蛹蟲草中藍(lán)光受體基因Cmwc–1和Cmwc–2的表達(dá)特性分析

李琴，毛玉梅，付鳴佳，沈俊良，金華燕，鐘雪晴

(江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022)

蛹蟲草中藍(lán)光受體基因Cmwc–1和Cmwc–2的表達(dá)特性分析

李琴，毛玉梅#，付鳴佳*，沈俊良，金華燕，鐘雪晴

(江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022)

采用 RT–PCR克隆蛹蟲草中藍(lán)光受體基因Cmwc–1和Cmwc–2。結(jié)果表明，Cmwc–2基因序列的翻譯產(chǎn)物CmWC–2中存在1個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，蛹蟲草菌絲體Cmwc–1和Cmwc–2基因的表達(dá)量分別在藍(lán)光照射后6 h和2 h達(dá)到峰值。子實(shí)體形成不同階段Cmwc–1和Cmwc–2的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量都有較大差異，生長(zhǎng)50 d時(shí)蛹蟲草子實(shí)體不同部位的Cmwc–1表達(dá)主要在子實(shí)體的中下段，Cmwc–2的表達(dá)主要在子實(shí)體的頂端和中段，畸形子實(shí)體中Cmwc–1和Cmwc–2的表達(dá)量都不高。

蛹蟲草；藍(lán)光；藍(lán)光受體；基因Cmwc–1；基因Cmwc–2

投稿網(wǎng)址：http：//xb.ijournal.cn

真菌可感受環(huán)境中的各種信號(hào)因子，光照是其中重要的因子。藍(lán)光影響真菌的生長(zhǎng)和發(fā)育，可以導(dǎo)致真菌的形態(tài)建成和生理生化變化，包括無(wú)性孢子的產(chǎn)生[1–2]、菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育[3]、趨光性[4–5]和類胡蘿卜素產(chǎn)生[6–8]等。真菌受藍(lán)光影響的研究[4–5,9–16]已經(jīng)較為深入，已經(jīng)在多種真菌中克隆和測(cè)序了多個(gè)感受藍(lán)光信號(hào)的藍(lán)光受體蛋白基因，對(duì)其中藍(lán)光受體蛋白感受藍(lán)光信號(hào)相關(guān)機(jī)制的研究已較深入。真菌中藍(lán)光受體大都帶有PAS域 (Per–Arnt–Sim domain)，只是不同真菌來(lái)源藍(lán)光受體的PAS域數(shù)量有差異[4–5,9–16]。PAS域可以使不同藍(lán)光受體間結(jié)合成復(fù)合體(white collar complex，WCC)結(jié)構(gòu)[17–19]。此外，部分藍(lán)光受體中帶有LOV 域(light, oxygen or voltage domain)，可結(jié)合有色素基團(tuán)黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)，用于接受藍(lán)光信號(hào)[10,20]。真菌中藍(lán)光受體蛋白大多為鋅指蛋白(zinc finger protein)，表明藍(lán)光受體接受藍(lán)光信號(hào)以后轉(zhuǎn)變成有活性的轉(zhuǎn)錄因子，產(chǎn)生生理和生化效應(yīng)[4–5,9–14]。目前對(duì)脈孢菌(Neurospora crassa)中藍(lán)光受體蛋白White Collar–1(WC–1)、White Collar–2 (WC–2)和VIVID[9–11,21]的研究已比較成熟，這為其他真菌藍(lán)光受體的研究提供了依據(jù)。

蛹蟲草(Cordyceps militaris)是一種很重要的食藥兼用真菌。根據(jù)《中華人民共和國(guó)食品衛(wèi)生法》和《新資源食品管理辦法》，蛹蟲草已在中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部2009年3號(hào)公告中被列為新資源食品。目前對(duì)蛹蟲草的研究主要集中在蛹蟲草的栽培培養(yǎng)、有效成分提取和品種形態(tài)描述等方面，對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和子實(shí)體的形成機(jī)制研究不多。筆者對(duì)蛹蟲草中2個(gè)藍(lán)光受體基因進(jìn)行克隆，并對(duì)這2個(gè)藍(lán)光受體基因在蛹蟲草菌絲體和子實(shí)體中的表達(dá)特性進(jìn)行分析，旨在揭示光照對(duì)蛹蟲草子實(shí)體形成的影響。

