• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    青藤堿關節(jié)腔注射對膝骨關節(jié)炎兔軟骨和滑膜組織形態(tài)學及基質(zhì)金屬蛋白酶-13和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的影響

    2016-12-19 08:23:53鄭潔王瑞輝寇久社
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2016年1期
    關鍵詞:堿組青藤透明質(zhì)

    鄭潔,王瑞輝,寇久社

    1.陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,陜西 咸陽 712046;2.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712046

    青藤堿關節(jié)腔注射對膝骨關節(jié)炎兔軟骨和滑膜組織形態(tài)學及基質(zhì)金屬蛋白酶-13和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的影響

    鄭潔1,王瑞輝1,寇久社2

    1.陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,陜西 咸陽 712046;2.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712046

    目的 觀察青藤堿關節(jié)腔注射對膝骨關節(jié)炎模型兔關節(jié)軟骨和滑膜組織形態(tài)學及血清和關節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)含量的影響,探討青藤堿治療膝骨關節(jié)炎的部分作用機制。方法 38只新西蘭大白兔隨機分為空白組、模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組。空白組不予任何處理,模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組通過木瓜蛋白酶關節(jié)腔注射法誘導膝骨關節(jié)炎模型后,分別用生理鹽水、透明質(zhì)酸鈉和青藤堿干預。5周后取關節(jié)軟骨及滑膜HE染色并進行組織學評分,ELISA檢測血清及關節(jié)液中MMP-13和COMP的含量。結果 模型組軟骨Mankin's評分和滑膜組織病理學評分顯著高于空白組,青藤堿組軟骨Mankin's評分和滑膜組織病理學評分顯著低于模型組(P<0.01);模型組血清及關節(jié)液中MMP-13和COMP含量較空白組顯著升高(P<0.01);青藤堿組血清、關節(jié)液中MMP-13含量較模型組顯著降低,關節(jié)液中COMP含量較模型組降低(P<0.05,P<0.01)。結論 青藤堿具有改善滑膜炎癥、延緩關節(jié)軟骨退變進程的作用。

    青藤堿;骨關節(jié)炎;形態(tài)學;基質(zhì)金屬蛋白酶-13;軟骨寡聚基質(zhì)蛋白;兔

    骨性關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一類以關節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)進行性破壞為特點,并伴有滑膜、軟骨下骨及關節(jié)周圍組織病變的復雜性關節(jié)疾病。由于病理機制不明確,目前無有效方法可完全阻止OA的病理進程。青藤堿是從中藥青風藤中提取的一種生物堿,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、抗心律失常等藥理作用[1]。青藤堿在骨關節(jié)病中的臨床及實驗研究目前仍主要集中在類風濕關節(jié)炎,而應用于OA的研究較少。本實驗通過觀察鹽酸青藤堿關節(jié)腔注射對膝骨關節(jié)炎模型兔軟骨及滑膜形態(tài)學的影響,并檢測血清及關節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)的含量,探討青藤堿治療膝骨關節(jié)炎的部分作用機制。

    1 實驗材料

    1.1 動物

    新西蘭大白兔40只,4~6月齡,雌雄各半,體質(zhì)量1.8~2.2 kg,西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心,合格證號SCXK(陜)2008-008。單籠、標準飼料喂養(yǎng),室溫20~25 ℃,相對濕度45%~60%,每日正常光照,空氣流通,自由攝食、飲水。

    1.2 藥物

    MMP-13、COMP ELISA試劑盒(北京諾博萊科技有限公司),正清風痛寧注射液(主要成分鹽酸青藤堿),湖南正清制藥集團股份有限公司,批號1304402-003;玻璃酸鈉注射液,山東博士倫福瑞達制藥有限公司,批號130308011。

