 2.35±0.79*五指毛桃藥物血清組8 6 5.65±0.84##1.19±0.67#

4 結(jié)果

4.1 五指毛桃水提物對(duì)老齡小鼠脾臟指數(shù)的影響

與空白對(duì)照組比較，五指毛桃高、中劑量組老齡小鼠脾臟指數(shù)明顯提高，且中劑量組效果顯著（P＜0.01），見表1。故選用中劑量五指毛桃水提物給予青齡小鼠灌胃制備藥物血清。

表1 各組老齡小鼠脾臟指數(shù)比較（±s）

表1 各組老齡小鼠脾臟指數(shù)比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量/（g/kg） 脾臟指數(shù)/（mg/g）空白對(duì)照組 10 2.74±0.73五指毛桃高劑量組 10 6.6 3.28±0.63*五指毛桃中劑量組 10 4.4 3.49±0.58**五指毛桃低劑量組 10 2.2 2.79±0.61

4.2 五指毛桃藥物血清對(duì)老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

與老齡組比較，稀釋濃度為10%、20%、40%五指毛桃藥物血清均能明顯提高老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性（P＜0.05，P＜0.01），并呈現(xiàn)一定的時(shí)-效和量-效關(guān)系。隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，脾淋巴細(xì)胞的增殖活性呈現(xiàn)先升后降的現(xiàn)象；空白血清稀釋濃度為20%和40%時(shí)，也可提高老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞增殖活性，但仍比五指毛桃藥物血清組水平低。與空白血清組比較，培養(yǎng)48 h，稀釋濃度為20%五指毛桃藥物血清對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的刺激效果最佳（P＜0.01），見表2。因此，將稀釋濃度為20%、培養(yǎng)時(shí)間為48 h的五指毛桃藥物血清作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的條件。

表2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性比較（±s）

表2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性比較（±s）

注：與同一時(shí)點(diǎn)老齡組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與同一濃度空白血清組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n24 h 48 h 72 h青齡組 81.01±0.19**1.23±0.28**1.08±0.16**老齡組 80.59±0.14 0.65±0.06 0.57±0.05 2.5%空白血清組 80.57±0.07 0.69±0.04 0.60±0.03 5%空白血清組 80.58±0.04 0.63±0.06 0.57±0.05 10%空白血清組 80.60±0.05 0.68±0.05 0.61±0.04 20%空白血清組 80.68±0.09 0.83±0.09**0.62±0.08 40%空白血清組 80.65±0.04 0.78±0.08*0.64±0.04*2.5%五指毛桃藥物血清組80.62±0.09 0.65±0.05 0.65±0.09 5%五指毛桃藥物血清組 80.66±0.14 0.72±0.09 0.67±0.10 10%五指毛桃藥物血清組80.72±0.07##0.79±0.06#0.71±0.05#20%五指毛桃藥物血清組80.79±0.02##1.19±0.13##0.98±0.15##40%五指毛桃藥物血清組80.74±0.07##0.90±0.21#0.79±0.08#

4.3 五指毛桃藥物血清對(duì)老齡小鼠脾衰老細(xì)胞的影響

老齡組衰老細(xì)胞陽(yáng)性率為23.80%，青齡組衰老細(xì)胞陽(yáng)性率為2.31%。與青齡組比較，老齡組脾衰老細(xì)胞顯著升高（P＜0.01）；與空白血清組比較，五指毛桃藥物血清作用后老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞衰老細(xì)胞陽(yáng)性率顯著降低（P＜0.01）；老齡組與空白血清組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠脾衰老細(xì)胞陽(yáng)性率比較（±s）

表3 各組小鼠脾衰老細(xì)胞陽(yáng)性率比較（±s）

注：與青齡組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白血清組比較，#P＜0.05，##P＜0.01（下同）

組別 n 劑量/（g/kg） 陽(yáng)性率/%青齡組 8 2.31±0.45老齡組 8 23.80±1.59**空白血清組 8 22.95±1.02五指毛桃藥物血清組 86 15.73±0.81##

4.4 五指毛桃藥物血清對(duì)老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞總超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量的影響

與青齡組比較，老齡組小鼠脾淋巴細(xì)胞T-SOD活性顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與空白血清組比較，五指毛桃藥物血清組老齡小鼠體外脾淋巴細(xì)胞總T-SOD活性顯著升高（P＜0.01），脾淋巴細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著降低（P＜0.05）；與老齡組比較，空白血清組脾淋巴細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯降低（P＜0.05），但仍比五指毛桃藥物血清組水平高。結(jié)果見表4。

4.5 五指毛桃藥物血清對(duì)老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞活性氧水平的影響

與青齡組比較，老齡組脾淋巴細(xì)胞中ROS含量顯著升高（P＜0.01）；與空白血清組比較，五指毛桃藥物血清組老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞中ROS含量明顯降低（P＜0.05）；空白血清組與老齡組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表5。

表5 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞ROS含量比較（s）

表5 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞ROS含量比較（s）

組別 n劑量/（g/kg） ROS/熒光強(qiáng)度值青齡組 8 6.73±0.45老齡組 8 12.20±1.69**空白血清組 8 11.72±1.76五指毛桃藥物血清組 86 9.74±0.61#