1 材料和方法

1.1 菌種

蛹蟲草菌株(Cordyceps militaris F411)由江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 蛹蟲草菌絲體的藍(lán)光誘導(dǎo)培養(yǎng)和取樣

將蛹蟲草菌種接種在加了1%奶粉的PDA培養(yǎng)基中，在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將接種的培養(yǎng)皿用錫鉑紙包裹，在黑暗中培養(yǎng)4 d后去除錫鉑紙，持續(xù)進(jìn)行藍(lán)光光照培養(yǎng)，并在設(shè)定的照射時(shí)間點(diǎn)迅速將蛹蟲草置于–80 ℃冰凍，用于提取蛹蟲草總RNA。

1.3 蛹蟲草子實(shí)體的培養(yǎng)和取樣

將蛹蟲草已經(jīng)活化菌種接入到100 mL PDB培養(yǎng)基中，20 ℃搖菌至菌絲體成球狀，直徑約0.4 mm，而后取5 mL液體菌種接種到固體培養(yǎng)基中(將30 g優(yōu)質(zhì)大米加入到450 mL罐頭瓶中，再加入液體培養(yǎng)基35 mL，高壓121 ℃滅菌40 min)，于溫度20 ℃、相對(duì)濕度75%左右避光培養(yǎng)。待菌絲布滿整個(gè)平面并扎到瓶底時(shí)開始見光，補(bǔ)充日光燈照于溫度20 ℃、相對(duì)濕度70%下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基表面出現(xiàn)米粒狀的橘黃色菌蕾時(shí)換透氣瓶蓋，繼續(xù)見光培養(yǎng)至子實(shí)體形成。

待蛹蟲草形成子實(shí)體原基后取樣。取樣時(shí)分2種情況：一是對(duì)在不同階段的子實(shí)體取樣，分別是接種后18 d的菌絲體、接種后18 d的子實(shí)體原基、20 d子實(shí)體、24 d子實(shí)體、28 d子實(shí)體、32 d子實(shí)體、36 d子實(shí)體、40 d子實(shí)體和45 d子實(shí)體；二是對(duì)生長(zhǎng)50 d的正常子實(shí)體和畸形子實(shí)體取樣，其中將正常生長(zhǎng)的子實(shí)體分為頂端膨大部分、子實(shí)體上段(子實(shí)體上部1/3)、子實(shí)體中段(子實(shí)體中部1/3)和子實(shí)體下段(子實(shí)體下部1/3) 4個(gè)部分。每次取樣后，–80 ℃超低溫冰箱保存。

1.4 蛹蟲草總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

按照Trizol試劑(上海生工生物工程有限公司)說(shuō)明書提取蛹蟲草RNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和OD值檢測(cè)。以O(shè)ligo(dT)15為引物，用第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程有限公司)將所提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用作基因的克??；熒光定量cDNA第一鏈的合成參照PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser(大連寶生物工程有限公司)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 蛹蟲草Cmwc–1和Cmwc–2基因的克隆

根據(jù)http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez? db=Nucleotide&cmd=Search&term=AEVU01000000 NCBI上相關(guān)蛹蟲草序列Cordyceps militaris CM01 whole genome shotgun sequence contig55(GenBank序列號(hào)為AEVU010 00055.1)和contig5(GenBank序列號(hào)為AEVU01 000005.1)設(shè)計(jì)引物[22]。使用軟件ORF finder尋找藍(lán)光受體基因的ORF，再使用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)一系列引物(表1)。 PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性 40 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)。Cmwc–1–mRNA和Cmwc–1–mRNA的3'端采用3'–RACE方法進(jìn)行擴(kuò)增，其cDNA第一鏈的合成采用引物3'Adaptor Primer。1st PCR采用Downtouch PCR，引物GSP1和3'Outer；2nd PCR使用的引物為GSP2和3' Inner。

表1 PCR擴(kuò)增中用到的引物Table 1 Primers for PCR amplification

1.6 蛹蟲草Cmwc–1和Cmwc–2表達(dá)的real–time PCR檢測(cè)

針對(duì)Real–time PCR設(shè)計(jì)擴(kuò)增Cmwc–1基因和Cmwc–2基因的部分序列引物列于表2。內(nèi)標(biāo)基因采用管家基因甘油醛–3–磷酸脫氫酶(glyceraldehyde–3–phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因，在NCBI上搜索到了GAPDH基因(GenBank序列號(hào)為FJ374269.1)[23]，并設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(表2)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 次重復(fù)，取平均值，用2–ΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表2 在熒光定量PCR中用到的引物Table 2 Primers for RT–qPCR amplification