    1.3 主要試劑與儀器

    木瓜蛋白酶,Merck公司,貨號107147。超薄切片機(德國LEICA公司),ELX808型酶標儀(美國Bio-Tec公司)。

    2 實驗方法

    2.1 造模、分組及干預

    40只兔先分為空白組(8只)和造模組(32只),采用木瓜蛋白酶注射法造模。造模組于實驗第1、4、7日兔右膝關節(jié)腔注射4%(20 mg)木瓜蛋白酶溶液0.5 mL,首次注射4周后隨機處死2只兔,病理學觀察出現(xiàn)典型軟骨退變表現(xiàn),同時兔出現(xiàn)右膝關節(jié)腫脹、跛行,表明造模成功。造模組再隨機分為模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組,每組10只。根據(jù)成人用藥劑量(透明質(zhì)酸鈉和青藤堿均為2 mL/次)按Meeh-Rubner公式計算人兔等效劑量。除空白組外,各組兔造模側膝關節(jié)行關節(jié)腔注射,青藤堿組膝關節(jié)腔注射鹽酸青藤堿注射液0.2 mL(5 mg),每3 d注射1次,共給藥10次;透明質(zhì)酸鈉組膝關節(jié)腔注射透明質(zhì)酸鈉注射液0.2 mL,每6 d注射1次,共給藥5次;模型組膝關節(jié)腔注射生理鹽水0.2 mL,注射次數(shù)同青藤堿組。干預時間共計30 d。實驗過程中對動物的處理方法符合中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

    2.2 取材及標本處理

    2.2.1 關節(jié)液采集 干預結束后,生理鹽水沖洗收集關節(jié)液。于兔右膝關節(jié)腔內(nèi)注入生理鹽水1 mL,充分活動膝關節(jié)使生理鹽水與關節(jié)液充分混合,再抽取關節(jié)腔內(nèi)生理鹽水0.6~1 mL至EP管,4000 r/min離心10 min,取上清液,-80 ℃保存?zhèn)錂z。

    2.2.2 滑膜采集 關節(jié)液標本采集完畢后,耳源靜脈空氣栓塞法處死全部實驗動物。采用髕旁內(nèi)外并橫斷骸韌帶的聯(lián)合切口,將軟組織瓣包括髕骨一起向上翻起,并極度屈膝以充分顯露膝關節(jié)腔,肉眼觀察滑膜、軟骨等大體情況并記錄,取右膝髕骨下滑膜組織,以冰生理鹽水沖洗后置10%中性甲醛中固定48 h,石蠟包埋,常規(guī)切片備用。

    2.3 軟骨組織形態(tài)學觀察及評分

    造模側內(nèi)側脛骨平臺標本HE染色。光學顯微鏡下觀察軟骨組織結構,每張切片選擇3個不同的視野,并參照Mankin's關節(jié)軟骨病理評分標準[2]進行評分并統(tǒng)計。評分標準見表1。

    表1 骨性關節(jié)炎軟骨組織病理學分級評分(Mankin's)標準

    2.4 滑膜組織形態(tài)學觀察

    造模側髕骨下滑膜標本HE染色。每張切片選擇3個不同的視野,對滑膜里襯層細胞及滑膜下組織進行觀察并評分。滑膜里襯層細胞觀察內(nèi)容為增生、肥大和炎細胞浸潤,滑膜下組織觀察內(nèi)容為肉芽組織增生、血管組織長入和炎細胞浸潤,評分標準均按無、輕、中和重分別計0、1、2、3分[3]。

    2.5 基質(zhì)金屬蛋白酶-13、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白含量測定

    ELISA檢測血清和關節(jié)液中MMP-13和COMP的含量,嚴格按著試劑盒說明進行操作。

    3 統(tǒng)計學方法

    4 結果

    4.1 一般情況

    實驗過程中,模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組各死亡1只兔,最終共35只兔進入實驗。各組兔精神狀態(tài)良好,進食正常,體質(zhì)量均有所增加,以模型組最為明顯。木瓜蛋白酶注射后,所有造模組兔均出現(xiàn)明顯的患膝腫脹,膝關節(jié)主、被動活動范圍下降,行走時患腿負重減少,鹽酸青藤堿和透明質(zhì)酸鈉干預后以上癥狀、體征明顯改善。

    4.2 軟骨大體觀察

    軟骨肉眼觀察發(fā)現(xiàn),各組兔內(nèi)側脛骨平臺磨損均明顯重于股骨內(nèi)髁,可能與兔膝關節(jié)受力機制有關??瞻捉M關節(jié)軟骨表面呈淺藍白色,光滑而有光澤,無糜爛,有一定彈性;模型組關節(jié)軟骨表面粗糙,色澤變暗,伴有裂紋、糜爛,部分軟骨下骨質(zhì)暴露;透明質(zhì)酸鈉組關節(jié)軟骨表面欠光滑,部分可見裂紋,尚未見軟骨下骨質(zhì)暴露;青藤堿組關節(jié)軟骨略粗糙,糜爛程度較透明質(zhì)酸鈉組輕。

