抗紅斑丹毒絲菌的rSpaA蛋白豬源單鏈抗體庫構(gòu)建及單鏈抗體淘選

王銳，葛猛，陳一葦，方超，柴強(qiáng)強(qiáng)，李潤成，余興龍

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

抗紅斑丹毒絲菌的rSpaA蛋白豬源單鏈抗體庫構(gòu)建及單鏈抗體淘選

王銳，葛猛，陳一葦，方超，柴強(qiáng)強(qiáng)，李潤成，余興龍*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

從免疫過rSpaA的豬的脾淋巴細(xì)胞中提取總RNA，采用RT–PCR技術(shù)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)兼并引物擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因片段，采用重疊延伸PCR方法，將VH和VL通過Linker連接成重組單鏈抗體(以下簡寫為scFv)的基因片段。將scFv的基因連接至噬菌粒載體pComb3Xss，將重組載體電轉(zhuǎn)化至宿主菌XL1-Blue，并經(jīng)輔助噬菌體M13KO7拯救，獲得豬源噬菌體單鏈抗體庫，庫容約為2.5×106。以rSpaA為靶抗原，經(jīng)免疫親和篩選，獲得8株特異性較好的陽性克隆。本研究結(jié)果可為制備抗紅斑丹毒絲菌的重組scFv提供新途徑，并為豬丹毒的免疫檢測和綜合防制提供材料基礎(chǔ)。

豬源抗體庫；單鏈抗體；紅斑丹毒絲菌；噬菌體展示技術(shù)

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紅斑丹毒絲菌在自然環(huán)境中廣泛存在，主要引起豬的急性或亞急性敗血癥和慢性關(guān)節(jié)炎及心內(nèi)膜炎，能對豬肉生產(chǎn)的各階段產(chǎn)生影響，如得不到良好的防制，會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的損失[1–2]。免疫接種是預(yù)防豬丹毒最好的方法。目前常用丹毒絲菌滅疫活苗、減毒疫苗等來預(yù)防豬丹毒的暴發(fā)和流行，但其有效性依賴于動(dòng)物對該疫苗的免疫應(yīng)答能力，且減毒疫苗在臨床使用中存在一定的危險(xiǎn)[3]，此外，紅斑丹毒絲菌的血清型較多和疫苗的免疫交叉保護(hù)性差、保護(hù)周期短等使該病至今仍未得到有效控制[4–5]，因此，研發(fā)快速有效的免疫檢測方法對更好地防治豬丹毒具有重要意義。

噬菌體抗體庫是當(dāng)今重組抗體的主要技術(shù)平臺(tái)之一，它甚至可使不經(jīng)免疫而在體外篩選和制備各類抗體成為可能[6–7]。scFv是由重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段柔性短肽(Linker)連接而成的具有抗原特異性結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)功能單位[8–9]。scFv具有相對分子質(zhì)量小、免疫原性低、穿透性好、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，一直是重組抗體研究的熱點(diǎn)，在靶向藥物研究、基因治療和藥物殘留檢測、抗原檢測等方面得到了廣泛應(yīng)用[10–11]。目前，關(guān)于人、鼠天然或免疫傾向性單鏈抗體庫的研究較多，而關(guān)于豬、犬等的抗體的研究尚少。本研究中構(gòu)建豬源的抗紅斑丹毒絲菌SpaA蛋白噬菌體單鏈抗體庫，通過生物淘選獲得與rSpaA特異性結(jié)合且親和力較高的scFv，旨在為紅斑豬丹毒絲菌SpaA重組抗體的制備提供新途徑，為新型豬丹毒免疫檢測方法的開發(fā)提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

E.coli XL1–Blue、E.coli JM109、輔助噬菌體M13KO7和噬菌粒載體pComb3Xss均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)余興龍教授提供。

1.1.2 主要試劑

RNA 提取試劑Trizol購于Invitrogen公司；ReverAid First Stand cDNA Kit 購于Thermo公司；rTaq DNA聚合酶、Ex–Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶SfiI、pMD19–T Vector等均購于TaKaRa公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗 M13 噬菌體單抗(Anti–M13 Monoclonal Conjugate) 購自 Pharmacia公司；胰蛋白胨、酵母提取物、PEG8000等試劑購自Solarbio公司。