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草Cmwc–2的克隆和序列分析結(jié)果

將蛹蟲草總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA作為PCR的底物，用上游引物WC2e1及下游引物WC2e2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到Cmwc–2基因的序列，長(zhǎng)度約為1 575 bp(圖1)，通過3' 端RACE方法獲得了長(zhǎng)1 009 bp的3' 端序列。用DNAman軟件對(duì)上述兩端序列進(jìn)行拼接及比對(duì)，得到了Cmwc–2–mRNA的部分序列，其長(zhǎng)度為1 575 bp (其GenBank序列號(hào)為JX852619.1)，且ORF序列長(zhǎng)度為1 509 bp。

圖1 蛹蟲草Cmwc–2基因開放讀框中部分序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of partial sequence of PCR products from gene Cmwc–2 open reading frame in C. militaris

使用DNASTAR editseq的Translate DNA功能得到Cmwc–2基因ORF可能的翻譯后的蛋白質(zhì)CmWC–2，其氨基酸序列長(zhǎng)度為502 aa，GeneBank序列號(hào)為AFZ15762.1。序列呈送NCBI后初步確定為cutinase palindrome–binding protein。進(jìn)一步分析表明，CmWC–2包含1個(gè)PAS功能域(161～235)和1個(gè)GATA型的鋅指結(jié)構(gòu)域(447～484)。將CmWC–2的氨基酸序列在http：//smart.embl–heidelb erg.de/進(jìn)行在線分析，得到了與上述一致的結(jié)果(圖2)。 將CmWC–2氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行蛋白質(zhì)BLAST比對(duì)的結(jié)果表明，CmWC–2與多種真菌中的WC–2蛋白有很高的同源性。 用DNAman軟件將蛹蟲草中CmWC–2的PAS域和鋅指結(jié)構(gòu)域分別與7種真菌的WC–2相應(yīng)功能域進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果表明，CmWC–2與球孢白僵菌(Beauveria bassiana， NCBI參考序列號(hào)為XP_008594722.1)、Stachybotrys chlorohalonata (GenBank序列號(hào)為KFA63896.1)、脈孢菌(Neurospora crassa，GeneBank序列號(hào)為XP_963819.3)、冬蟲夏草(Ophiocordyceps sinensis，GenBank序列號(hào)為 EQK98372.1)、水稻惡苗病菌(Fusarium fujikuroi，GenBank序列號(hào)為CCT62872.1)、頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum，GenBank序列號(hào)為KFH41821.1)和羅伯茨綠僵菌(Metarhizium robertsii，NCBI 參考序列號(hào)為

XP_007823629.2)中相應(yīng)的功能結(jié)構(gòu)域都有同源性(圖3)。

圖2 蛹蟲草藍(lán)光受體CmWC–2的功能域Fig.2 Functional domain of blue light receptor CmWC–2 in C. militaris

圖3 不同真菌WC–2中的PAS結(jié)構(gòu)域與GATA型鋅指結(jié)構(gòu)域的同源性分析結(jié)果Fig. 3 Homology of PAS domain and GATA type of zinc finger domain in WC–2 for different fungus

2.2 蛹蟲草Cmwc–1的克隆和序列分析結(jié)果

用分段上游引物WC1e1U、WC1e2U、WC1e3U、WC1e4U、WC1e5U分別與分段下游引物WC1e1D、WC1e2D、WC1e3D、WC1e4D、WC1e5D對(duì)應(yīng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到Cmwc–1基因ORF的5個(gè)分段序列，3' 端RACE方法可獲得1 020 bp左右的序列。 將得到的序列采用DNAman軟件分析，Cmwc–1–mRNA長(zhǎng)為3 248 bp(GenBank序列號(hào)為JX845417.1)，且ORF序列長(zhǎng)度為2 892 bp。

用軟件DNASTAR editseq中的Translate對(duì)Cmwc–1基因進(jìn)行ORF翻譯后，獲得的蛋白質(zhì)CmWC–1的氨基酸序列長(zhǎng)度為963 aa(GenBank 序列號(hào)為AFU65172.1)。將其于NCBI上進(jìn)行蛋白質(zhì)分析比對(duì)的結(jié)果（圖 4）表明，此蛋白質(zhì)為GATA型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白(zinc finger domain–containing protein，GATA–type)，包含3個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域(324～440，520～618，639～734)和一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)功能域(836～882)。