    4.3 軟骨病理觀察結果

    空白組關節(jié)軟骨結構層次清晰,表層完整光滑,染色均勻,軟骨分布均勻;模型組軟骨塌陷,層次嚴重紊亂,細胞顯著減少,潮線無法辨清;透明質(zhì)酸鈉組軟骨表面不完整,出現(xiàn)多處裂隙達放射深層,病變局部軟骨細胞增多,潮線完整,病理變化較模型組有所減輕;青藤堿組軟骨層次清晰可辨,部分裂隙達放射淺層,細胞彌漫性增多,潮線完整。結果見圖1。

    圖1 各組兔軟骨切片HE染色(×400)

    4.4 軟骨組織病理評分結果

    模型組Mankin's評分高于其他3組,青藤堿組與透明質(zhì)酸鈉組評分比較差異無統(tǒng)計學意義,提示青藤堿與透明質(zhì)酸鈉均能不同程度延緩OA軟骨退變進程,對OA軟骨具有保護作用。結果見表2。

    表2 各組兔軟骨Mankin's評分比較(±s)

    表2 各組兔軟骨Mankin's評分比較(±s)

    注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01(下同)

    組別 只數(shù) 分值空白組 8 1.60±0.55模型組 9 9.00±0.71**透明質(zhì)酸鈉組 9 5.80±0.84**##青藤堿組 9 6.20±0.45**##

    4.5 滑膜組織形態(tài)學觀察及評分

    肉眼觀察顯示,空白組滑膜未見明顯改變;模型組滑膜充血腫脹,關節(jié)液較其他各組明顯增多,顏色發(fā)黃、質(zhì)稠;透明質(zhì)酸鈉組滑膜輕度腫脹,關節(jié)液較空白組有所增加;青藤堿組滑膜稍有腫脹,關節(jié)液較為清亮,量明顯少于模型組和透明質(zhì)酸鈉組,見圖2??瞻捉M無炎性細胞,滑膜薄而細胞數(shù)少;模型組滑膜明顯增厚,全層均有顯著炎細胞浸潤,滑膜下層有肉芽組織生成,并可見淋巴管形成;透明質(zhì)酸鈉組滑膜里襯層稍增厚,滑膜細胞輕度肥大,并有顯著炎細胞浸潤;青藤堿組僅里襯層稍有炎細胞浸潤。模型組滑膜評分顯著高于其他3組(P<0.01);青藤堿組評分明顯低于透明質(zhì)酸鈉組(P<0.05),與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義。結果見表3。

    圖2 各組兔滑膜組織HE染色(×200)

    表3 各組兔滑膜組織形態(tài)學評分比較(s)

    表3 各組兔滑膜組織形態(tài)學評分比較(s)

    注:與透明質(zhì)酸鈉組比較,△P<0.05

    組別 只數(shù) 分值空白組 8 0.80±0.84模型組 9 9.60±0.90**透明質(zhì)酸鈉組 9 4.40±1.14**##青藤堿組 9 2.00±0.71##△

    4.6 青藤堿對兔血清及關節(jié)液基質(zhì)金屬蛋白酶-13、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白含量的影響

    模型組、青藤堿組和透明質(zhì)酸鈉組血清及關節(jié)液中MMP-13水平較空白組顯著升高(P<0.01),但青藤堿組和透明質(zhì)酸鈉組低于模型組(P<0.05,P<0.01),青藤堿組血清及關節(jié)液中MMP-13水平略高于透明質(zhì)酸鈉組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組血清COMP水平均無明顯差異。模型組關節(jié)液COMP水平較空白組顯著升高(P<0.01);青藤堿組和透明質(zhì)酸鈉組關節(jié)液COMP水平顯著低于模型組(P<0.01)。結果見表4。

    組別 只數(shù) MMP-13 COMP血清 關節(jié)液 血清 關節(jié)液空白組 8 22.28±1.42 24.23±2.32 0.87±0.09 0.91±0.72模型組 9 28.79±2.26**31.25±2.43**0.89±0.65 1.19±0.12**透明質(zhì)酸鈉組 9 24.97±1.48**#28.53±1.80**##0.87±0.12 1.04±0.12##青藤堿組 9 25.27±1.50**#28.67±2.38**##0.92±0.11 1.04±0.10##

