野生玫瑰基因組DNA提取及CDDP引物篩選

姜麗媛+臧德奎+李文清

摘要：野生玫瑰中多糖多酚含量較高，DNA提取較為困難，本試驗在植物基因組DNA CTAB提取法的基礎(chǔ)上，通過延長水浴時間、調(diào)整氯仿-異戊醇（24∶1）抽提次數(shù)為2～3次等一系列方法提高野生玫瑰基因組DNA的提取純度。以2×Es Taq MasterMix（含染料）10 μL，40 ng/μL DNA模板1 μL，10 pmol/μL引物 1 μL， ddH2O 8 μL為CDDP-PCR反應(yīng)體系，對21條CDDP引物進行多態(tài)性篩選。結(jié)果表明，用改良的CTAB法提取的野生玫瑰基因組DNA純度較高；21條CDDP引物中有16條對野生玫瑰品種的鑒別能力較高。本研究為野生玫瑰CDDP分子標記及后續(xù)各種分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：野生玫瑰；改良CTAB法；DNA提?。?CDDP分子標記

中圖分類號：S685.120.1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）11-0013-05

Abstract DNA extraction of Rosa rugosa is difficult for their high contents of polyphenol and polysaccharide. Here a modified CTAB method for Rosa rugosa DNA extraction was presented through extending water-bath time， appropriately adjusting chloroform isoamyl alcohol （24∶1） extraction time to 2～3 times and etc. Twenty-one CDDP polymorphic primers were screened with reaction system containing 10 μL of 2 ×Es Taq MasterMix （including dye）， 1 μL of 40 ng/μL DNA template， 1 μL of 10 pmol/μL primer and 8 μL of ddH2O. The results showed that the genomic DNA of Rosa rugosa extracted with modified CTAB method owned high purity，and 16 CDDP primers had higher discriminating ability on Rosa rugosa. This research provided bases for CDDP molecular markers and subsequent molecular biology researches of Rosa rugosa.

Keywords Rosa rugosa； Modified CTAB method； DNA extraction； CDDP molecular marker

野生玫瑰（Rosa rugosa）是國家二級瀕危保護植物，分布在我國吉林圖們江河口、遼寧南部海岸以及山東東部沿海海岸[1]。野生玫瑰內(nèi)含有芬香、抗寒、抗旱等性狀基因，是栽培玫瑰育種資源的依托，因此深入了解野生玫瑰的遺傳變異、保護野生玫瑰資源具有重要意義。

基因組DNA是文庫構(gòu)建、分子標記、基因克隆等分子生物學(xué)研究的基本前提，其提取純度直接影響整個試驗的質(zhì)量。由于不同植物體細胞內(nèi)各種化學(xué)成分含量存在很大的差異，其DNA提取方法可能不同，甚至相同植物不同部位的 DNA 提取策略也不同[2]。

隨著以PCR為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)的迅速發(fā)展，分子標記輔助育種成為當前國際植物遺傳育種研究的熱點[3]。來源保守的DNA序列多態(tài)性（conserved DNA-derived polymorphism， CDDP）標記是由Collard和Mackill開發(fā)的基于DNA保守序列的新型分子標記[4]，它是一種單引物擴增反應(yīng)，最先應(yīng)用于水稻，后來迅速在其他植物中得到應(yīng)用[5]。CDDP分子標記的開發(fā)利用受益于植物基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的快速發(fā)展，其引物序列的設(shè)計是根據(jù)植物基因組DNA中起重要作用的保守序列。不同植物間DNA保守序列均相當保守，所以CDDP分子標記技術(shù)能在不同物種間通用。在水稻上的研究表明，CDDP分子標記具有操作便捷、應(yīng)用成本低、多態(tài)性豐富、可以有效產(chǎn)生與目標性狀有關(guān)的標記等優(yōu)點，是對RAPD、ISSR、TRAP、CoRAP、SCoT等標記方法的有效補充，具有較好的應(yīng)用前景[6]。目前，CDDP分子標記已經(jīng)應(yīng)用于菊花[7]、牡丹[8，9]等多種植物，但尚未見野生玫瑰種質(zhì)資源上CDDP分子標記應(yīng)用的報道。

本研究主要著力于優(yōu)化野生玫瑰基因組DNA的提取方法和在CDDP引物中篩選出對野生玫瑰品種鑒別力較高、多態(tài)性豐富的引物，為后續(xù)進行野生玫瑰的CDDP分子標記研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