1.1.3 PCR引物的設(shè)計(jì)

豬源抗體輕鏈及重鏈可變區(qū)引物、 輕鏈及重鏈基因連接引物(linker)和scFv 的基因擴(kuò)增引物由華大基因公司合成(表1)。VH的4對引物用于擴(kuò)增豬源抗體重鏈可變區(qū)基因，VL的16對引物用于擴(kuò)增豬源抗體輕鏈可變區(qū)基因，將linker部分序列分別添加在重鏈的下游和輕鏈的上游作為接頭引物，用于SOE–PCR拼接scFv片段。

表1 本試驗(yàn)中所用PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequences of PCR amplification

1.2 方法

1.2.1 豬源抗體VH和VL的基因擴(kuò)增及純化

用Trizol法提取豬脾淋巴細(xì)胞的總RNA，并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific)的使用說明書合成cDNA第1鏈。

以cDNA為模板，分別用擴(kuò)增VH和VL的上下游引物克隆VH和VL的基因片段。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：cDNA模板2 μL，Taq Plus DNA 聚合酶1 μL，10×Taq Plus 緩沖液 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，上、下游引物各1 μL，加滅菌超純水補(bǔ)至50 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行32個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸7 min，產(chǎn)物于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定，并切膠純化，回收目的片段。

1.2.2 重組scFv的基因制備

1) VH–linker、VL–linker基因片段的制備。以上步回收的VH和VL片段作為模板，用相對應(yīng)的加Linker端引物(VH–L–Rp 和L–VL–Fp)分別擴(kuò)增，得到VH–linker、VL–linker的基因片段。PCR反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)參考1.2.1，退火溫度為60 ℃。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化、回收目的片段。

2) scFv的基因組裝。在預(yù)拼接階段，以等量的VH–linker、VL–linker基因片段互為模板和引物進(jìn)行scFv預(yù)拼接。反應(yīng)體系(50 μL)：VH–linker、VL–linker基因片段各2 μL，5×Pfu 緩沖液 10 μL，dNTP(25 mmol/L)4 μL，Pfu 酶 1 μL，加滅菌超純水補(bǔ)至50 μL。先將2個(gè)基因片段進(jìn)行重疊延伸。反應(yīng)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行10個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，9 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min)，最后72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后立即放入冰盒。之后進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增，向反應(yīng)體系補(bǔ)加VH上游引物和VL下游引物各1 μL，擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸30 s)，之后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。最后以上述拼接產(chǎn)物為模板，用引物S–VH–Fp和VL–S–Rp擴(kuò)增帶有Sfi I酶切位點(diǎn)的scFv片段，PCR反應(yīng)體系和PCR循環(huán)參數(shù)參考1.2.1，退火溫度為65 ℃?；厥誔CR產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，觀察結(jié)果并切膠回收。

3) scFv的基因T–A克隆鑒定。使用pMD19–T載體試劑盒對scFv的基因產(chǎn)物進(jìn)行T–A克隆，將scFv的基因片段與pMD19–T載體連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli JM109，將轉(zhuǎn)化菌液涂布于LB–A瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)16 h，隨機(jī)挑選若干轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.2.3 噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建

1) 重組噬菌粒載體的轉(zhuǎn)化。將帶有酶切位點(diǎn)的scFv片段和噬菌粒載體pComb3Xss用Sfi I限制性內(nèi)切酶消化處理，切膠純化、回收后，用T4DNA連接酶連接，經(jīng)NaAC–乙醇沉淀脫鹽后電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli XL1–Blue，復(fù)蘇后梯度稀釋，并涂布到LB–A瓊脂平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h，對菌落計(jì)數(shù)，估算庫容，并隨機(jī)挑選若干轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定。剩余轉(zhuǎn)化菌用終體積分?jǐn)?shù)15%的甘油于–80 ℃保存。采用與以上相同的電轉(zhuǎn)化條件和操作進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，獲得總的抗體庫。

2) 重組噬菌體庫的獲得。將抗體庫的菌種加入2×YT–AG液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌液OD600nm約0.5時(shí)加入輔助噬菌體M13KO7超感染，37 ℃培養(yǎng)1 h，4 000 g離心10 min，菌體用100 mL新鮮2×YT–AG液體培養(yǎng)基重懸，于30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。第2天于4 ℃下8 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，向其中加入20 mL的PEG/NaCl，混勻后冰浴1 h，待噬菌體充分聚沉后，于4 ℃下11 000 g離心10 min，吸去上清，用2 mL的PBS重懸噬菌體沉淀，4 ℃下11 000 g離心10 min，上清可在4 ℃短期保存，也可加入終體積分?jǐn)?shù)15%的甘油置于-70 ℃長期保存。