    5 討論

    關節(jié)軟骨由軟骨細胞和細胞外基質(zhì)構成。細胞基質(zhì)的主要成分是蛋白多糖和膠原,其中Ⅱ型膠原是軟骨主要的膠原成分,占軟骨干重60%,維持著軟骨的生物力學性能。MMPs是一組能夠降解細胞外基質(zhì)的內(nèi)肽酶,在OA軟骨基質(zhì)降解期發(fā)揮重要作用[4]。其中MMP-13是Ⅱ型膠原最有效的降解酶,文獻報道,MMP-13在OA軟骨細胞及滑膜組織均呈高表達[5],OA患者患膝關節(jié)液MMP-13水平顯著升高[6]。研究發(fā)現(xiàn),MMP-13基因缺陷可抑制抗體誘導的C57 OA小鼠關節(jié)局部炎性反應,對軟骨具有保護作用,提示除了對軟骨基質(zhì)的降解作用,MMP-13還可通過促進炎性反應加速OA軟骨退變進程[7]。COMP是關節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)的一種大分子,屬于凝血栓蛋白家族,其具體功能目前還不十分明確。有研究發(fā)現(xiàn),通過與膠原纖維及細胞外基質(zhì)成分相互作用,COMP在軟骨內(nèi)骨化及維持細胞外基質(zhì)穩(wěn)定中發(fā)揮了重要作用[8]。COMP通過促進膠原分子早期關聯(lián)進而加快原纖維合成,影響Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的形成;COMP還可與蛋白聚糖結合,維持軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)[8]。OA患者血清及關節(jié)液中COMP水平顯著升高[9-10],因此,COMP被認為是OA關節(jié)軟骨破壞的生物學標志物。

    青風藤為防己科藤本植物青藤的藤莖,性味辛、苦、溫,入肝、脾經(jīng),具有祛風濕、通經(jīng)絡等功效。青藤堿是青風藤的主要活性成分。文獻報道,青藤堿膝關節(jié)腔注射可降低關節(jié)液中炎性因子含量,延緩軟骨退變進程,提示青藤堿對OA軟骨具有保護作用,其機制可能與其抗炎作用有關[11-13]。本實驗病理學觀察顯示,青藤堿關節(jié)腔注射后Mankin's評分及滑膜評分均明顯降低;ELISA檢測發(fā)現(xiàn),青藤堿關節(jié)腔注射可降低關節(jié)液MMP-13和COMP水平。

    綜上表明,青藤堿膝關節(jié)腔注射對OA關節(jié)軟骨具有保護作用,其機制可能與抑制滑膜炎性反應、降低MMP-13表達有關。

    [1] 季宇彬.中藥有效成分藥理與應用[M].哈爾濱:黑龍江科學技術出版社,1995:427.

    [2] MANKIN H J, DORFMAN H, LIPPIELLO L, et al. Biochemical and metabolicabnormalities in articular cartilage from osteoarthritic human hips.Ⅱ.Correlation of morphology with biochemical and metabolic data[J]. Bone Joint Surg,1971,53(3):523-531.

    [3] PRITZKER K P, GAY S, JIMENE Z S A, et al. Osteoarthritis cartilage histopathology:grading and staging[J]. Osteoarthritis Cartilage,2006,14(1):13-29.

    [4] RONG Z, CHENG L, REN Y, et al. Interleukin-17F signaling requires ubiquitination of interleukin-17 receptor viaTRAF6[J]. Cell Signal,2007,19(7):1514-1520.

    [5] LU J, SUN Y, GE Q, et al. Histone deacetylase 4 alters cartilage homeostasis in human osteoarthritis[J]. BMC Musculoskelet Disord,2014,15(12):438.

    [6] 侯亞平.膝骨關節(jié)炎患者滑液中炎癥因子的表達及其與中醫(yī)證型的相關性分析[J].湖南中醫(yī)藥大學學報,2014,34(4):29-31.

    [7] SINGH A, RAJASEKARAN N, HARTENSTEIN B, et al. Collagenase-3 (MMP-13) deficiency protects C57BL/6 mice from antibody-induced arthritis[J]. Arthritis Research & Therapy,2013,15(6):R222. [8] HALASZ K, KASSNER A, MORGELIN M, et al. COMP acts as a catalyst in collagen fibrillogenesis[J]. J Biol Chem,2007,282(43):31166-31173.

    [9] 李恒,王丹,武中慶,等.血清COMP在骨關節(jié)炎早期診斷中的作用[J].中國骨傷,2012,25(5):380-383.

    [10] 王曉濱,薛慶云.骨關節(jié)炎患者滑液中COMP水平與病情嚴重程度的相關性研究[J].中國骨與關節(jié)外科,2012,5(1):60-64.