以吉林琿春、遼寧莊河以及山東牟平、威海等地的野生玫瑰為研究材料，在2015年5月和7月采集新鮮幼葉，共120個樣品，用硅膠保存于-20℃。

1.2 試劑

液氮；PVP；提取介質(zhì)（4℃保存）；2×CTAB提取緩沖液；β-巰基乙醇；Tris-酚；氯仿-異戊醇（24∶1）；3 mol/L NaAc；無水乙醇；70%乙醇；1×TE；雙蒸水（ddH2O）。

1.3 儀器

電子天平；研缽；研棒；藥匙；冰盒；水浴鍋；低溫離心機；移液槍。

1.4 改良CTAB法提取野生玫瑰基因組DNA

1.4.1 準備工作 ①將水浴鍋升溫至65℃；②將無水乙醇放入-20℃的冰箱內(nèi)預(yù)冷；③配制提取介質(zhì)（表1）和2×CTAB提取緩沖液（表2）；④將槍頭、CTAB提取緩沖液、提取介質(zhì)滅菌；⑤將藥匙放在液氮中預(yù)冷。

1.4.2 提取方法 ①用移液槍取1 mL提取介質(zhì)于2 mL離心管中，置于冰盒內(nèi)，標好標號。

②用電子天平稱取0.12～0.20 g幼嫩葉片于干燥研缽中，在研缽內(nèi)加入少許PVP，倒入約35 mL液氮，將葉片搗碎，待液氮即將揮發(fā)完時，快速研磨葉片，重復(fù)加入液氮2～3次，反復(fù)研磨直至葉片成細小的粉末狀（研磨的越細越好）。用泡在液氮中提前預(yù)冷的小匙快速將研缽中的葉片粉末轉(zhuǎn)移至已加好提取介質(zhì)的離心管內(nèi)，混勻，冰盒內(nèi)放置10 min， 7 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清液。離心結(jié)束時把CTAB放入65℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。

③加提取介質(zhì)，重復(fù)上述步驟，離心后棄上清液，向沉淀中加入40 μL β-巰基乙醇、800 μL CTAB，搖離心管至沉淀散開，放入65℃水浴鍋內(nèi)1 h，15 min搖勻一次。

④將離心管從水浴鍋中取出，冷卻5～6 min至室溫，搖勻加入400 μL Tris-酚、400 μL氯仿-異戊醇（24∶1），緩慢搖動10 min，放入低溫離心機內(nèi)，12 000 r/min、4℃離心10 min。

⑤準備新的2 mL離心管，寫好編號。從離心機內(nèi)取出離心管，取上清液800 μL（每次取200 μL ，最多取800 μL，若上清液較少也可以取600 μL）于新的2 mL離心管內(nèi)，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），輕輕緩慢搖動10 min，使其充分混勻至上下不分層。

⑥將離心管放入離心機內(nèi)，12 000 r/min、4℃離心10 min，離心后觀察離心管內(nèi)中間的蛋白層，若中間蛋白質(zhì)較多，重復(fù)上述步驟（取上清液600 μL左右）。

⑦準備新的1.5 mL離心管，寫好編號。用黃色平底槍頭取上清液400 μL（每次取100 μL）于1.5 mL離心管中，先加入上清液1/10體積的3 mol/L NaAc試劑，然后加入上清液2倍體積的-20℃無水乙醇，放入冰箱-20℃保存20 min。取出離心管，12 000 r/min、4℃離心3 min。

⑧棄上清液，用1 000 μL的70%乙醇洗滌5 min，重復(fù)2～3次，倒出乙醇，放置3～4 h晾干。

⑨用50 μL的1×TE溶解沉淀， 4℃冰箱內(nèi)保存（-20℃長期保存）。

1.4.3 DNA質(zhì)量檢測 向提取的DNA樣品中加入1 μL RNAase，37℃水浴鍋內(nèi)放置1 h，去除DNA內(nèi)的RNA。

瓊脂糖凝膠電泳檢測：配制0.8%瓊脂糖凝膠，取5 μL提取的DNA樣品加入2 μL loading buffer，混勻，點入瓊脂糖凝膠內(nèi)，在120 V電壓下電泳30 min，電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠放于EB中染色30 min，最后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照[10]。

分光光度計檢測DNA純度，高純度DNA的A260/280值應(yīng)在1.8～2.0之間，當A260/280小于1.8時，DNA樣品中可能存在蛋白質(zhì)污染，當A260/280大于2.0時，DNA樣品中RNA的含量較高[11]。

1.5 CDDP分子標記引物篩選

從吉林琿春、遼寧莊河、山東威海、山東牟平四個地區(qū)的高質(zhì)量野生玫瑰基因組DNA中各挑選一個樣品，利用21條CDDP引物對其進行擴增。經(jīng)多次反應(yīng)體系試驗，確定穩(wěn)定性良好的PCR擴增體系：2×Es Taq MasterMix（含染料）10 μL，40 ng/μL DNA模板1 μL，10 pmol/μL引物1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序設(shè)為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃后延伸5 min，4℃保存。