3) 噬菌體單鏈抗體庫滴度的測定。取10 μL制備的噬菌體單鏈抗體初級庫，用新鮮的2×YT液體培養(yǎng)基梯度稀釋(10–8、10–10、10–12、10–14、10–16)，加入10 mL對數(shù)期的E.coli XL1–Blue，靜置培養(yǎng)30 min后振蕩培養(yǎng)2 h，各梯度取100 μL菌液分別涂布于LB–AG瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h，對平板上的單菌落計(jì)數(shù)，估算噬菌體單鏈抗體庫的滴度，用于后續(xù)免疫親和篩選和富集試驗(yàn)。

1.2.4 單鏈抗體庫的免疫親和篩選與富集

用96孔板進(jìn)行抗原抗體結(jié)合及噬菌體感染擴(kuò)增和富集篩選[12–13]。將質(zhì)量濃度為100 μg/mL的rSpaA原核表達(dá)純化蛋白包被于96孔酶標(biāo)板，4 ℃靜置過夜，用PBST洗滌6次后加入4%的PBS–BSA，于37 ℃封閉1 h，棄盡封閉液后干燥備用[14]。

將初級噬菌體文庫加入制備好的抗原板，于37℃孵育1 h，用PBS洗滌后加入100 μL 的Gly–HCl(pH2.2)洗脫，反應(yīng)10 min后加入20 μL Tris–Cl(pH9.0)中和，迅速收集上清，用0.22 μm濾膜過濾除菌，加入培養(yǎng)至對數(shù)期的XL1–Blue菌液，37 ℃培養(yǎng)1 h，取10 μL培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋后涂布于LB–A平板，過夜培養(yǎng)后計(jì)算單菌落數(shù)，估測一輪富集噬菌體文庫的滴度。向其余的培養(yǎng)液中加入M13KO7感染，重復(fù)上述操作，共進(jìn)行5輪富集。

1.2.5 陽性噬菌體scFv的ELISA鑒定和特異性鑒定

于第4、第5輪噬菌體滴度測定輸出平板上隨機(jī)挑選單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，對PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行抗性培養(yǎng)和輔助噬菌體拯救，制備噬菌體單鏈抗體。以純化的rSpaA(25 μg/mL)為抗原包被96孔酶標(biāo)板，以HRP標(biāo)記的抗M13的單克隆抗體為酶標(biāo)二抗，用ELISA方法檢測所制備的scFv，同時(shí)設(shè)置陰性對照和空白對照。具體操作：向抗原板中加入噬菌體單鏈抗體(陰性對照組加入M13KO7)，37 ℃孵育1.5 h后棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌4次，拍干酶標(biāo)板，加入酶標(biāo)二抗，于37 ℃孵育1 h后棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌4次，拍干酶標(biāo)板，加入TMB顯色底物，于37 ℃下避光反應(yīng)10 min，立即加入終止液，用酶標(biāo)儀測OD450nm。設(shè)待檢scFv的OD450nm為 P，陰性對照的OD450nm為N，若P/N≥2.1，則判為陽性；若P/N＜1.5，則判為陰性。

分別用重組蛋白rSpaA和同濃度的其他原核表達(dá)重組蛋白(CJ/SS–1、CJ/SS–2、LQ/PEDV–1)及BSA制備抗原板，對檢測為陽性的8株代表性單鏈抗體進(jìn)行特異性驗(yàn)證試驗(yàn)，在包被不同抗原的抗原板中加入噬菌體單鏈抗體進(jìn)行反應(yīng)，以HRP標(biāo)記的抗M13單克隆抗體為酶標(biāo)二抗，按phage–ELISA方法檢測與抗原結(jié)合的scFv。

2 結(jié)果與分析

2.1 VH和VL的基因擴(kuò)增結(jié)果

以豬脾組織細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用相應(yīng)引物分別擴(kuò)增抗體重鏈(VH)、輕鏈(VL)可變區(qū)基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出的基因片段與預(yù)期大小相符(圖1)。

圖1 VH和VL的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of the products of gene VHand VLfrom PCR amplification

2.2 scFv的基因SOE–PCR拼接結(jié)果

采用PCR技術(shù)將切膠純化后的VH和VL的基因片段分別添加部分Linker序列(在VH的下游和VL的上游添加)。用SOE–PCR將VH和VL拼接成scFv，并用帶有酶切位點(diǎn)的上、下游引物給scFv片段加上不對稱的Sfi I酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，擴(kuò)增得到的基因片段約900 bp，與預(yù)期大小相符(圖2)。

圖2 scFv基因SOE–PCR拼接產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of the gene scFv products from SOE–PCR amplification

