凡納濱對蝦過氧化氫酶基因單核苷酸多態(tài)性及其與耐低溶氧性狀的相關(guān)性

陳曉敏，劉建勇，張嘉晨，袁瑞鵬，錢佳慧

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524025）

凡納濱對蝦過氧化氫酶基因單核苷酸多態(tài)性及其與耐低溶氧性狀的相關(guān)性

陳曉敏，劉建勇，張嘉晨，袁瑞鵬，錢佳慧

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524025）

采用直接測序法研究凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei) 過氧化氫酶（CAT）基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP），并分析得到的基因型與凡納濱對蝦低溶氧耐受性狀的關(guān)聯(lián)性，尋找與凡納濱對蝦耐低溶氧性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記。結(jié)果顯示：在CAT基因外顯子1第155堿基處發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)，為A→G顛換，表現(xiàn)為同義突變。在凡納濱對蝦群體中該位點(diǎn)等位基因A和G的頻率分別為0.146和0.854，多態(tài)信息含量PⅠC值為0.218，屬于低度多態(tài)性，群體在該基因座上符合哈溫（Hardy-Weinberg）平衡(P＞0.05)。關(guān)聯(lián)分析表明，CAT基因SNP位點(diǎn)不同基因型與低溶氧耐受性狀關(guān)聯(lián)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.277，P=0.002），其中AG 型在應(yīng)激耐受組中占優(yōu)勢地位（52.17%）。CAT基因多態(tài)性與凡納濱對蝦低溶氧耐受性相關(guān)，可作為影響凡納濱對蝦耐低溶氧性狀的候選基因，為凡納濱對蝦選育提供分子遺傳標(biāo)記。

凡納濱對蝦；過氧化氫酶基因；單核苷酸多態(tài)性；耐低溶氧性狀

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）也稱南美白對蝦，隸屬于甲殼綱（Crustacea），十足目（Decapoda），對蝦科（Penaeidae），濱對蝦屬（Litopenaeus），為廣溫廣鹽性熱帶蝦類[1]。凡納濱對蝦有生長速度快、抗病能力強(qiáng)、適應(yīng)高密度養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn)，是我國主要的對蝦養(yǎng)殖對象[2]。近年來，凡納濱對蝦高密度養(yǎng)殖模式得到廣泛推廣；然而，因受季節(jié)性溫度、鹽度變化、水體生物呼吸代謝、有機(jī)物分解腐爛等影響，高密度養(yǎng)殖水體溶解氧（DO）降低，極易出現(xiàn)缺氧現(xiàn)象[3-5]，進(jìn)而影響對蝦消化力、免疫力，易出現(xiàn)對細(xì)菌和病毒的敏感性高、生長緩慢、死亡率高等現(xiàn)象[6-7]。因此，利用遺傳育種技術(shù)培育耐低溶氧的凡納濱對蝦新品種尤為重要。

動(dòng)物遺傳育種時(shí)可通過在動(dòng)物功能基因中尋找一些可靠而有效的遺傳標(biāo)記來提高育種效率，對動(dòng)物功能基因多態(tài)性的研究不僅有助于了解功能基因的作用機(jī)制，還可獲得與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)聯(lián)的分子遺傳標(biāo)記，運(yùn)用于后續(xù)的遺傳育種實(shí)踐[8-9]。單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）是指基因組序列中某一位置上堿基的變異，包括轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失等，可發(fā)生在DNA任意位置上[10]。與以擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）為代表的第1代分子標(biāo)記和以簡單重復(fù)序列（SSR）為代表的第 2代分子標(biāo)記相比，SNP作為第3代分子標(biāo)記，具有數(shù)量巨大、分布廣泛、遺傳穩(wěn)定性高、適用于大樣本量檢測分析、與基因功能相關(guān)等諸多優(yōu)點(diǎn)，在分子標(biāo)記輔助育種中應(yīng)用更為廣泛[11]。而分子標(biāo)記輔助育種工作的前提是獲得與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因的SNP位點(diǎn)[10,12]。在凡納濱對蝦分子標(biāo)記輔助育種的研究中，不少學(xué)者利用SNP分子標(biāo)記技術(shù)篩查到重要功能基因的SNPs。彭敏等[13]研究了2個(gè)不同品種凡納濱對蝦AMY基因的SNPs，共發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNP位點(diǎn)。馬寧等[14]在凡納濱對蝦組織蛋白酶 (CTSL) 基因多態(tài)性研究中，共篩選出20個(gè)SNP位點(diǎn)。Zeng等[15]研究了凡納濱對蝦Hsp70基因SNPs與抗病毒特性的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Hsp70基因不同基因型對凡納濱對蝦的抗病性有顯著影響。以上研究多集中于凡納濱對蝦生長、抗病等相關(guān)基因的多態(tài)性，未見與凡納濱對蝦耐低溶氧性狀相關(guān)基因SNPs的研究報(bào)道。

