赤眼鱒TRAF6基因的cDNA克隆及其應(yīng)對GCRV的免疫表達(dá)特性

陳開健，王靜安，劉巧林，王榮華，徐瑩，趙鑫，肖調(diào)義*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 常德 415000)

赤眼鱒TRAF6基因的cDNA克隆及其應(yīng)對GCRV的免疫表達(dá)特性

陳開健1,2，王靜安1#，劉巧林1,2，王榮華1，徐瑩1，趙鑫1，肖調(diào)義1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 常德 415000)

為研究赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6基因的結(jié)構(gòu)特性及其應(yīng)對GCRV的免疫表達(dá)特性，采用RACE技術(shù)獲得了赤眼鱒TRAF6基因的cDNA全長(共2 621 bp)，其中包含5′端非編碼區(qū)50 bp，開放閱讀框1 629 bp，3′端非編碼區(qū)942 bp；該基因編碼542個氨基酸，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為61 670，理論等電點(diǎn)為6.01。SMART結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，TRAF6基因編碼的蛋白包含1個RING結(jié)構(gòu)域、2個鋅指結(jié)構(gòu)域、1個螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域和1個MATH結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，赤眼鱒TRAF6與團(tuán)頭魴TRAF6的親緣關(guān)系最近。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，TRAF6在赤眼鱒的12種組織中均有表達(dá)，其中在肝臟中的表達(dá)量最高，在中腸中的表達(dá)量最低；經(jīng)GCRV感染后，赤眼鱒脾臟和頭腎中TRAF6均呈波動上調(diào)趨勢，在24 h達(dá)到峰值，表明TRAF6參與了赤眼鱒抗GCRV的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

赤眼鱒；腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6基因；草魚呼腸孤病毒(GCRV)

投稿網(wǎng)址：http：//xb.ijournal.cnAbstract： In order to investigate whether tumor necrosis factor-associated factor 6 gene involved inantiviral immune response, the full-length cDNA of TRAF6 in Squaliobarbus curriculus was cloned by using RACE–PCRs method. The full-length cDNA of TRAF6 is 2 621 bp including a 5′–terminal untranslated region of 50 bp, a 3′–terminal untranslated region of 942 bp and an open reading frame of 1 629 bp encoding a polypeptide of 542 amino acid residues. The putative isoelectric point and molecular weight of TRAF6 was 6.01 and 61 670, respectively. The protein encoded by this gene includes one ring domain, two zinc fingers, one coiled-coil region, and one MATH domain. Phylogenetic analysis showed that the TRAF6was the most homogeneous to Megalobrama amblycephala. The expression of TRAF6could be detected in all the 12 tested tissues by RT–PCR, which the highest expressed in the liver and the lowest expressed in midgut.After injection with grass carp reovirus (GCRV), the TRAF6expression level was up and down regulated in both spleen and head kidney, and reached the peak at 24 h, respectively. The results suggest that TRAF6 gene might play important roles in the immune response of Squaliobarbus curriculus against GCRV.

Keywords：Squaliobarbus curriculus; tumor necrosis factor receptor–associated factor 6 gene (TRAF6); grass carp reovirus(GCRV)

