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    含提取大豆蛋白的載上皮細(xì)胞型微載體制備方法與工藝優(yōu)化

    2016-12-19 09:43:16王克益蘭州理工大學(xué)楊晨光
    中國食品工業(yè) 2016年1期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)理工大學(xué)殼聚糖

    王克益 蘭州理工大學(xué) 楊晨光

    (蘭州理工大學(xué))

    含提取大豆蛋白的載上皮細(xì)胞型微載體制備方法與工藝優(yōu)化

    王克益 蘭州理工大學(xué) 楊晨光

    (蘭州理工大學(xué))

    利用殼聚糖和大豆提取蛋白質(zhì)作為主要材料,運用乳化交聯(lián)法,制備粒徑在17到25微米之間的微球。大豆蛋白交聯(lián)后的微載體內(nèi)部孔隙度為80.14%,優(yōu)于作為對照組的殼聚糖/明膠微載體。通過設(shè)計一組單因素實驗,制備大豆蛋白交聯(lián)微載體的工藝最優(yōu)條件確定如下:大豆蛋白含量為62.5%,大豆蛋白和殼聚糖的比例是3:2到2:1之間,所制備的微載體外形和性能最佳。上皮細(xì)胞在大豆蛋白交聯(lián)微載體表面貼合并呈球形生長。細(xì)胞培養(yǎng)實驗及顯微鏡觀察表明,大豆蛋白交聯(lián)的微載體具有優(yōu)秀的細(xì)胞親和力。進(jìn)一步的電子顯微鏡觀測表明,大豆蛋白交聯(lián)微載體的表面極其適合細(xì)胞貼附生長。實驗表明,大豆蛋白可以作為一種更新更廉價的材料,去制備微載體。

    大豆蛋白;微載體;乳化交聯(lián);上皮細(xì)胞

    1、簡介

    皮膚移植手術(shù)是一種可以替代壞死的皮膚手術(shù)[1]。殖皮手術(shù)需要培養(yǎng)大量的上皮細(xì)胞,以替換壞死的皮膚[2]。為了實現(xiàn)這一目標(biāo),在實際手術(shù)中需要制備一種與上皮細(xì)胞親和性較好,并且可以使上皮細(xì)胞在其表面高密度培養(yǎng)與養(yǎng)分供給的微載體[3]。

    殼聚糖是一種合適的生物材料,因其生物相容性和生物可降解性廣泛應(yīng)用于制備微球[4]。此外殼聚糖和 多糖(GAGs)具有相似的結(jié)構(gòu),而 多糖恰好是細(xì)胞外基質(zhì)成分,這也是應(yīng)用殼聚糖的另外一個原因[5]。

    大豆蛋白在大豆中的含量高達(dá)60%到70%[6]。更重要的是,動物類蛋白可能會包含一些未知疾病源,而大豆蛋白可以恰好避免這一缺陷[7]。這意味著大豆蛋白來源廣、價格低,且安全性較高,將是一種可以應(yīng)用于微載體制備的新材料。在本研究中,采用殼聚糖和提取自大都的蛋白作為原材料,應(yīng)用乳化交聯(lián)法,制備微載體,并設(shè)計單因素實驗優(yōu)化工藝。

    2、實驗材料和方法

    2.1 實驗材料

    殼聚糖(分子量1.21.2×106)購買自中慶化工,明膠(分子量1.4×104)購買自光復(fù)化工。雄性Wister大鼠購買自蘭州大學(xué)實驗動物中心。其他化學(xué)試劑均為分析純。

    2.2 大豆蛋白提取和檢測

    將大豆浸泡于10倍蒸餾水中24小時,粉碎,滴加0.1mol/ mL氫氧化鈉溶液,使pH保持在9,并控制溫度處于25℃,過夜后放入離心機(jī)除去雜質(zhì)。上清液滴加0.1mol/mL的鹽酸溶液,使pH為4.5,常溫下靜置2h。然后離心除去上清液,蒸餾水洗滌后冷凍干燥機(jī)干燥得到提取蛋白。運用比色法檢測所提取的大豆蛋白的性質(zhì)與含量。