圖4 蛹蟲草藍(lán)光受體CmWC–1的功能域Fig.4 Functional domain of blue light receptor CmWC–1 in C. militaris

2.3 蛹蟲草Cmwc–1和Cmwc–2基因表達(dá)的real–time PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 蛹蟲草菌絲體藍(lán)光誘導(dǎo)下的Cmwc–1和

Cmwc–2表達(dá)的real–time PCR檢測(cè)結(jié)果結(jié)果表明，Cmwc–1和Cmwc–2基因在無(wú)藍(lán)光情況下的相對(duì)表達(dá)量非常低，在有藍(lán)光情況下的相對(duì)表達(dá)量有很大的變化，其中Cmwc–2基因的相對(duì)表達(dá)量在持續(xù)藍(lán)光照射之初有個(gè)快速的上升，在藍(lán)光照射2 h的時(shí)候達(dá)到最大值，而后快速下降并維持在較低水平，至照射12 h時(shí)又開始快速上升，在照射14 h時(shí)出現(xiàn)第2次高峰，但轉(zhuǎn)錄水平值比照射2 h時(shí)的小(表3)。 Cmwc–1基因表達(dá)量的上升較慢，在藍(lán)光照射6 h時(shí)出現(xiàn)峰值，隨后平緩下降，在藍(lán)光照射22 h也再次出現(xiàn)峰值，轉(zhuǎn)錄水平也比照射6 h時(shí)的小(表3)。比較這2種藍(lán)光受體的表達(dá)，Cmwc–1基因的表達(dá)有一個(gè)明顯的滯后效應(yīng)，且Cmwc–2基因每次出現(xiàn)表達(dá)高峰時(shí)，Cmwc–1基因的表達(dá)也有所上升。另外Cmwc–2的相對(duì)表達(dá)量比Cmwc–1的相對(duì)表達(dá)量要高很多。

表3 藍(lán)光照射下蛹蟲草菌絲體Cmwc–1和Cmwc–2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量Table 3 mRNA relative expression level of gene Cmwc–1 and Cmwc–2 in C. militaris under the blue light radiation of different time

2.3.2 蛹蟲草子實(shí)體不同生長(zhǎng)階段Cmwc–1和

Cmwc–2表達(dá)的real–time PCR檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果表明：蛹蟲草每個(gè)生長(zhǎng)階段Cmwc–1和Cmwc–2的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量都有較大的差異(圖5)。Cmwc–1總體相對(duì)轉(zhuǎn)錄量較低，在菌絲體、原基和子實(shí)體0～1 cm階段相對(duì)轉(zhuǎn)錄量非常低，而在子實(shí)體長(zhǎng)至1～2 cm(生長(zhǎng)24 d)時(shí)上升很快，而后在子實(shí)體2～3 cm(生長(zhǎng)28 d)時(shí)又迅速降低，在子實(shí)體3～7 cm(生長(zhǎng)32～45 d)階段一直保持穩(wěn)定的低轉(zhuǎn)錄水平。Cmwc–2基因總體相對(duì)轉(zhuǎn)錄量較高，在菌絲體、原基和子實(shí)體0～3 cm(生長(zhǎng)18～28 d)時(shí)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量保持穩(wěn)定，在子實(shí)體3～4 cm(生長(zhǎng)32 d)時(shí)快速上升，而在子實(shí)體4～6 cm(生長(zhǎng)36～40 d)又降到了相對(duì)最低，最后在子實(shí)體6～7 cm(生長(zhǎng)45 d)時(shí)階段上升到了與子實(shí)體3～4 cm(生長(zhǎng)32 d)階段相當(dāng)?shù)乃健?/p>

圖5 蛹蟲草子實(shí)體不同生長(zhǎng)階段Cmwc–1和Cmwc–2的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 mRNA relative expression level of gene Cmwc–1 and Cmwc–2 at different growing stages of fruiting body of C. militaris