Toll樣受體(toll–like receptor, TLR)可通過識別病原的相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)與下游的不同受體接頭蛋白結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用[1]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptorassociated factors 6, TRAF6)是TRAFs家族中唯一既與腫瘤壞死因子(TNF)超家族又與白細(xì)胞介素–1受體/Toll樣受體(IL–1/TLR)超家族密切相關(guān)的重要接頭分子，介導(dǎo)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2]。在TLRs介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，TRAF6參與MyD88依賴途徑和TRIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，是激活NF–κB通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路的交叉點(diǎn)[3]。TRAF6基因是在1996年Ishida等[4]研究酵母雙雜交系統(tǒng)對CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響時發(fā)現(xiàn)的，目前，TRAF6基因已在多種物種中被克隆出來，其中已報道存在TRAF6基因的魚類有大黃魚(Pseudosciaena crocea)[5]、斑馬魚(Danio rerio)[6]、鯉魚(Cyprinus carpio)[7]、點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus coioides)[8]、草魚(Ctenopharyngodon idella)[9]、團(tuán)頭魴(Megalobramaambly cephala)[10]、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[11]等。研究表明，TRAF6基因在魚類抗細(xì)菌、病毒和寄生蟲的免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，團(tuán)頭魴[10]、東北林蛙[12]等在嗜水氣單胞菌脅迫下TRAF6的表達(dá)量上調(diào)；草魚[9]在多子小瓜蟲感染后TRAF6的表達(dá)量上調(diào)；斑馬魚[6]在感染烏鱧桿狀病毒后TRAF6的表達(dá)量上調(diào)。TRAF6也可作為泛素連接酶(E3)與泛素結(jié)合酶(E2) Ubc13/Uev1A結(jié)合，形成多聚泛素鏈而起連接作用[13]，與適應(yīng)性免疫和固有免疫、炎性反應(yīng)、骨代謝、胚胎發(fā)育和組織發(fā)育等密切相關(guān)[14–15]，參與多種疾病的免疫調(diào)控，有望成為相關(guān)疾病的治療靶點(diǎn)。

赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)作為淡水養(yǎng)殖主要的優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)魚類之一，對環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗病力。赤眼鱒抗草魚呼腸孤病毒(GCRV)的能力優(yōu)于草魚[16–17]。赤眼鱒Mx、MyD88、TLR3等抗GCRV的相關(guān)基因已被成功克隆，這些基因均參與了赤眼鱒抗GCRV病毒的免疫反應(yīng)[18–20]。為探究TRAF6基因是否參與了赤眼鱒抗GCRV病毒免疫反應(yīng)，本試驗(yàn)中克隆赤眼鱒TRAF6基因的cDNA全長，開展生物信息學(xué)分析，檢測TRAF6在赤眼鱒不同組織中的分布，研究赤眼鱒在感染GCRV后其TRAF6基因在脾臟和頭腎等組織中的表達(dá)特性，旨在為進(jìn)一步研究魚類TRAF6在TLRs信號通路中的抗病毒免疫機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

赤眼鱒(6月齡)取自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)基地，平均體質(zhì)量為(90±10) g。試驗(yàn)前挑選健康赤眼鱒作為試驗(yàn)材料，置于室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)1個月，水溫控制在(28±1) ℃，每天定時光照12 h，并按魚體質(zhì)量的1%投喂普通草魚飼料。試驗(yàn)用GCRV病毒由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所曾令兵研究員提供。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成

取50～80 mg赤眼鱒脾臟組織，按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction (TaKaRa, China)試劑盒說明書提取總RNA，其RNA質(zhì)量和濃度采用BioSpectrometer Basic核酸蛋白儀(Eppendorf, 德國)檢測，完整性用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；按照SMARTer?RACE 5′/3′cDNA Kit Components(Clontech)試劑盒說明書合成5′–RACE Ready cDNA和3′–RACE Ready cDNA。

1.2.2 赤眼鱒TRAF6基因全長cDNA的克隆

根據(jù)GenBank中已提交的魚類TRAF6序列，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物TRAF6–3′和TRAF6–5′，以上述cDNA為模板進(jìn)行3′和5′目的片段擴(kuò)增。所有引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。按照SMARTer? RACE5′/3′Kit用戶手冊進(jìn)行3′–RACE和5′–RACE的PCR。PCR產(chǎn)物切膠回收后克隆至pMD19–T載體(TaKaRa, China)，轉(zhuǎn)染至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆菌落送武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測序。

表1 本研究中所用引物的序列Table 1 Primer sequences in the research

1.2.3 赤眼鱒TRAF6序列的生物信息學(xué)分析

用SeqMan 7.1軟件拼接TRAF6基因全長cDNA序列；用ExPASy–Translate tool預(yù)測開放閱讀框；用ExPASy–Compute pI/Mw tool計算相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；用BLAST進(jìn)行序列相似性比較；用SMART進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測；用MEGA 5.1軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 赤眼鱒TRAF6的組織表達(dá)分析