    [11] 楊惠琴,陳禮榮.青藤堿對膝骨性關節(jié)炎實驗兔關節(jié)液及血清白細胞介素-1β含量的影響[J].中西醫(yī)結合學報,2008,6(12):1275-1279.[12] 楊惠琴,陳禮榮.青藤堿對膝骨性關節(jié)炎實驗兔關節(jié)液及血清中TNF-α水平的影響[J].中華物理醫(yī)學與康復雜志,2008,30(7):448-450.

    [13] 吳紅娟,孫必強,朱傳湘,等.鹽酸青藤堿對家兔骨關節(jié)炎關節(jié)液IL-1β、PGE2生成與關節(jié)組織結構的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報, 2010,30(9):84-86.

    Effects of Intra-articular Injection of Sinomenine on Morphology, MMP-13 Level and Cartilage Oligomeric Matrix Protein of Rabbit Knee Osteoarthritis Model


    ZHENG Jie1,

    WANG Rui-hui1, KOU Jiu-she2(1. College of Acupunture and Moxibustion, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China; 2. Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)

    Objective To observe the effects of intra-articular injection of sinomenine on morphology of synovium and cartilage as well as contents of MMP-13 and cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in serum and synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis model. Methods A total of 38 New Zealand white rabbits were randomly divided into 4 groups: control group, model group, hyaluronate group and sinomenine group. Model group, hyaluronate group and sinomenine group established knee osteoarthritis model by intra-articular injection of papain enzyme, and were treated with saline, sodium hyaluronate and sinomenine respectively except for control group. 5 weeks after treatment, all rabbits were sacrificed for HE staining and histological grading on cartilago articularis and synovium, and ELISA method was used to detect the contents of MMP-13 and COMP in rabbit serum and synovial fluid. Results Mankin's scores of articular cartilage and histological scores of synovium in model group were significantly higher than those of control group (P<0.01), and were markedly lower in sinomenine group than those of model group (P<0.01); the contents of MMP-13 and COMP in serum and synovial fluid of model group were significantly raised compared with control group (P<0.01), and were reduced obviously in sinomenine group compared with model group (P<0.05, P<0.01). Conclusion Intra-articular injection of sinomenine can reduce the levels of MMP-13 and COMP in serum and synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis model, and improve synovial inflammation, as well as delay the degradation of articular cartilage.

    sinomenine; osteoarthritis; morphology; MMP-13; cartilage oligomeric matrix protein; rabbits

    10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.017

    R285.5

    A

    1005-5304(2016)01-0074-04

    2015-04-27)

    (

    2015-10-19;編輯:華強)

    陜西省教育廳科學研究項目(14JK1209);陜西省中醫(yī)康復學重點學科建設項目(2011年);陜西中醫(yī)學院創(chuàng)新基金培育項目(14XJZR27)

