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    青藤堿關節(jié)腔注射對膝骨關節(jié)炎兔軟骨和滑膜組織形態(tài)學及基質(zhì)金屬蛋白酶-13和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的影響

    2016-12-19 08:23:53鄭潔王瑞輝寇久社
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2016年1期
    關鍵詞:堿組青藤透明質(zhì)

    鄭潔,王瑞輝,寇久社

    1.陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,陜西 咸陽 712046;2.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712046

    青藤堿關節(jié)腔注射對膝骨關節(jié)炎兔軟骨和滑膜組織形態(tài)學及基質(zhì)金屬蛋白酶-13和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的影響

    鄭潔1,王瑞輝1,寇久社2

    1.陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,陜西 咸陽 712046;2.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712046

    目的 觀察青藤堿關節(jié)腔注射對膝骨關節(jié)炎模型兔關節(jié)軟骨和滑膜組織形態(tài)學及血清和關節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)含量的影響,探討青藤堿治療膝骨關節(jié)炎的部分作用機制。方法 38只新西蘭大白兔隨機分為空白組、模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組。空白組不予任何處理,模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組通過木瓜蛋白酶關節(jié)腔注射法誘導膝骨關節(jié)炎模型后,分別用生理鹽水、透明質(zhì)酸鈉和青藤堿干預。5周后取關節(jié)軟骨及滑膜HE染色并進行組織學評分,ELISA檢測血清及關節(jié)液中MMP-13和COMP的含量。結果 模型組軟骨Mankin's評分和滑膜組織病理學評分顯著高于空白組,青藤堿組軟骨Mankin's評分和滑膜組織病理學評分顯著低于模型組(P<0.01);模型組血清及關節(jié)液中MMP-13和COMP含量較空白組顯著升高(P<0.01);青藤堿組血清、關節(jié)液中MMP-13含量較模型組顯著降低,關節(jié)液中COMP含量較模型組降低(P<0.05,P<0.01)。結論 青藤堿具有改善滑膜炎癥、延緩關節(jié)軟骨退變進程的作用。

    青藤堿;骨關節(jié)炎;形態(tài)學;基質(zhì)金屬蛋白酶-13;軟骨寡聚基質(zhì)蛋白;兔

    骨性關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一類以關節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)進行性破壞為特點,并伴有滑膜、軟骨下骨及關節(jié)周圍組織病變的復雜性關節(jié)疾病。由于病理機制不明確,目前無有效方法可完全阻止OA的病理進程。青藤堿是從中藥青風藤中提取的一種生物堿,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、抗心律失常等藥理作用[1]。青藤堿在骨關節(jié)病中的臨床及實驗研究目前仍主要集中在類風濕關節(jié)炎,而應用于OA的研究較少。本實驗通過觀察鹽酸青藤堿關節(jié)腔注射對膝骨關節(jié)炎模型兔軟骨及滑膜形態(tài)學的影響,并檢測血清及關節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)的含量,探討青藤堿治療膝骨關節(jié)炎的部分作用機制。

    1 實驗材料

    1.1 動物

    新西蘭大白兔40只,4~6月齡,雌雄各半,體質(zhì)量1.8~2.2 kg,西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心,合格證號SCXK(陜)2008-008。單籠、標準飼料喂養(yǎng),室溫20~25 ℃,相對濕度45%~60%,每日正常光照,空氣流通,自由攝食、飲水。

    1.2 藥物

    MMP-13、COMP ELISA試劑盒(北京諾博萊科技有限公司),正清風痛寧注射液(主要成分鹽酸青藤堿),湖南正清制藥集團股份有限公司,批號1304402-003;玻璃酸鈉注射液,山東博士倫福瑞達制藥有限公司,批號130308011。