CDDP-PCR擴增結(jié)果檢測：取6 μL擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，電壓5 V/cm，電泳1.5～2 h，EB染色10 min后，在凝膠成像分析儀上進行觀察并采集圖像。

本試驗所用的21條CDDP引物都是由上海生工生物工程有限公司合成，引物編號及序列見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生玫瑰基因組DNA提取

本研究在植物基因組DNA CTAB提取法的基礎(chǔ)上，延長水浴時間至1 h，調(diào)整氯仿-異戊醇（24∶1）的抽提次數(shù)為2～3次，用此方法提取野生玫瑰基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖1）表明，DNA條帶明顯清晰、拖尾較輕，無明顯降解現(xiàn)象、完整性較好，說明改良CTAB法可以高效、便捷地提取野生玫瑰基因組DNA。

提取的野生玫瑰基因組DNA的A260/280值在1.60～1.85之間，提取的DNA濃度在1 200～2 500 ng/μL之間，DNA得率較高，因此改良CTAB法能有效提取出較高質(zhì)量的野生玫瑰基因組DNA。

2.2 CDDP分子標記引物篩選

用21條CDDP引物對4個不同地區(qū)的野生玫瑰基因組DNA進行擴增，結(jié)果（圖2，表4）表明，Pr11和Pr12沒有擴增出任何條帶，其他引物均能擴增出有效條帶；Pr5和Pr15可以對其中三個樣品進行有效擴增；引物Pr13的擴增結(jié)果中僅有威海和牟平兩個地區(qū)出現(xiàn)條帶，且條帶數(shù)量較少；其余16條引物對四個不同地域的野生玫瑰基因組DNA均有理想的擴增效果，其中引物Pr3、Pr8、Pr9和Pr19的擴增總條帶數(shù)多且條帶清晰易辨。不同引物對不同地域的野生玫瑰基因組DNA的擴增情況不同，體現(xiàn)了不同地域間的野生玫瑰資源存在遺傳差異。從表4可知，多態(tài)性比率達到100%的有Pr6、Pr10和Pr18 三條引物，最低的是Pr1為69.23%，其他引物的多態(tài)性條帶比例均較高。綜合考慮每個引物的鑒別能力和擴增效果等情況，篩選出16條（Pr1、Pr2、Pr3、Pr4、Pr6、Pr7、Pr8、Pr9、Pr10、Pr14、Pr16、Pr17、Pr18、Pr19、Pr20、Pr21）CDDP引物，可作為核心引物用于野生玫瑰的鑒定與識別及遺傳多樣性分析等研究。

3 討論與結(jié)論

基因組DNA的提取是分子標記研究的重要前提，DNA的質(zhì)量影響著試驗的成敗。不同的植CDDP分子標記是一種新型的標記技術(shù)，引物設(shè)計的錨定位點在功能蛋白質(zhì)或功能基因序列中的保守區(qū)域，可以有效地產(chǎn)生其他性狀的連鎖標記。本研究利用21條CDDP引物對吉林琿春、遼寧莊河以及山東牟平、山東威海四個地區(qū)的野生玫瑰基因組DNA進行擴增，以2×Es Taq MasterMix（含染料）10 μL，40 ng/μL DNA模板1 μL，10 pmol/μL引物1 μL，ddH2O 8 μL為反應(yīng)體系，多態(tài)性比率達到100%的有Pr6、Pr10和Pr18三條引物，最低的是Pr1為69.23%，其他引物的多態(tài)性條帶比例均較高，有16條引物對野生玫瑰具有較高的鑒別能力。由于不同植物間的種質(zhì)資源遺傳多樣性較大，相同CDDP引物對不同植物的鑒別能力有所差異，如李瑩瑩[8]用同樣的21條引物進行牡丹的CDDP分子標記研究，最終有20條引物得到擴增條帶；李田等[7]將此21條CDDP引物用于菊花，得到19條有效引物。但另一方面也證明了CDDP引物具有通用性、操作簡單、成本較低、易得到遺傳信息等優(yōu)勢[14]，更有利于反映物種遺傳變異的多樣性。

本研究結(jié)果證明了CDDP引物在野生玫瑰種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和品種鑒定等方面具有應(yīng)用的可行性，為以后利用CDDP-PCR這一新型目的分子標記技術(shù)進行野生玫瑰遺傳變異的深入研究提供一定的應(yīng)用基礎(chǔ)，也為此標記在其它植物上的應(yīng)用研究提供了經(jīng)驗與借鑒。

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