高效液相色譜法檢測間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉

姚麗利，施介華，2

（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014；2.浙江工業(yè)大學(xué)綠色化學(xué)合成技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江杭州310014）

分析測試

高效液相色譜法檢測間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉

姚麗利1，施介華1，2

（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014；2.浙江工業(yè)大學(xué)綠色化學(xué)合成技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江杭州310014）

采用高效液相色譜法同時測定間硝基苯磺酸鈉和間氨基苯磺酸。考察了流動相比例、流動相pH等影響因素，并對選定的色譜條件進(jìn)行了方法學(xué)的驗(yàn)證。結(jié)果表明：使用Waters Atlantis C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5.0μm)，流動相為磷酸二氫鉀溶液：甲醇=9∶1，其中磷酸二氫鉀溶液濃度為20 mmol/L，pH為3.5，檢測波長220 nm，流速為1 mL/min，柱溫為25℃能達(dá)到分離效果，此方法的精密度、線性和回收率均達(dá)到要求。該方法分析快速準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好。

閉口閃點(diǎn)；車用柴油；標(biāo)準(zhǔn)不確定度評估

間氨基苯磺酸是一種重要的化工中間體，在偶氮染料、醫(yī)藥、農(nóng)藥、顯影劑等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-4]。間氨基苯磺酸的傳統(tǒng)制備方法是采用鐵粉還原間硝基苯磺酸鈉，并酸化得到的，但該方法生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量廢酸，污染嚴(yán)重[5，7]。另外還可以采用電化學(xué)法合成[6-7]，只是耗電量很大、成本過高。而在文獻(xiàn)中也有許多使用金屬催化劑催化加氫制備間氨基苯磺酸的報(bào)道[7-9]，此方法不僅符合綠色生產(chǎn)的要求，且產(chǎn)品質(zhì)量好。傳統(tǒng)上分析間氨基苯磺酸純度是測定氨基值，此方法滴定過程繁瑣，且準(zhǔn)確性差。白雪松等[10]用四乙基溴化銨做離子對色譜分析間氨基苯磺酸和其雜質(zhì)。

本文使用Waters 2695-2996高效液相色譜儀，在Waters Atlantis C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5.0μm）上，流動相為磷酸二氫鉀溶液：甲醇=9∶1，其中磷酸二氫鉀溶液濃度為20 mmol/L，pH為3.5，檢測波長220 nm，流速為1 mL/min，柱溫為25℃，在此條件下，能很好的分離間硝基苯磺酸鈉和間氨基苯磺酸以及雜質(zhì)，并對此色譜條件進(jìn)行方法學(xué)的驗(yàn)證，精密度、線性和回收率均達(dá)到要求。此方法分離效能高，分析快速準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，測定結(jié)果令人滿意。適用于間氨基苯磺酸生產(chǎn)過程的動態(tài)監(jiān)測及產(chǎn)品質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Alliance 2695型高效液相色譜儀，配2996二極管陣列檢測器和Empower色譜工作站（美國Waters公司）；Waters Atlantis C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5.0μm）（美國Waters公司）；AL-204電子天平（TETTLER TOLEDO）；PS-10A超聲波清洗機(jī)（潔康公司）；pHS-4型酸度計(jì)（杭州亞美電子儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵；1810B自動雙重純水蒸餾器（上海玻璃儀器廠）。間硝基苯磺酸鈉（Aladdin industrial corporation）；間氨基苯磺酸（Aladdin industrial corporation）；磷酸二氫鉀（湖州化學(xué)試劑有限公司），甲醇（天津四友）；二次蒸餾水。

1.2 溶液配制

磷酸二氫鉀溶液：稱取磷酸二氫鉀2.7218 g，超聲溶解，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，用雙蒸水定容至刻度，配成20 mmol/L的磷酸二氫鉀溶液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的磷酸溶液調(diào)節(jié)至所需pH，過濾后待用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取100 mg間硝基苯磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品和間氨基苯磺酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 ml容量瓶中，用流動相溶解并定容，充分搖勻，配成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品溶液：用移液管量取1 mL反應(yīng)液于100 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，充分搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾后待用。

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0μm）；流動相：20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液：甲醇=9：1（其中磷酸二氫鉀溶液的pH為3.5）；進(jìn)樣量：10μL；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：220 nm。