    2.3 微載體制備與工藝優(yōu)化

    將殼聚糖和提取的蛋白溶解于1%醋酸溶液中,加入一定比例的甲苯和四氯化碳作為乳化劑,反應(yīng)2小時候加入一定比例乳化劑斯班80,之后在390轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速度下持續(xù)攪拌2h,保持溫度一直處于40℃,最終得到乳化液中的微載體。將整個液體抽濾,并用蒸餾水洗滌,烘干后得到含大豆蛋白的殼聚糖微載體。之后利用響應(yīng)面分析軟件得到工藝優(yōu)化的范圍值。

    2.4 微載體表征

    上皮細(xì)胞培養(yǎng)與分離方法參考Mazumder等的文章描述[8]分別將微載體與上皮細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)12,24,36h,觀察細(xì)胞生長狀況。

    3、實驗結(jié)果

    3.1 蛋白提取

    提取的大豆蛋白粉如圖1-1所示,為白色至淡棕色外觀不規(guī)則的白色粉末,顯色法實驗表明,蛋白粉末與考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)顯藍(lán)色。這些結(jié)果表明,提取所得的為大豆蛋白。光鏡下微載體形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖1-2所示,含大豆蛋白微載體呈粒徑均一的球形。電鏡下微載體特征如圖1-3和1-4所示。

    圖1.提取自大豆的蛋白粉及微載體表征

    3.2 工藝優(yōu)化結(jié)果分析

    響應(yīng)面曲線方差分析結(jié)果如表1所示。以微載體孔隙率作為參照標(biāo)準(zhǔn),建立模型,模型的F值是15.2,且具有顯著性差異。表明模型可以說明微載體工藝優(yōu)化中各參數(shù)對微載體孔隙率的影響程度。圖2-1是本次實驗數(shù)據(jù)的散點分布圖,實驗數(shù)據(jù)點集中于對角線上,這表明所建立的模型方程可以準(zhǔn)確預(yù)測實驗數(shù)據(jù)。圖2-2、圖2-3和圖2-4顯示了孔隙度受其他三個因素的影響。這三個數(shù)據(jù)的趨勢表明,甲苯和四氯化碳比例對微球孔隙度的影響并不顯著。影響比較顯著的是殼聚糖與大豆蛋白的比例和交聯(lián)劑用量。圖2也表明,殼聚糖與大豆蛋白比例的最佳范圍是3:2到2:1,交聯(lián)劑的最佳范圍從5.2到5.8毫升,甲苯與四氯化碳比例是1:3。在這些條件下,可以獲得親和性較好的、孔隙度為80.14%的大豆蛋白-殼聚糖微載體。

    圖2. 微載體制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析(圖2-1為散點分布圖,圖2-2,2-3,2-4分別為殼聚糖與大豆蛋白比例,乳化劑用量和交聯(lián)劑用量響應(yīng)面曲線圖)

    3.3 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

    細(xì)胞培養(yǎng)實驗結(jié)果如圖3所示,大豆蛋白-殼聚糖微載體與細(xì)胞具有良好的親和性,在12,24,36h后觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞明顯貼附微載體生長。

    圖3. 蛋白質(zhì)-殼聚糖微載體細(xì)胞培養(yǎng)圖(a1、b1、c1、d1分別為培養(yǎng)0、12、24、36h后細(xì)胞生長情況)

    4、結(jié)論

    實驗證明,大豆蛋白-殼聚糖微載體表現(xiàn)出作為上皮細(xì)胞載體的極大潛力。添加了大豆蛋白的微載在粒徑、孔隙度、抗壓性能、密度和形狀上都顯示了較好的性能。這可以有效地降低生產(chǎn)成本??傊?大豆蛋白-殼聚糖微載體在細(xì)胞培養(yǎng)載體方面具有較高的意義。

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