    1.3 主要試劑與儀器

    木瓜蛋白酶,Merck公司,貨號107147。超薄切片機(德國LEICA公司),ELX808型酶標儀(美國Bio-Tec公司)。

    2 實驗方法

    2.1 造模、分組及干預

    40只兔先分為空白組(8只)和造模組(32只),采用木瓜蛋白酶注射法造模。造模組于實驗第1、4、7日兔右膝關節(jié)腔注射4%(20 mg)木瓜蛋白酶溶液0.5 mL,首次注射4周后隨機處死2只兔,病理學觀察出現(xiàn)典型軟骨退變表現(xiàn),同時兔出現(xiàn)右膝關節(jié)腫脹、跛行,表明造模成功。造模組再隨機分為模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組,每組10只。根據(jù)成人用藥劑量(透明質(zhì)酸鈉和青藤堿均為2 mL/次)按Meeh-Rubner公式計算人兔等效劑量。除空白組外,各組兔造模側膝關節(jié)行關節(jié)腔注射,青藤堿組膝關節(jié)腔注射鹽酸青藤堿注射液0.2 mL(5 mg),每3 d注射1次,共給藥10次;透明質(zhì)酸鈉組膝關節(jié)腔注射透明質(zhì)酸鈉注射液0.2 mL,每6 d注射1次,共給藥5次;模型組膝關節(jié)腔注射生理鹽水0.2 mL,注射次數(shù)同青藤堿組。干預時間共計30 d。實驗過程中對動物的處理方法符合中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

    2.2 取材及標本處理

    2.2.1 關節(jié)液采集 干預結束后,生理鹽水沖洗收集關節(jié)液。于兔右膝關節(jié)腔內(nèi)注入生理鹽水1 mL,充分活動膝關節(jié)使生理鹽水與關節(jié)液充分混合,再抽取關節(jié)腔內(nèi)生理鹽水0.6~1 mL至EP管,4000 r/min離心10 min,取上清液,-80 ℃保存?zhèn)錂z。

    2.2.2 滑膜采集 關節(jié)液標本采集完畢后,耳源靜脈空氣栓塞法處死全部實驗動物。采用髕旁內(nèi)外并橫斷骸韌帶的聯(lián)合切口,將軟組織瓣包括髕骨一起向上翻起,并極度屈膝以充分顯露膝關節(jié)腔,肉眼觀察滑膜、軟骨等大體情況并記錄,取右膝髕骨下滑膜組織,以冰生理鹽水沖洗后置10%中性甲醛中固定48 h,石蠟包埋,常規(guī)切片備用。

    2.3 軟骨組織形態(tài)學觀察及評分

    造模側內(nèi)側脛骨平臺標本HE染色。光學顯微鏡下觀察軟骨組織結構,每張切片選擇3個不同的視野,并參照Mankin's關節(jié)軟骨病理評分標準[2]進行評分并統(tǒng)計。評分標準見表1。

    表1 骨性關節(jié)炎軟骨組織病理學分級評分(Mankin's)標準

    2.4 滑膜組織形態(tài)學觀察

    造模側髕骨下滑膜標本HE染色。每張切片選擇3個不同的視野,對滑膜里襯層細胞及滑膜下組織進行觀察并評分。滑膜里襯層細胞觀察內(nèi)容為增生、肥大和炎細胞浸潤,滑膜下組織觀察內(nèi)容為肉芽組織增生、血管組織長入和炎細胞浸潤,評分標準均按無、輕、中和重分別計0、1、2、3分[3]。

    2.5 基質(zhì)金屬蛋白酶-13、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白含量測定

    ELISA檢測血清和關節(jié)液中MMP-13和COMP的含量,嚴格按著試劑盒說明進行操作。

    3 統(tǒng)計學方法

    4 結果

    4.1 一般情況

    實驗過程中,模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組各死亡1只兔,最終共35只兔進入實驗。各組兔精神狀態(tài)良好,進食正常,體質(zhì)量均有所增加,以模型組最為明顯。木瓜蛋白酶注射后,所有造模組兔均出現(xiàn)明顯的患膝腫脹,膝關節(jié)主、被動活動范圍下降,行走時患腿負重減少,鹽酸青藤堿和透明質(zhì)酸鈉干預后以上癥狀、體征明顯改善。

    4.2 軟骨大體觀察

    軟骨肉眼觀察發(fā)現(xiàn),各組兔內(nèi)側脛骨平臺磨損均明顯重于股骨內(nèi)髁,可能與兔膝關節(jié)受力機制有關??瞻捉M關節(jié)軟骨表面呈淺藍白色,光滑而有光澤,無糜爛,有一定彈性;模型組關節(jié)軟骨表面粗糙,色澤變暗,伴有裂紋、糜爛,部分軟骨下骨質(zhì)暴露;透明質(zhì)酸鈉組關節(jié)軟骨表面欠光滑,部分可見裂紋,尚未見軟骨下骨質(zhì)暴露;青藤堿組關節(jié)軟骨略粗糙,糜爛程度較透明質(zhì)酸鈉組輕。