2.3 scFv的基因T–A克隆PCR鑒定結(jié)果

scFv基因片段與pMD19–T載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109，將轉(zhuǎn)化菌液涂布于LB–A瓊脂平板，隨機(jī)挑選12個(gè)單菌落，用scFv的上、下游引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，顯示擴(kuò)增得到的基因片段約900 bp，與預(yù)期大小相符(圖3)。

圖3 T–A克隆產(chǎn)物的PCR鑒定電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of the T–A subcloning products from PCR amplification

2.4 scFv噬菌體抗體庫的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

將scFv的基因與噬菌粒載體pCom3Xss經(jīng)內(nèi)切酶處理，重組連接后轉(zhuǎn)化至E.coli XL1–Blue，從1 mL轉(zhuǎn)化菌液中取5 μL涂布培養(yǎng)過夜，出現(xiàn)約568個(gè)單菌落，經(jīng)22次相同條件和相同操作的電轉(zhuǎn)化，積累的總抗體庫庫容約為2.5×106。從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑選22個(gè)單菌落，用scFv的下游引物和pComb3Xss測序上游引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，顯示擴(kuò)增得到的片段大小約1 000 bp，與預(yù)期大小相符(圖4)。鑒定結(jié)果表明成功構(gòu)建了單鏈抗體庫，scFv基因插入率約為100%，初級噬菌體單鏈抗體庫的滴度約為6×1015PFU/mL。

圖4 重組單克隆菌落PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of recombinant clones from PCR amplification

2.5 噬菌體單鏈抗體庫的富集篩選結(jié)果及重組抗體的初步鑒定結(jié)果

本試驗(yàn)中構(gòu)建的初級噬菌體單鏈抗體庫經(jīng)5輪免疫親和篩選富集試驗(yàn)的結(jié)果見表2。由表2可見，第3、4、5輪篩選的抗體庫的富集倍數(shù)無明顯增加，說明抗體庫完成了富集。與第1輪富集篩選相比，第5輪篩選后噬菌體抗體庫的產(chǎn)出率約為第1輪產(chǎn)出率的12倍。

表2 噬菌體單鏈抗體庫各輪免疫親和篩選的富集效果Table 2 Enrichment of phage scFv library from immunoaffinity panning

2.6 陽性噬菌體單鏈抗體的篩選結(jié)果

經(jīng)PCR鑒定為陽性的克隆共44株，制備噬菌體單鏈抗體后進(jìn)行phage–ELISA試驗(yàn)，結(jié)果檢測到與rSpaA415具有結(jié)合活性的陽性克隆31株(S/N＞2.1，表3)，其中有8株克隆的OD450nm均大于0.8，且S/N大于5，噬菌體上清液與BSA無交叉反應(yīng)。陰性對照組是用包被質(zhì)量濃度100 μg/mL的BSA酶標(biāo)板進(jìn)行phage–ELISA，檢測到3組平行試驗(yàn)OD450nm的平均值為0.16；空白對照組是用未加蛋白包被的酶標(biāo)板進(jìn)行phage–ELISA，檢測到3組平行試驗(yàn)OD450nm的平均值為0.10。

表3 phage–scFv的ELISA篩選結(jié)果Table 3 Screening the phage–scFv from rSpaA using ELISA

2.7 陽性噬菌體單鏈抗體的特異性驗(yàn)證結(jié)果

用不同抗原包被抗原板，以抗M13 MAb為酶標(biāo)二抗，用phage–ELISA方法檢測與抗原結(jié)合的scFv，驗(yàn)證8株具代表性的scFv的特異性，其結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，8株陽性scFv對rSpaA的親和力明顯高于其他重組蛋白，具有較好的特異性。

圖5 不同包被抗原檢測8株噬菌體scFv特異性的OD450nmFig.5 OD450nmrepresented the specificity of 8 strains phage scFv detected from different coating antigens

3 結(jié)論與討論

SpaA是丹毒絲菌主要的表面抗原蛋白[15]，在本試驗(yàn)的前期工作中對SpaA進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)和抗原表位預(yù)測分析后，選擇可能的B細(xì)胞表位富集區(qū)進(jìn)行原核克隆和表達(dá)，獲得了純化的可溶性重組蛋白rSpaA。

能否篩選到高親和力的單鏈抗體取決于所建單鏈抗體庫的質(zhì)量，其中抗體庫的多樣性和庫容量是評價(jià)抗體庫質(zhì)量的重要指標(biāo)。庫的多樣性取決于抗體基因的完整性。本試驗(yàn)在GeneBank中檢索豬源抗體基因信息，共設(shè)計(jì)了多對含兼并堿基的抗體可變區(qū)基因擴(kuò)增引物，較好地保證了抗體庫的多樣性。