2.3.3 蛹蟲草子實(shí)體不同部位Cmwc–1和Cmwc–2表達(dá)的real–time檢測(cè)結(jié)果

蛹蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)過程中可產(chǎn)生正常子實(shí)體和畸形子實(shí)體，本研究中所用的為生長(zhǎng)50 d的正常子實(shí)體(子實(shí)體長(zhǎng)7～8 cm)和畸形子實(shí)體。將正常生長(zhǎng)的子實(shí)體分為4個(gè)部分：頂端膨大部分、子實(shí)體上段(子實(shí)體上部1/3)、子實(shí)體中段(子實(shí)體中部1/3)和子實(shí)體下段(子實(shí)體下部1/3)。 對(duì)正常子實(shí)體4個(gè)部分和畸形子實(shí)體的Cmwc–1、Cmwc–2表達(dá)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量進(jìn)行檢測(cè)與分析的結(jié)果(圖6)顯示：正常子實(shí)體中Cmwc–1在頂端膨大部分相對(duì)轉(zhuǎn)錄量極低，在子實(shí)體下段的轉(zhuǎn)錄量相對(duì)較高；畸形子實(shí)體Cmwc–1基因的轉(zhuǎn)錄水平與正常子實(shí)體中段的相似。Cmwc–2的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在子實(shí)體中段部分最高，在子實(shí)體頂端膨大部分較高，在其他部分的轉(zhuǎn)錄量相對(duì)較低；Cmwc–2在畸形子實(shí)體中的基因轉(zhuǎn)錄水平與正常子實(shí)體中段的相當(dāng)。

圖6 蛹蟲草子實(shí)體不同部位Cmwc–1和Cmwc–2的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 mRNA relative expression level of gene Cm wc–1 and Cmwc–2 at different fruiting body sections of C. militaris

3 結(jié)論與討論

藍(lán)光是很重要的環(huán)境因子，真菌可以感受到藍(lán)光信號(hào)，并產(chǎn)生生理和生化改變，而其感受藍(lán)光的重要機(jī)制就是在菌體中產(chǎn)生藍(lán)光受體。本研究中克隆了蛹蟲草2個(gè)藍(lán)光受體基因Cmwc–1和Cmwc–2的ORF序列，并確定了這2個(gè)基因翻譯產(chǎn)物CmWC–1和CmWC–2的氨基酸序列。結(jié)果表明，在CmWC–1中有3個(gè)PAS域(其中第1個(gè)PAS域也稱做LOV域)和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。該結(jié)果與文獻(xiàn)[24]中的CmWC–1基本相同。在CmWC–2中有1個(gè)PAS域和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域， CmWC–2與另外7種真菌藍(lán)光受體WC–2相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的同源性很高。CmWC–1和CmWC–2的結(jié)構(gòu)與脈孢菌中藍(lán)光受體蛋白WC–1和WC–2的結(jié)構(gòu)類似[9,11]，CmWC–1和CmWC–2是蛹蟲草中的藍(lán)光受體蛋白。蛹蟲草中藍(lán)光受體蛋白WC–1和WC–2均帶有PAS結(jié)構(gòu)域，表明這2個(gè)藍(lán)光受體在行使功能時(shí)可形成CmWC–1/CmWC–2復(fù)合體結(jié)構(gòu)。

藍(lán)光受體WC–1和WC–2帶有鋅指結(jié)構(gòu)，表明這類蛋白質(zhì)為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控其他基因的表達(dá)[9–11]。蛹蟲草Cmwc–1和Cmwc–2基因的充分表達(dá)在藍(lán)光照射6 h比較合適，Cmwc–1轉(zhuǎn)錄水平峰值的出現(xiàn)與Cmwc–2的并不同步。在脈孢菌中wc–1基因的表達(dá)對(duì)wc–2基因的表達(dá)存在負(fù)反饋?zhàn)饔肹18]。蛹蟲草中Cmwc–1和Cmwc–2基因表達(dá)的不同步可推測(cè)這種負(fù)反饋機(jī)制可能存在。

Cmwc–2基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量比Cmwc–1基因的高很多。在脈孢菌中，WC–1和WC–2通過PAS域形成復(fù)合體(white collar complex ，WCC)結(jié)構(gòu)，且WCC復(fù)合體中含有超過1個(gè)以上的WC–1分子[18]，所以蛹蟲草中Cmwc–1和Cmwc–2基因表達(dá)量的差異表明在形成CmWC–1/CmWC–2復(fù)合體時(shí)，其復(fù)合體結(jié)構(gòu)不同于脈孢菌中的WCC結(jié)構(gòu)。