    4.3 軟骨病理觀察結果

    空白組關節(jié)軟骨結構層次清晰,表層完整光滑,染色均勻,軟骨分布均勻;模型組軟骨塌陷,層次嚴重紊亂,細胞顯著減少,潮線無法辨清;透明質(zhì)酸鈉組軟骨表面不完整,出現(xiàn)多處裂隙達放射深層,病變局部軟骨細胞增多,潮線完整,病理變化較模型組有所減輕;青藤堿組軟骨層次清晰可辨,部分裂隙達放射淺層,細胞彌漫性增多,潮線完整。結果見圖1。

    圖1 各組兔軟骨切片HE染色(×400)

    4.4 軟骨組織病理評分結果

    模型組Mankin's評分高于其他3組,青藤堿組與透明質(zhì)酸鈉組評分比較差異無統(tǒng)計學意義,提示青藤堿與透明質(zhì)酸鈉均能不同程度延緩OA軟骨退變進程,對OA軟骨具有保護作用。結果見表2。

    表2 各組兔軟骨Mankin's評分比較(±s)

    表2 各組兔軟骨Mankin's評分比較(±s)

    注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01(下同)

    組別 只數(shù) 分值空白組 8 1.60±0.55模型組 9 9.00±0.71**透明質(zhì)酸鈉組 9 5.80±0.84**##青藤堿組 9 6.20±0.45**##

    4.5 滑膜組織形態(tài)學觀察及評分

    肉眼觀察顯示,空白組滑膜未見明顯改變;模型組滑膜充血腫脹,關節(jié)液較其他各組明顯增多,顏色發(fā)黃、質(zhì)稠;透明質(zhì)酸鈉組滑膜輕度腫脹,關節(jié)液較空白組有所增加;青藤堿組滑膜稍有腫脹,關節(jié)液較為清亮,量明顯少于模型組和透明質(zhì)酸鈉組,見圖2??瞻捉M無炎性細胞,滑膜薄而細胞數(shù)少;模型組滑膜明顯增厚,全層均有顯著炎細胞浸潤,滑膜下層有肉芽組織生成,并可見淋巴管形成;透明質(zhì)酸鈉組滑膜里襯層稍增厚,滑膜細胞輕度肥大,并有顯著炎細胞浸潤;青藤堿組僅里襯層稍有炎細胞浸潤。模型組滑膜評分顯著高于其他3組(P<0.01);青藤堿組評分明顯低于透明質(zhì)酸鈉組(P<0.05),與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義。結果見表3。

    圖2 各組兔滑膜組織HE染色(×200)

    表3 各組兔滑膜組織形態(tài)學評分比較(s)

    表3 各組兔滑膜組織形態(tài)學評分比較(s)

    注:與透明質(zhì)酸鈉組比較,△P<0.05

    組別 只數(shù) 分值空白組 8 0.80±0.84模型組 9 9.60±0.90**透明質(zhì)酸鈉組 9 4.40±1.14**##青藤堿組 9 2.00±0.71##△

    4.6 青藤堿對兔血清及關節(jié)液基質(zhì)金屬蛋白酶-13、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白含量的影響

    模型組、青藤堿組和透明質(zhì)酸鈉組血清及關節(jié)液中MMP-13水平較空白組顯著升高(P<0.01),但青藤堿組和透明質(zhì)酸鈉組低于模型組(P<0.05,P<0.01),青藤堿組血清及關節(jié)液中MMP-13水平略高于透明質(zhì)酸鈉組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組血清COMP水平均無明顯差異。模型組關節(jié)液COMP水平較空白組顯著升高(P<0.01);青藤堿組和透明質(zhì)酸鈉組關節(jié)液COMP水平顯著低于模型組(P<0.01)。結果見表4。

    組別 只數(shù) MMP-13 COMP血清 關節(jié)液 血清 關節(jié)液空白組 8 22.28±1.42 24.23±2.32 0.87±0.09 0.91±0.72模型組 9 28.79±2.26**31.25±2.43**0.89±0.65 1.19±0.12**透明質(zhì)酸鈉組 9 24.97±1.48**#28.53±1.80**##0.87±0.12 1.04±0.12##青藤堿組 9 25.27±1.50**#28.67±2.38**##0.92±0.11 1.04±0.10##