2 結(jié)果和討論

2.1 色譜分離條件的選擇

2.1.1 波長的選擇

在實(shí)驗(yàn)過程中作者發(fā)現(xiàn)間硝基苯磺酸鈉和間氨基苯磺酸的保留時間相差比較大，分離度較好，能實(shí)現(xiàn)較好的分離。其中間氨基苯磺酸的保留時間較短，同時，作者發(fā)現(xiàn)了一個雜質(zhì)，其保留時間與間氨基苯磺酸接近，甚至在某些色譜條件下，雜質(zhì)并不能被檢出，所以選擇波長需要考慮間硝基苯磺酸鈉、間氨基苯磺酸和雜質(zhì)能同時被檢出。圖1是間氨基苯磺酸，間硝基苯磺酸鈉及雜質(zhì)的紫外吸收光譜圖。從圖中可見，三者的最大吸收波長差異較大。雜質(zhì)的最大吸收波長為248 nm，間氨基苯磺酸的最大吸收波長為237 nm，間氨基苯磺酸的最大吸收波長為260 nm，為了提高間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉的檢測靈敏度，且為了得到的峰型良好，選擇末端吸收的220 nm為檢測波長。

2.1.2 流動相比例的選擇

表1是磷酸二氫鉀溶液和甲醇比例變化對間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉保留行為的影響。從表中可見，間氨基苯磺酸保留時間較短，保留較弱，且隨著流動相中磷酸二氫鉀溶液和甲醇比例變化，其保留時間變化不是很大；但還是可以發(fā)現(xiàn)隨著甲醇比例變小，間氨基苯磺酸的保留時間略有變長。而間硝基苯磺酸鈉保留時間適當(dāng)，保留較好，且隨著流動相中磷酸二氫鉀溶液和甲醇比例變化，其保留時間變化比較明顯；隨著甲醇比例變小，間硝基苯磺酸鈉的保留時間明顯變長。隨著流動相中磷酸二氫鉀溶液和甲醇比例變化，間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉兩者都能有較好分離。

圖1 間氨基苯磺酸（a），間硝基苯磺酸鈉（b）及雜質(zhì)（c）的紫外吸收光譜圖Figure 1 Ultraviolet absorption spectrum of 3-aminobenzenesulfonic acid（a），sodium 3-nitrobenzenesulfonate（b）and impurity（c）

雜質(zhì)與間氨基苯磺酸的保留時間很接近，由表1可知，有機(jī)相比例不夠低時，雜質(zhì)與間氨基苯磺酸共同出峰，所以在間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉分離和檢測中主要是要考察將雜質(zhì)和間氨基苯磺酸能夠分開的條件。

雖然間氨基苯磺酸和雜質(zhì)的保留時間都比較短，但是雜質(zhì)的保留時間比間氨基苯磺酸更短，且可以明顯發(fā)現(xiàn)，隨著甲醇比例的減小，雜質(zhì)和間氨基苯磺酸有逐漸分離的趨勢。當(dāng)流動相中20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液：甲醇=8∶2時雜質(zhì)和間氨基苯磺酸的分離度為1.332，未達(dá)到分離的要求，而當(dāng)流動相中20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液：甲醇=9∶1時雜質(zhì)和間氨基苯磺酸的分離度為2.483，達(dá)到分離的要求，所以選擇此流動相比例作為分離的流動相。

表1 pH為3.5時不同流動相比例下的保留時間和分離度Table 1 Retention time and resolution of pH for 3.5 by differentmobile phase

2.1.2 pH的選擇

在選定流動相比例的情況下，研究在不同pH條件下雜質(zhì)、間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉的保留時間以及間氨基苯磺酸和雜質(zhì)的分離度情況，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉保留時間隨流動相pH值增大而增大，間氨基苯磺酸鈉與雜質(zhì)間的分離度隨pH值增大先增大再減小。當(dāng)pH=2.5時，雜質(zhì)與間氨基苯磺酸鈉分離度為1.18，當(dāng)pH=3.0～3.5時，雜質(zhì)與間氨基苯磺酸鈉的分離效果較好，分離度達(dá)2.48～2.53，即達(dá)基線分離。當(dāng)pH=4.0時，雖然分離度大于1.5，但是間硝基苯磺酸鈉拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。因此選擇了流動相pH=3.5。

表2 20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液：甲醇=9：1時不同pH下的保留時間和分離度Table 2 Retention time and resolution of 20 m mol/L potassium dihydrogan phosphate solution：methanol=9∶1 for different pH