隨機(jī)選取3尾健康赤眼鱒，分別取其脾、肝、腎、前腸、中腸、后腸、頭腎、腦、鰓、鰭條、肌肉和皮膚共12個組織混樣，提取總RNA，以O(shè)ligo (dT)18為引物，按照RevertAid? First Strand cDNA Synthesis kit(Fermentas，美國)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，選用β-actin基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計內(nèi)參引物β–actin–RTF/RTR和特異性熒光定量引物TRAF6–RTF/RTR擴(kuò)增TRAF6片段(表1)。使用SYBR Green I染液在CFX96熒光定量PCR儀 (Bio–Rad，USA)上進(jìn)行熒光定量檢測。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，35個循環(huán)。溶解曲線溫度從65℃升至95 ℃，每5 s增加0.5 ℃。數(shù)據(jù)處理使用CFX manager software 3.1(Bio–Rad，美國)，用法分析其相對表達(dá)值，作圖軟件使用GraphPad Prism 6。

1.2.5 GCRV感染后TRAF6在免疫組織中的表達(dá)特征分析

將180尾健康赤眼鱒隨機(jī)分成6組。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組，對照組每尾魚注射0.2 mL磷酸緩沖液(PBS)，實(shí)驗(yàn)組每尾魚注射0.2 mL GCRV病毒液。GCRV感染后0、6、12、24、48、72、96、120、144 h每組隨機(jī)選取3尾魚，取其脾臟和頭腎組織樣提取總RNA，合成第一鏈cDNA，并按上述步驟進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤眼鱒TRAF6基因的cDNA全長

赤眼鱒TRAF6基因cDNA全長為2 621 bp(GeneBank登錄號為KU365989)，包含50 bp的5′非編碼區(qū)，942 bp的3′端非編碼區(qū)和1 629 bp的開放閱讀框，編碼542個氨基酸，3′端非編碼區(qū)無終止信號，含有6個attta不穩(wěn)定基序，并存在典型的poly(A)尾。該基因預(yù)測的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為61 670，理論等電點(diǎn)為6.01。SMART蛋白質(zhì)序列分析結(jié)果(圖1)顯示，TRAF6基因編碼的蛋白具有4個結(jié)構(gòu)域：RING結(jié)構(gòu)域(71～109個氨基酸)，鋅指結(jié)構(gòu)域(共2個，分別為152～204、205～262個氨基酸)，螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域(311～374個氨基酸)和MATH結(jié)構(gòu)域(379～503個氨基酸)。

圖1 赤眼鱒TRAF6結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果Fig.1 Schematic diagram for structure prediction of TRAF6

2.2 赤眼鱒TRAF6的系統(tǒng)進(jìn)化分析

氨基酸相似性比較結(jié)果(表2)顯示，赤眼鱒TRAF6氨基酸序列與團(tuán)頭魴的相似性最高為98%，與草魚、鯉魚、斑馬魚和鯽魚等鯉科魚類的相似性均達(dá)90%以上，與其他魚類的相似性為61%～71%，與鳥類和哺乳動物的相似性為58%～59%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，整個系統(tǒng)分2大支，魚類單獨(dú)聚為一支，兩棲類、鳥類和哺乳動物聚為另一支；赤眼鱒、團(tuán)頭魴和草魚聚為一簇后，和其他鯉科魚類聚為一大簇(圖2)。

表2 赤眼鱒TRAF6氨基酸序列與其他物種的相似性Table 2 Percentage identities in amino acid sequence of TRAF6 with other species

圖2 赤眼鱒TRAF6氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic relationship of fish TRAF6 proteins

2.3 不同組織中TRAF6的相對表達(dá)量

實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示， TRAF6在赤眼鱒的12種組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在明顯差異，其中在肝臟中的表達(dá)量最高，在腦和鰓中的表達(dá)量次之，在其余組織中均有不同程度的表達(dá)，在中腸中的表達(dá)量最低(圖3)。

圖3 不同組織中TRAF6的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression of TRAF6 in different tissues