    猜你喜歡
    堿組青藤透明質(zhì)
    透明質(zhì)酸衍生物的研究進展
    云南化工(2021年11期)2022-01-12 06:06:08
    小檗堿對肝硬化大鼠肝功能的保護及炎癥抑制作用
    透明質(zhì)酸基納米纖維促進創(chuàng)面愈合
    鹽酸小檗堿對宮頸癌HeLa細胞外泌體的影響及其機制
    知是荷香慢墨香 從「青藤白陽」到海上畫派
    紫禁城(2020年6期)2020-07-24 09:24:24
    青藤堿對骨肉瘤細胞增殖的影響及其抑瘤作用觀察
    三葉青藤正丁醇部位化學成分的研究
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:08
    青藤歡笑
    學生天地(2017年10期)2017-05-17 05:50:32
    透明質(zhì)酸水凝膠的制備與評價
    肉毒素和透明質(zhì)酸聯(lián)合治療眉間紋療效分析
    在线观看免费视频网站a站| 日韩一区二区三区影片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产亚洲精品久久久com| 国产精品久久久久成人av| 午夜福利影视在线免费观看| 精品少妇内射三级| 9色porny在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 久久久久久久精品精品| 婷婷色综合www| 午夜激情福利司机影院| 极品少妇高潮喷水抽搐| 午夜福利,免费看| 久久久国产精品麻豆| 日本-黄色视频高清免费观看| 91久久精品电影网| 街头女战士在线观看网站| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 十分钟在线观看高清视频www| xxx大片免费视频| 日韩强制内射视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 在现免费观看毛片| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美成人午夜免费资源| 日韩在线高清观看一区二区三区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| freevideosex欧美| 国产国语露脸激情在线看| 国产成人91sexporn| 久久久久视频综合| 国产综合精华液| av国产久精品久网站免费入址| 观看美女的网站| 精品卡一卡二卡四卡免费| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 91在线精品国自产拍蜜月| 午夜老司机福利剧场| 丝袜脚勾引网站| 国产精品久久久久久久久免| 成人午夜精彩视频在线观看| 只有这里有精品99| 十分钟在线观看高清视频www| 精品国产国语对白av| 丝袜脚勾引网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久久久久久久久成人| 母亲3免费完整高清在线观看 | 欧美精品一区二区大全| 男人操女人黄网站| 国产成人精品婷婷| 亚洲高清免费不卡视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 内地一区二区视频在线| 日韩欧美一区视频在线观看| .国产精品久久| 亚洲精品视频女| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲国产欧美在线一区| 久久 成人 亚洲| 国产精品熟女久久久久浪| 国产日韩欧美视频二区| 午夜影院在线不卡| 免费高清在线观看日韩| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 最新中文字幕久久久久| 成人影院久久| 一本一本综合久久| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 国产黄色免费在线视频| 亚洲精品色激情综合| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲综合精品二区| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久久久久久久人人人人人人| 日本午夜av视频| 亚洲精品色激情综合| 亚洲精品日本国产第一区| 国产一级毛片在线| 赤兔流量卡办理| 色网站视频免费| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲成色77777| 久久精品国产自在天天线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产高清有码在线观看视频| 久久人人爽人人片av| 伊人久久国产一区二区| 久久久久国产网址| 91国产中文字幕| 九色成人免费人妻av| 日韩成人av中文字幕在线观看| 青春草国产在线视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 精品久久久精品久久久| 春色校园在线视频观看| 制服人妻中文乱码| 青春草亚洲视频在线观看| 人人澡人人妻人| 在线观看免费高清a一片| 精品少妇久久久久久888优播| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 激情五月婷婷亚洲| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲av二区三区四区| 人妻系列 视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 婷婷色综合大香蕉| a级毛片在线看网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产在线免费精品| 丝袜喷水一区| 亚洲av综合色区一区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 嫩草影院入口| 热re99久久国产66热| 中国国产av一级| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲一区二区三区欧美精品| 少妇丰满av| 亚洲美女视频黄频| 桃花免费在线播放| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 日韩中字成人| 69精品国产乱码久久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲av二区三区四区| 欧美人与善性xxx| a级毛片在线看网站| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 黑人猛操日本美女一级片| 免费黄色在线免费观看| 国产精品人妻久久久久久| 在线天堂最新版资源| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久久精品94久久精品| 午夜福利影视在线免费观看| 老熟女久久久| 久久久国产精品麻豆| 亚洲美女黄色视频免费看| 欧美日韩视频精品一区| 视频中文字幕在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜福利,免费看| 久久热精品热| 国产精品免费大片| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产在线一区二区三区精| 国产一区二区三区综合在线观看 | 少妇的逼水好多| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 最黄视频免费看| 久久ye,这里只有精品| 午夜老司机福利剧场| av线在线观看网站| h视频一区二区三区| 国产精品国产av在线观看| 两个人的视频大全免费| 日韩av免费高清视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 在线观看免费日韩欧美大片 | 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲性久久影院| 免费人妻精品一区二区三区视频| 精品久久久久久久久av| 午夜91福利影院| 国产日韩欧美亚洲二区| a级片在线免费高清观看视频| 我的老师免费观看完整版| 日韩精品有码人妻一区| 久久综合国产亚洲精品| 免费黄色在线免费观看| 亚洲国产精品999| 久久久久久久久久久久大奶| 色哟哟·www| 老司机亚洲免费影院| 高清在线视频一区二区三区| 久久婷婷青草| 