通過流動相組成和流動相pH值的選擇，確定民時分離測定間氨基苯磺酸鈉和間硝基苯磺酸鈉的色譜條件為：

色譜柱：Waters Atlantis C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0μm）；流動相：20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液：甲醇=9∶1（其中磷酸二氫鉀溶液的pH為3.5）；進(jìn)樣量：10μL；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：220 nm。

在此色譜條件下，間氨基苯磺酸鈉試樣中間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉以及雜質(zhì)間具有良好分離效果，見圖2。

圖2 間硝基苯磺酸鈉和間氨基苯磺酸混合液的高效液相色譜圖Figure 2 High performance liquid chromatogram figure of the mixture of sodium 3-nitrobenzenesulfonic acid and 3-aminobenzenesulfonic acid

2.2 線性范圍的測定

將不同濃度的間硝基苯磺酸鈉和間氨基苯磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述選定的色譜測定條件下混合進(jìn)樣進(jìn)行分析測定，進(jìn)樣體積為10μL。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3所示，在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，間硝基苯磺酸鈉和間氨基苯磺酸與其峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其中間硝基苯磺酸鈉的線性回歸方程為A1=2.4653C1-0.0003（R2=0.9979），間氨基苯磺酸的線性回歸方程為A2=1.6411C2+0.0534（R2= 0.9995）。

圖3 間硝基苯磺酸鈉（a）和間氨基苯磺酸（b）標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Standard curve of the sodium 3-nitrobenzenesulfonic acid（a）and 3-aminobenzenesulfonic acid（b）

2.3 方法的精密度測定

為了考察該方法的精密度還做了重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，對同一份試樣用相同方法配制9份樣品，分別進(jìn)樣，測得保留時間和峰面積結(jié)果如表3所示。

2.4 方法的回收率測定

在已知含量的樣品中加入80%、100%、120%的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)樣三次測定回收率，結(jié)果如表4所示。測得間硝基苯磺酸鈉的回收率范圍為100.57%～102.62%，平均回收率為101.50%。間氨基苯磺酸的回收率范圍為98.03%～100.09%，平均回收率為98.86%。

2.5 樣品檢測

按照建立的液相方法，選取兩批反應(yīng)液進(jìn)行測定，每個樣品測定兩次，結(jié)果表5所示。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的保留時間和峰面積Table 3 Retention time and peak area ofrepeated experiments

表4 間氨基苯磺酸和間硝基苯磺酸鈉的回收率Table 4 The recovery of sodium 3-nitrobenzenesulfonic acid and 3-aminobenzenesulfonic acid

3 結(jié)論

以上結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，本文所建立的高效液相色譜法可以進(jìn)行間硝基苯磺酸鈉、間氨基苯磺酸和雜質(zhì)的檢測和分析，操作簡單快速、靈敏準(zhǔn)確，樣品不需要任何預(yù)處理，適用于生產(chǎn)過程的動態(tài)監(jiān)測及質(zhì)量控制分析。

表5 反應(yīng)液樣品測定Table 5 Determination of reaction samples

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HPLC Method for the Determination of 3-Aminobenzenesulfonic Acid and Sodium 3-nitrobenzenesulfonate

YAO Li-li1，SHIJie-hua1,2
(1.College of Phamaceutical Science，Zhejiang Universal of Technology，Hangzhou，Zhejiang 310014，China;2.State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry-Synthesis Technology，Zhejiang Universal of Technology，Hangzhou，Zhejiang 310014，China)

A high performance liquid chromatographic method was used to determine the 3-aminobenzenesulfonic Acid and Sodium 3-nitrobenzenesulfonate.The influencing factors such as the proportion of mobile phase and pH of mobile phase were investigated，and the methods of the selected chromatographic conditions were verified.Results show that using the waters Atlantis C18 column（4.6 mm×150 mm，5.0μm），with the mobile phase of potassium dihydrogan phosphate solution：methanol=9∶1，which concentration of potassium dihydrogan phosphate solution for 20 mmol/L and the pH of 3.5，the detection wavelength was 220 nm.The flow rate was 1 mL/min.The column temperature is 25℃.The method can achieve the separation effect and the method of of precision，linearity and recovery rate are all up to the requirements.The method is accurate，sensitive and reproducible.

HPLC；3-aminobenzenesulfonic acid；sodium 3-nitrobenzenesulfonate

1006-4184（2016）11-005-05

2016-06-28

姚麗利（1990-），女，研究方向：藥物分析。E-mail：443795683@qq.com。

*通訊作者：施介華，男，教授，博士生導(dǎo)師。