在蛹蟲草的菌絲體和子實(shí)體中均存在Cmwc–1和Cmwc–2基因的表達(dá),說(shuō)明這2個(gè)藍(lán)光受體基因的表達(dá)產(chǎn)物形成的CmWC–1/CmWC–2復(fù)合體對(duì)蛹蟲草菌絲體和子實(shí)體發(fā)育有重要作用。這2個(gè)基因在蛹蟲草子實(shí)體不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量不同。 Cmwc–1在子實(shí)體形成前期的表達(dá)量很低，在接近中期時(shí)有個(gè)快速的增長(zhǎng)，中后期的表達(dá)比較穩(wěn)定；Cmwc–2的相對(duì)表達(dá)量在子實(shí)體形成的前期和中期都維持在一個(gè)較高的水平，在中后期有較大的波動(dòng)。由此可推測(cè)：在子實(shí)體形成的前期和中期，Cmwc–1和Cmwc–2基因表達(dá)有利于促進(jìn)CmWC–1/ CmWC–2復(fù)合體的形成和子實(shí)體的生長(zhǎng)發(fā)育。這2個(gè)基因在蛹蟲草子實(shí)體不同部位的相對(duì)表達(dá)量也不同， Cmwc–1在子實(shí)體頂端的表達(dá)量極低，其表達(dá)主要集中在子實(shí)體的中下段部位，而Cmwc–2在子實(shí)體的頂端部位和中段部位均有較好的表達(dá)。這表明子實(shí)體頂端的生長(zhǎng)不依賴于CmWC–1/ CmWC–2復(fù)合體的形成，而子實(shí)體中、下部分的生長(zhǎng)可能依賴CmWC–1/CmWC–2復(fù)合體結(jié)構(gòu)。

[1] Corrochano L M，Cerda-Olmedo E．Sex，light and carotenes：the development of Phycomyces[J]．TrendsGenet，1992，8(8)：268–274．

[2] Kertesz-Chaloupkova K，Walser P J，Granado J D，et al. Blue light overrides repression of asexual sporulation by mating type genes in the basidiomycete Coprinus cinereus[J]．Fungal Genet Biol，1998，23(1)：95–109．

[3] Lauter F R，Marchfelder U，Russo V E A，et al. Photoregulation of cot–1，a kinase-encoding gene involved in hyphal growth in Neurospora crassa[J]. Fungal Genet Biol，1998，23(3)：300–310．

[4] Idnurm A，Rodriguez-Romero J，Corrochano L M，et al. The Phycomyces madA gene encodes a blue–light photoreceptor for phototropism and other light responses [J]．Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(12)：4546–4551．

[5] Sanz C，Rodríguez-Romero J，Idnurm A，et al．From the cover：Phycomyces MADB interacts with MADA to form the primary photoreceptor complex for fungal phototropism [J]．Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(17)：7095–7100．

[6] 付鳴佳，王小菁．藍(lán)光誘導(dǎo)的膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)類胡蘿卜素積累[J]．微生物學(xué)報(bào)，2005，45(5)：795–797．

[7] 付鳴佳，王小菁，黃文芳．藍(lán)光誘導(dǎo)蛹蟲草菌絲類胡蘿卜素的積累[J]．微生物學(xué)通報(bào)，2005，32(5)：24–28．

[8] Harding R W，Turner R V．Photoregulation of the carotenoid biosynthetic pathway in albino and white collar mutants of Neurospora crassa [J]．Plant Physiol，1981，68(3)：745–749．

[9] Ballario P，Vittorioso P，Magrelli A，et al．White collar–1，a central regulator of blue light responses in Neurospora，is a zinc finger protein [J]．EMBO J，1996，15：1650–1657．

[10] He Q，Cheng P，Yang Y，et al．White collar–1，a DNA binding transcription factor and a light sensor [J]．Science，2002 ，297(5582)：840–843．

[11] Linden H，Macino G．White collar 2，a partner in blue-light signal transduction，controlling expression of light–regulated genes in Neurospora crassa[J]．The EMBO J，1997，16：98–109．

[12] Silva F，Torres-Martínez S，Garre V．Distinct white collar–1 genes control specific light responses in Mucor circinelloides[J]．Mol Microbiol，2006，61(4)：1023–1037．

[13] Silva F，Navarro E，Pe?aranda A，et al．A ring-finger protein regulates carotenogenesis via proteolysisindependent ubiquitylation of a white collar–1–like activator [J]．Mol Microbiol，2008，70(4)：1026–1036．