精品人妻偷拍中文字幕| 激情五月婷婷亚洲| 久久精品国产亚洲网站| 日韩成人伦理影院| 少妇的逼水好多| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 黄色一级大片看看| 男人添女人高潮全过程视频| 高清毛片免费看| 午夜影院在线不卡| 97超碰精品成人国产| 在线天堂最新版资源| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久久欧美国产精品| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲人成77777在线视频| 少妇精品久久久久久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲,欧美,日韩| 18禁在线播放成人免费| 久久久久视频综合| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 99热6这里只有精品| 婷婷色av中文字幕| 内地一区二区视频在线| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲成色77777| 久久久亚洲精品成人影院| 3wmmmm亚洲av在线观看| 最新中文字幕久久久久| 精品久久蜜臀av无| 中文字幕av电影在线播放| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 观看美女的网站| 99热这里只有是精品在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 91精品三级在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日韩制服骚丝袜av| 热re99久久国产66热| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 赤兔流量卡办理| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲一区二区三区欧美精品| 青青草视频在线视频观看| 妹子高潮喷水视频| www.av在线官网国产| 免费观看a级毛片全部| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲精品国产av蜜桃| 黄色配什么色好看| 亚洲欧洲国产日韩| av不卡在线播放| 国产免费又黄又爽又色| av播播在线观看一区| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲国产成人一精品久久久| 老司机影院毛片| 国产成人91sexporn| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲国产精品国产精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 九九在线视频观看精品| 色吧在线观看| 搡老乐熟女国产| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美变态另类bdsm刘玥| 这个男人来自地球电影免费观看 | 男女国产视频网站| 国产成人aa在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 成人毛片a级毛片在线播放| 一级a做视频免费观看| 观看美女的网站| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产成人精品在线电影| av免费在线看不卡| 日本爱情动作片www.在线观看| 香蕉精品网在线| 日韩在线高清观看一区二区三区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 美女cb高潮喷水在线观看| 青春草视频在线免费观看| 伊人亚洲综合成人网| 青春草亚洲视频在线观看| 好男人视频免费观看在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 中文字幕制服av| 99热全是精品| 成年av动漫网址| 超碰97精品在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 国产国语露脸激情在线看| 五月伊人婷婷丁香| 大片电影免费在线观看免费| 国产一区二区在线观看av| 啦啦啦在线观看免费高清www| 午夜91福利影院| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产在线视频一区二区| 久久久午夜欧美精品| 九色成人免费人妻av| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 女人久久www免费人成看片| 18在线观看网站| 18在线观看网站| 一区二区av电影网| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 插阴视频在线观看视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美97在线视频| 国产精品一区二区在线观看99| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲欧洲日产国产| 人妻人人澡人人爽人人| 成年av动漫网址| 亚洲,欧美,日韩| 午夜日本视频在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 丝袜美足系列| 人妻 亚洲 视频| 免费观看a级毛片全部| 最近手机中文字幕大全| 欧美激情 高清一区二区三区| 成人国产麻豆网| 久久久久网色| 人妻一区二区av| 成人影院久久| 亚洲国产精品999| 国产高清国产精品国产三级| 18+在线观看网站| 夫妻午夜视频| 18+在线观看网站| 多毛熟女@视频| 成人无遮挡网站| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| videosex国产| av一本久久久久| 久久精品国产亚洲av天美| 日本免费在线观看一区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久99精品国语久久久| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 一级毛片我不卡| 18+在线观看网站| 极品人妻少妇av视频| 人妻少妇偷人精品九色| 女人久久www免费人成看片| 2018国产大陆天天弄谢| 免费日韩欧美在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 国产亚洲欧美精品永久| 国产一级毛片在线| 天天操日日干夜夜撸| 国产男人的电影天堂91| 亚洲,一卡二卡三卡| 18禁动态无遮挡网站| 内地一区二区视频在线| 久久国产精品大桥未久av| 3wmmmm亚洲av在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 97精品久久久久久久久久精品| 国产成人精品一,二区| 黑丝袜美女国产一区| 日本av免费视频播放| av天堂久久9| 黄色怎么调成土黄色| 性色av一级| 中国美白少妇内射xxxbb| 人妻夜夜爽99麻豆av| 精品午夜福利在线看| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久人人爽人人片av| a级片在线免费高清观看视频| 大香蕉久久网| 少妇人妻 视频| 少妇的逼好多水| 国产 精品1| 在线观看免费视频网站a站| 人成视频在线观看免费观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 自线自在国产av| 51国产日韩欧美| 99久久精品一区二区三区| 国产一区二区三区av在线| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美日本中文国产一区发布| 精品少妇内射三级| 高清午夜精品一区二区三区| 大香蕉97超碰在线| 两个人的视频大全免费| 亚洲精品成人av观看孕妇| 免费高清在线观看视频在线观看| 性色av一级| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产免费又黄又爽又色| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 欧美最新免费一区二区三区| 