    5 討論

    關節(jié)軟骨由軟骨細胞和細胞外基質(zhì)構成。細胞基質(zhì)的主要成分是蛋白多糖和膠原,其中Ⅱ型膠原是軟骨主要的膠原成分,占軟骨干重60%,維持著軟骨的生物力學性能。MMPs是一組能夠降解細胞外基質(zhì)的內(nèi)肽酶,在OA軟骨基質(zhì)降解期發(fā)揮重要作用[4]。其中MMP-13是Ⅱ型膠原最有效的降解酶,文獻報道,MMP-13在OA軟骨細胞及滑膜組織均呈高表達[5],OA患者患膝關節(jié)液MMP-13水平顯著升高[6]。研究發(fā)現(xiàn),MMP-13基因缺陷可抑制抗體誘導的C57 OA小鼠關節(jié)局部炎性反應,對軟骨具有保護作用,提示除了對軟骨基質(zhì)的降解作用,MMP-13還可通過促進炎性反應加速OA軟骨退變進程[7]。COMP是關節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)的一種大分子,屬于凝血栓蛋白家族,其具體功能目前還不十分明確。有研究發(fā)現(xiàn),通過與膠原纖維及細胞外基質(zhì)成分相互作用,COMP在軟骨內(nèi)骨化及維持細胞外基質(zhì)穩(wěn)定中發(fā)揮了重要作用[8]。COMP通過促進膠原分子早期關聯(lián)進而加快原纖維合成,影響Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的形成;COMP還可與蛋白聚糖結合,維持軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)[8]。OA患者血清及關節(jié)液中COMP水平顯著升高[9-10],因此,COMP被認為是OA關節(jié)軟骨破壞的生物學標志物。

    青風藤為防己科藤本植物青藤的藤莖,性味辛、苦、溫,入肝、脾經(jīng),具有祛風濕、通經(jīng)絡等功效。青藤堿是青風藤的主要活性成分。文獻報道,青藤堿膝關節(jié)腔注射可降低關節(jié)液中炎性因子含量,延緩軟骨退變進程,提示青藤堿對OA軟骨具有保護作用,其機制可能與其抗炎作用有關[11-13]。本實驗病理學觀察顯示,青藤堿關節(jié)腔注射后Mankin's評分及滑膜評分均明顯降低;ELISA檢測發(fā)現(xiàn),青藤堿關節(jié)腔注射可降低關節(jié)液MMP-13和COMP水平。

    綜上表明,青藤堿膝關節(jié)腔注射對OA關節(jié)軟骨具有保護作用,其機制可能與抑制滑膜炎性反應、降低MMP-13表達有關。

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    Effects of Intra-articular Injection of Sinomenine on Morphology, MMP-13 Level and Cartilage Oligomeric Matrix Protein of Rabbit Knee Osteoarthritis Model


    ZHENG Jie1,

    WANG Rui-hui1, KOU Jiu-she2(1. College of Acupunture and Moxibustion, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China; 2. Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)

    Objective To observe the effects of intra-articular injection of sinomenine on morphology of synovium and cartilage as well as contents of MMP-13 and cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in serum and synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis model. Methods A total of 38 New Zealand white rabbits were randomly divided into 4 groups: control group, model group, hyaluronate group and sinomenine group. Model group, hyaluronate group and sinomenine group established knee osteoarthritis model by intra-articular injection of papain enzyme, and were treated with saline, sodium hyaluronate and sinomenine respectively except for control group. 5 weeks after treatment, all rabbits were sacrificed for HE staining and histological grading on cartilago articularis and synovium, and ELISA method was used to detect the contents of MMP-13 and COMP in rabbit serum and synovial fluid. Results Mankin's scores of articular cartilage and histological scores of synovium in model group were significantly higher than those of control group (P<0.01), and were markedly lower in sinomenine group than those of model group (P<0.01); the contents of MMP-13 and COMP in serum and synovial fluid of model group were significantly raised compared with control group (P<0.01), and were reduced obviously in sinomenine group compared with model group (P<0.05, P<0.01). Conclusion Intra-articular injection of sinomenine can reduce the levels of MMP-13 and COMP in serum and synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis model, and improve synovial inflammation, as well as delay the degradation of articular cartilage.

    sinomenine; osteoarthritis; morphology; MMP-13; cartilage oligomeric matrix protein; rabbits

    10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.017

    R285.5

    A

    1005-5304(2016)01-0074-04

    2015-04-27)

    (

    2015-10-19;編輯:華強)

    陜西省教育廳科學研究項目(14JK1209);陜西省中醫(yī)康復學重點學科建設項目(2011年);陜西中醫(yī)學院創(chuàng)新基金培育項目(14XJZR27)

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