[14] Purschwitz J，Müller S，Kastner C，et al. Functional and physical interaction of blue and red-light sensors in Aspergillus nidulans [J]．Current Biology，2008，18(4)：255–259．

[15] Kihara J，Moriwaki A，Tanaka N，et al. Characterization of the BLR1 gene encodinga putative blue-light regulator in the phytopathogenic fungus Bipolaris oryzae[J]. FEMS Microbiol Lett，2007，266(1)：110–118．

[16] Schmoll M，F(xiàn)ranchi L，Kubicek C P．Envoy，a PAS/LOV domain protein of Hypocrea jecorina (Anamorph Trichoderma reesei)，modulates cellulase gene transcription in response to light [J]．Eukaryotic Cell，2005，4(12)：1998–2007．

[17] Cheng P，Yang Y，Gardner K H，et al．PAS domainmediated WC–1/WC–2 interaction is essential for maintaining the steady–state level of WC–1 and the function of both proteins in circadian clock and light responses of Neurospora [J]．Mol Cell Biol，2002，22：517–524．

[18] Cheng P，Yang Y，Wang L，et al．WHITE COLLAR–1，a multifunctional Neurospora protein involved in the circadian feedback loops，light sensing，and transcription repression of wc–2[J]．The Journal of Biological Chemistry，2003，278(6)：3801–3808．

[19] Talora C，F(xiàn)ranchi L，Linden H，et al．Role of a white collar–1–white collar–2 complex in blue–light signal transduction [J]．EMBO J，1999，18：4961–4968．

[20] Froehlich A C，Liu Y，Loros J J，et al．White Collar–1，a circadian blue light photoreceptor，binding to the frequency promoter [J]．Science，2002，297(5582)：815–819．

[21] Schwerdtfeger C，Linden H．VIVID is a flavoprotein and serves as a fungal blue light photoreceptor for photoadaptation [J]．EMBO J，2003，22(18)：4846–4855．

[22] Zheng P，Xia Y，Xiao G，et al．Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris，a valued traditional Chinese medicine [J]．Genome Biol，2011，12(11)：R116．

[23] Gong Z，Su Y，Huang L，et al．Cloning and analysis of glyceraldehyde–3–phosphate dehydrogenase gene from Cordyceps militaris [J]．Afr J Agric Res，2009，4(4)：402–408．

[24] Yang T，Dong C．Photo morphogenesis and photo response of the blue-light receptor gene Cmwc–1 in different strains of Cordyceps militaris[J]．FEMS Microbiol Lett，2014，352：190–197．

責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫(kù)

Expression characteristics of blue light receptor Cmwc–1 and Cmwc–2 gene from Cordyceps militaris

Li Qin, Mao Yumei#，F(xiàn)u Mingjia*, Shen Junliang, Jin Huayan, Zhong Xueqing
(College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

ORF sequence of gene Cmwc–1 and Cmwc–2, the blue light receptor, were cloned from fungus Cordyceps militaris by approach of RT–PCR. There were 1 PAS functional domains and 1 zinc finger functional domain at putative CmWC–2 amino acid sequence in Cmwc–2 ORF. The real-time PCR results showed that the translation of gene Cmwc–1 and Cmwc–2 reached their peaks in 6 h and 2 h, respectively. The relative transcription level of gene Cmwc–1 and Cmwc–2 were quite different according to their growing stages. The relative transcription level of Cmwc–1 was mainly distributed at the middle and lower section of fruiting body, and rarely spotted at the top after 50 d inoculation, while, it was mainly at the top and the middle section for Cmwc–2. There were little relative transcription level of Cmwc–1 and Cmwc–2 in abnormal fruiting body.

Cordyceps militaris; blue light; blue light receptor; Cmwc–1; Cmwc–2

Q939.5

A

1007-1032(2016)06-0601-07

2015–12–31

2016–10–24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060004；31260010)

李琴(1990—)，女，江西南昌人，碩士研究生，主要從事真菌分子生物學(xué)研究，15070811079@163.com；#共同第一作者，毛玉梅(1989—)，女，山東聊城人，碩士研究生，主要從事真菌分子生物學(xué)研究，maoyumei.love@163.com；*通信作者，付鳴佳，博士，教授，主要從事真菌分子生物學(xué)研究，mingjiafu@126.com