5 討論

五指毛桃始載于清代何克諫《生草藥性備要》“五爪龍，根治熱咳痰火?！币蛐韵矞嘏瘽駶?rùn)的環(huán)境，主要生長(zhǎng)于我國(guó)熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種藥食兩用的植物，其根除用來煲湯還被開發(fā)成多種藥膳及保健品，在廣東、廣西等地廣泛使用。研究表明，五指毛桃可增加大黃所致脾虛模型小鼠的免疫器官胸腺、脾臟的質(zhì)量[4]，且其有效成分補(bǔ)骨脂素具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、抗凝血及抑制腫瘤等作用[5]。免疫系統(tǒng)參與機(jī)體正常的老化過程，是機(jī)體衰老的主要調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一。而T淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，除具有清除外源性病原微生物的作用外還可清除體內(nèi)衰老或畸變細(xì)胞，其與衰老之間關(guān)系研究近年來備受關(guān)注[6]。脾臟是人體重要的免疫器官，能產(chǎn)生大量T淋巴細(xì)胞，為周圍淋巴器官正常發(fā)育和參與機(jī)體免疫所必需，而脾臟指數(shù)是直接反映機(jī)體免疫狀態(tài)的重要參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)使用高、中、低劑量五指毛桃水提物給予老齡小鼠灌胃，測(cè)定小鼠脾臟指數(shù)，旨在確定五指毛桃抗細(xì)胞衰老的有效性。并通過組間比較，確定五指毛桃水提物中劑量為最佳劑量組，再采用中劑量五指毛桃水提物給予青齡小鼠灌胃，制備藥物血清，為后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

衰老是一種復(fù)雜的生理、病理變化過程，此過程包括器官、細(xì)胞和分子等功能的整體衰退。機(jī)體在氧化代謝過程中會(huì)產(chǎn)生各種自由基。自由基一旦過量，超過機(jī)體自身的清除能力，就會(huì)引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA和DNA的氧化損傷，而這些損傷會(huì)導(dǎo)致突變、癌變和衰老的發(fā)生[7]。SOD是一種自由基防御酶，有助于清除人體因代謝失衡產(chǎn)生過多的氧自由基，常作為器官氧化損傷程度評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物且具有細(xì)胞毒性，其含量可間接反映機(jī)體內(nèi)細(xì)胞氧化損傷程度。有研究表明，老齡鼠與青齡鼠比較，SOD活性明顯下降而MDA含量明顯升高[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞中SOD活性較青齡小鼠低，MDA含量較青齡小鼠高，與以往研究相符。經(jīng)五指毛桃藥物血清作用后，SOD活性顯著升高，且MDA含量明顯降低，表明五指毛桃具有明顯抗氧化損傷的作用。

ROS是生物有氧代謝過程中的產(chǎn)物，過高的ROS水平會(huì)對(duì)細(xì)胞和基因結(jié)構(gòu)造成損害。有研究表明，ROS可造成線粒體損傷并引起不可逆性的生長(zhǎng)抑制，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老、死亡[9]。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)度值明顯比青齡小鼠高，五指毛桃藥物血清作用后可明顯降低老齡小鼠體內(nèi)ROS水平，說明其能發(fā)揮良好的抗氧化作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究表明，五指毛桃藥物血清對(duì)老齡小鼠因衰老導(dǎo)致的脾淋巴細(xì)胞氧化損傷具有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制與減少衰老細(xì)胞數(shù)量、提高SOD活性、降低細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量有關(guān)。但其能否在人體內(nèi)更好地發(fā)揮抗氧化作用及發(fā)揮該作用的有效劑量范圍仍需要進(jìn)一步研究。

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Effects of Drug-containing Serum of Ficus Hirta on Oxidative Damage of Spleen Lymphocyte in Aged Mice

YANG Jie1,2, WEI Dong-feng3, WANG Wen-xiao2, CHENG Wei-dong1(1. Institute of Traditional

Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; 2. School of Basic Medical Science of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 3. Institute of Basic Research in Clinical Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

Objective To study the effects of drug-containing serum of Ficus Hirta on oxidative damage of spleen lymphocyte due to aging in aged mice; To discuss its mechanism of action. Methods Forty aged mice were randomly divided into control group and high-, medium- and low-dose Ficus Hirta groups. Control group was given 0.9% sodium chloride solution for gavage, while high-, medium- and low-dose Ficus Hirta groups were given 6.6, 4.4, and 2.2 g/kg aqueous extract of Ficus Hirta for gavage. The spleen index was observed for optimum dose in aged mice. The optimum time and dilution of drug-containing serum of Ficus Hirta were confirmed by MTT method in lymphocyte proliferation test. The positive rate of senescent cells, the activity of T-SOD and the contents of MDA and ROS were determined in cellular antioxidant experiment after treated by optimal drug-containing serum for 48 h. Results Compared with the control group, the spleen index was significantly improved in high-, medium- and low-dose Ficus Hirta groups (P<0.05, P<0.01). 20% drug-containing serum of Ficus Hirta cultivated for 48 h had the best effects on lymphocyte proliferation in aged mice. 20% drug-containing serum of Ficus Hirta could significantly decrease the positive rate of senescent cells (P<0.01), improve T-SOD activity and decrease the contents of MDA and ROS (P<0.05, P<0.01). Conclusion The drug-containing serum of Ficus Hirta can improve the proliferative activity of spleen lymphocyte in aged mice and the mechanism of action may be involved in decreasing the positive rate of senescent cells and increasing antioxidant ability of lymphocyte.

Ficus Hirta; drug-containing serum; spleen lymphocytes; aging; oxidative damage; aged mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.012

R285.5

A

1005-5304(2016)01-0052-04

2015-04-12）

（

2015-10-23；編輯：華強(qiáng)）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373806)；甘肅省中醫(yī)藥管理局普通課題(GZK-2012-43)

程衛(wèi)東，E-mail：chengweidong888@sina.com