庫容量與篩選得到的scFv的親和力呈正相關(guān)，庫容越大，越容易篩選到高親和力的抗體，因此，客容量也是影響抗體庫質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。制約庫容量的關(guān)鍵是載體、宿主菌的轉(zhuǎn)化效率。為提高轉(zhuǎn)化效率，本試驗(yàn)中采用電轉(zhuǎn)化方式將重組噬菌粒載體導(dǎo)入到宿主菌，同時(shí)采用相同轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)行多次累積轉(zhuǎn)化的方式，通過約22次相同的電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，最終獲得了總庫容量約2.5×106的scFv庫。由于本庫為免疫傾向性抗體庫，抗體基因在體內(nèi)得到了選擇克隆和分子重排，對免疫原具有傾向性，因此，該庫的庫容量基本符合抗體庫親和篩選獲得特異性抗體的要求。

抗體庫的篩選是獲得特異性scFv的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，優(yōu)化的抗體庫篩選策略能最大程度地發(fā)揮噬菌體scFv展示文庫的篩選優(yōu)勢。本試驗(yàn)中以可溶性表達(dá)的純化rSpaA蛋白作為靶抗原，采用固相免疫親和篩選的方法，通過5輪“吸附—洗滌—洗脫—擴(kuò)增”免疫親和富集篩選，獲得特異性scFv。該方式是最經(jīng)典的親和篩選方法，操作簡捷，有利于篩選到高親和力的scFv。后期的特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，篩選得到的8株scFv具有較好的特異性和親和力，初步達(dá)到了本研究的預(yù)期目標(biāo)。

本研究中從免疫rSpaA的試驗(yàn)豬脾淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增得到抗體可變區(qū)基因，構(gòu)建豬源噬菌體單鏈抗體展示文庫。通過免疫親和篩選，獲得抗rSpaA噬菌體單鏈抗體富集庫，經(jīng)PCR和phage–ELISA檢測鑒定，篩選到8株具有較高親和力和特異性的噬菌體scFv克隆。本次研究為國內(nèi)外首次制備抗豬丹毒絲菌SpaA的噬菌體scFv，研究結(jié)果可為豬丹毒的免疫檢測和防控研究提供條件。在后期的研究中，擬選擇3株scFv陽性克隆進(jìn)行測序，對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對和分析，并用ExPASy(SWISS–MODEL)對這3株scFv的序列進(jìn)行同源建模分析，以進(jìn)一步研究和制備高親和力的抗rSpaA單鏈抗體。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Construction of swine phage single-chain antibody variable fragment (scFv) library for recombinant SpaA protein (rSpaA)of erysipelothrix rhuriopathiae and specific scFv panning

Wang Rui, Ge Meng, Chen Yiwei, Fang Chao, Chai Qiangqiang, Li Runcheng, Yu Xinglong*
(College of Veterinary Medicine, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China)

The study was designed to identify and construct a library for swine phage single-chain antibody (scFv) rSpaA. Total RNA was extracted from splenic tissue and used to amplify fragments consisting of a variable heavy chain (VH) and a variable light chain (VL). After purification, VHand VLwere joined with a linker to produce scFv fragments by splicing-overlap-extension (SOE) PCR. The gene scFv was cloned in plasmid pComb3Xss, and the recombinant phagemids were transformed to susceptible E. coli XL1–Blue. After infection with the aid of phage M13K07, the library of phage antibody was constructed. The size of constructed antibody library was 2.5×106. By taking the purified recombinant protein rSpaA as target antigens, 8 strains of positive scFvs with binding affinity to rSpaA were identified after 5 rounds of procedure of ELISA： bind-elution-enrichment. In conclusion, the construction of rSpaA swine scFv library and the study for the preparation of recombinant antibodies could provide a new way and lay the foundation for the immunoassay of SE and comprehensive prevention and control to swine erysipelas.

swine antibody library; single-chain antibody (scFv); phage library display; erysipelothrix rhuriopathiae

S858.28

A

1007-1032(2016)06-0647-07

2016–01–22

2016–05–02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272652)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS–46–42)

王銳(1990—)，男，湖南常德人，碩士研究生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，wrui10010@163.com；*通信作者，余興龍，博士，教授，主要從事畜禽重要傳染病診斷與防制研究，xly999@126.com