2.4 GCRV感染后TRAF6的表達(dá)特性

GCRV感染后，TRAF6在赤眼鱒免疫組織脾臟和頭腎中不同時間的表達(dá)趨勢基本相同：感染初期(感染后0～6 h)，TRAF6的表達(dá)量上調(diào)；感染后12 h時出現(xiàn)下調(diào)，感染后24 h再次顯著上調(diào)，出現(xiàn)峰值；感染后48 h又出現(xiàn)下調(diào)；感染后96 h上調(diào)，且維持在較高水平，感染后144 h恢復(fù)至正常水平，即GCRV感染后，TRAF6在赤眼鱒免疫組織中的表達(dá)量呈波動上調(diào)趨勢，在感染后24 h達(dá)到峰值(圖4，圖5)。

圖4 GCRV感染后TRAF6在脾臟中的表達(dá)水平Fig.4 Expression analysis of TRAF6 in spleen after challenged with GCRV

圖5 GCRV感染后TRAF6在頭腎中的表達(dá)水平Fig.5 Expression analysis of TRAF6 in head kidney after challenged with GCRV

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)中克隆獲得了TRAF6基因的cDNA全長，共編碼542個氨基酸。該基因氨基酸序列不僅在魚類中高度保守，在鳥類和哺乳動物中均具有TRAFs家族基因的4個典型結(jié)構(gòu)域，其N端的RING結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域?qū)τ谙掠涡盘柾?NF–κB或JNK)的激活具有重要作用[21]；RZ(RING and zinc finger)能夠與MATH結(jié)構(gòu)域相互作用并介導(dǎo)TRAF6的泛素化[22]；螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域是TRAF6泛素化和NF–κB信號通路活化所必需的[23]。

不同物種的TRAF6在不同組織中的表達(dá)量存在差異。本研究中TRAF6在已檢測的赤眼鱒組織中均有不同程度的表達(dá)，且在肝臟中的表達(dá)量最高，而半滑舌鰨的TRAF6基因在鰓中的表達(dá)量最高[11]，大黃魚的在脾臟中的表達(dá)量最高[5]，草魚的在頭腎中的表達(dá)量最高[9]。TRAF6在不同魚類中的表達(dá)模式存在差異，但均與免疫發(fā)生的組織或器官密切相關(guān)，據(jù)此可推測TRAF6可能在魚類的免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用。

本研究中赤眼鱒在感染GCRV后，其頭腎和脾臟中TRAF6的表達(dá)呈現(xiàn)出波動上調(diào)趨勢。這可能與TRAF6參與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(TRIF依賴性途徑和MyD88依賴性途徑)有關(guān)。TRAF6作為TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要接頭分子，它的上調(diào)表達(dá)會激活I(lǐng)RAK1/2、TAK1、IRF7等一系列上、下游因子[2]，但魚類的免疫信號通路較為復(fù)雜，赤眼鱒TRAF6在應(yīng)對GCRV抗病毒免疫反應(yīng)中的調(diào)控方式有待研究。

本研究結(jié)果表明，赤眼鱒TRAF6主要由RING結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)域、螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域和MATH結(jié)構(gòu)域組成，具有TRAFs家族的典型結(jié)構(gòu)特征，在健康赤眼鱒組織中的表達(dá)差異明顯；GCRV攻毒后，TRAF6在赤眼鱒脾臟和頭腎中的表達(dá)量上調(diào)。這些結(jié)果提示TRAF6參與了赤眼鱒抗GCRV的免疫應(yīng)答反應(yīng)，但其作用機(jī)制還有待研究。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Molecular cloning and expression characteristics response to GCRV of TRAF6 in Squaliobarbus curriculus

Chen Kaijian1,2, Wang Jing′an1#, Liu Qiaolin1,2, Wang Ronghua1, Xu Ying1, Zhao Xin1, Xiao Tiaoyi1,2*
(1.Hunan Engineering Research Center for Utilization of Characteristics of Aquatic Resources, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province, Changde, Hunan 415000, China)

Q785; S965

A

1007-1032(2016)06-0641-06

2016–10–20

2016–11–01

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31402289)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272652；31572615)

陳開健(1971—)，男，湖南永州人，博士，副教授，主要從事水生動物遺傳育種研究，chenkaijian2002@aliyun.com；#共同第一作者，王靜安(1993—)，女，浙江臺州人，碩士研究生，主要從事水生動物遺傳育種研究，409626183@qq.com；*通信作者，肖調(diào)義，博士，教授，主要從事水生動物遺傳育種研究，tyxiao1128@163.com