一级毛片电影观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 婷婷色综合大香蕉| 日韩免费高清中文字幕av| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 少妇的逼好多水| av一本久久久久| 18禁在线播放成人免费| 青春草视频在线免费观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久综合国产亚洲精品| 国产精品一二三区在线看| 麻豆成人av视频| 久久久国产一区二区| 五月天丁香电影| 国产午夜精品一二区理论片| freevideosex欧美| 观看美女的网站| 丝瓜视频免费看黄片| 日本免费在线观看一区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产亚洲精品久久久com| 精品久久久噜噜| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲成色77777| 国产男女内射视频| 国产在视频线精品| 久久久精品免费免费高清| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 高清视频免费观看一区二区| 激情五月婷婷亚洲| 欧美精品高潮呻吟av久久| 2022亚洲国产成人精品| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 中文字幕av电影在线播放| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 欧美国产精品一级二级三级| a级毛色黄片| 久久久久久久久久成人| 在线观看三级黄色| 97在线人人人人妻| 午夜av观看不卡| 欧美xxxx性猛交bbbb| 99国产综合亚洲精品| 综合色丁香网| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产精品无大码| 热99国产精品久久久久久7| 精品酒店卫生间| 国精品久久久久久国模美| www.色视频.com| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产亚洲一区二区精品| 少妇丰满av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 97超视频在线观看视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 高清不卡的av网站| 久久久久久久久久久免费av| 精品一区二区三区视频在线| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产一级毛片在线| 成人国产av品久久久| 久久99蜜桃精品久久| 99热这里只有精品一区| 午夜激情久久久久久久| 在线精品无人区一区二区三| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久人妻熟女aⅴ| 秋霞在线观看毛片| 日韩伦理黄色片| 老女人水多毛片| 欧美另类一区| 亚洲中文av在线| 亚洲综合精品二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产精品蜜桃在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 日韩一区二区视频免费看| 午夜免费鲁丝| 99视频精品全部免费 在线| 水蜜桃什么品种好| 精品国产乱码久久久久久小说| videos熟女内射| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产成人精品福利久久| a级毛片黄视频| 久久99精品国语久久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 精品一区在线观看国产| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日韩亚洲欧美综合| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| av天堂久久9| 亚洲经典国产精华液单| 九色亚洲精品在线播放| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 黄色欧美视频在线观看| 免费大片18禁| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 久久精品国产亚洲网站| 美女国产视频在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久热精品热| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 九色成人免费人妻av| 成年人免费黄色播放视频| 热99国产精品久久久久久7| 黄片无遮挡物在线观看| 丝袜喷水一区| 国产综合精华液| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 有码 亚洲区| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲精品日本国产第一区| 国产精品一国产av| 亚洲第一av免费看| 校园人妻丝袜中文字幕| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 777米奇影视久久| 国产在线视频一区二区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 69精品国产乱码久久久| 青春草视频在线免费观看| av国产精品久久久久影院| 欧美三级亚洲精品| 最近2019中文字幕mv第一页| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲综合色网址| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 丝袜脚勾引网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩av不卡免费在线播放| 乱人伦中国视频| 搡老乐熟女国产| 全区人妻精品视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 高清av免费在线| 女性生殖器流出的白浆| 熟女人妻精品中文字幕| 精品一区二区免费观看| 久久av网站| 2021少妇久久久久久久久久久| 一区在线观看完整版| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一二三四中文在线观看免费高清| 男女啪啪激烈高潮av片| 新久久久久国产一级毛片| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美激情极品国产一区二区三区 | a级毛片黄视频| 高清在线视频一区二区三区| 女性生殖器流出的白浆| 99久国产av精品国产电影| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 人妻 亚洲 视频| 亚洲伊人久久精品综合| 97在线人人人人妻| 亚洲综合色网址| 日韩一区二区视频免费看| 中国国产av一级| 免费大片黄手机在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| a级毛片在线看网站| 999精品在线视频| 最黄视频免费看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 久久久久精品性色| 午夜日本视频在线| 丝袜在线中文字幕| 亚洲怡红院男人天堂| 在线观看一区二区三区激情| 少妇的逼好多水| 久久av网站| av卡一久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 水蜜桃什么品种好| 91aial.com中文字幕在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 各种免费的搞黄视频| 一级爰片在线观看| 成人影院久久| 国产成人精品福利久久| 日韩免费高清中文字幕av| 22中文网久久字幕| 免费看av在线观看网站| www.色视频.com| 在线观看免费视频网站a站| 18禁在线播放成人免费| 性高湖久久久久久久久免费观看| 性色avwww在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 如何舔出高潮| 色吧在线观看| 国产淫语在线视频|