過氧化氫酶 (Catalase，CAT) 在動(dòng)物抗氧化防御中起關(guān)鍵作用，不僅可催化H2O2生成水和氧氣，參與細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝，還可增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的防御能力以及機(jī)體的免疫功能，并有效抑制脂質(zhì)的過氧化作用，保護(hù)機(jī)體免受損害[16]。筆者采用直接測序法研究凡納濱對蝦低溶氧敏感組和耐受組CAT基因的多態(tài)性，旨在尋找與凡納濱對蝦耐低溶氧性狀相關(guān)的SNPs，為凡納濱對蝦遺傳育種提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用對蝦為廣東海洋大學(xué)海洋生物研究基地養(yǎng)殖的第4代凡納濱對蝦，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d以適應(yīng)環(huán)境。耐低氧實(shí)驗(yàn)在注入60 L經(jīng)沉淀、消毒自然海水的玻璃纖維桶中進(jìn)行。隨機(jī)挑取規(guī)格[體質(zhì)量 (11.5±0.92) g ]、活力相同的對蝦48尾，分別設(shè)計(jì)2個(gè)平行組，每組對蝦24尾。因預(yù)實(shí)驗(yàn)得對蝦低溶氧脅迫96 h的半致死濃度為0.9mg/L，將海水DO控制在0.80～1.00mg/L，每2 h測1次DO，每6 h統(tǒng)計(jì)凡納濱對蝦死亡數(shù)，直至脅迫96 h。將經(jīng) 96 h低溶氧脅迫實(shí)驗(yàn)后死亡蝦歸入低溶氧應(yīng)激敏感組，存活蝦歸入低溶氧應(yīng)激耐受組，其中應(yīng)激敏感組對蝦為25尾，應(yīng)激耐受組對蝦為23尾。

1.2 基因組DNA提取

依動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒說明書（上海生工生物公司）提取對蝦基因組DNA，用10mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測提取結(jié)果，用核酸定量儀測定DNA濃度和純度，于–

20

℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CAT基因的PCR擴(kuò)增

利用Primer premier 5.0軟件根據(jù)GenBank中凡納濱對蝦CAT基因序列（登錄號(hào)JX162772.1）設(shè)計(jì)特異性引物（CAT-F：CCCGATAACCTGACC ACG；CAT-R：TTCCCAATCTCACTGAACAAAG），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度為530 bp。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer (Mg2+Plus) 5μL，dNTPs（2.5 mmol/L）5μL，上、下游引物 (10 μmol/L 各4μL，Taq酶 (TaKaRa公司) 0.5 u，基因組DNA模板2μL，補(bǔ)雙蒸水至總體積為 50μL。擴(kuò)增程序：95℃ 5min；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 1min，40個(gè)循環(huán)；72℃ 10min；4℃下保存。

1.4 SNP位點(diǎn)的篩選

隨機(jī)挑取低溶氧應(yīng)激敏感組和應(yīng)激耐受組各6尾凡納濱對蝦的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往上海生工生物公司進(jìn)行雙向測序。利用 DNAMan軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，篩選CAT基因的SNP位點(diǎn)。篩查到SNP位點(diǎn)后，擴(kuò)增其余36尾凡納濱對蝦基因組DNA，測產(chǎn)物序列。通過Chromas軟件查看測序圖譜，通過人工校對判斷每尾凡納濱對蝦SNP位點(diǎn)的基因型，統(tǒng)計(jì)低溶氧應(yīng)激敏感組與耐受組基因型和等位基因的個(gè)體數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.5.1 遺傳多樣性計(jì)算 運(yùn)用POPGENE 32軟件計(jì)算SNP位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率、預(yù)期雜合度He、觀測雜合度Ho、有效等位基因數(shù)Ne及Hardy-Weinberg平衡性等遺傳參數(shù)。

1.5.2 多態(tài)信息含量 按照 Botetein[17]的計(jì)算公式估計(jì)SNP位點(diǎn)多態(tài)信息含量。其中，當(dāng)PⅠC≤0.25時(shí)為低度多態(tài)；當(dāng)0.25＜PⅠC＜0.5為時(shí)中度多態(tài)；當(dāng)PⅠC≥0.5時(shí)為高度多態(tài)。

1.5.3 與耐低溶氧性狀相關(guān)分析 利用 SPSS 19.0軟件的χ2檢驗(yàn)分析SNP位點(diǎn)的基因型與低溶氧耐受性之間的相關(guān)性，P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 凡納濱對蝦CAT基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增得約520 bp的特異性條帶，與原設(shè)計(jì)引物片段長度相符（圖1）。

圖1 CAT基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR product of CAT gene

2.2 SNPs篩查與CAT基因分型

篩查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列，在凡納濱對蝦CAT基因外顯子1第155堿基處發(fā)現(xiàn)1個(gè)A→G的點(diǎn)突變。將測序得到的核苷酸序列轉(zhuǎn)換成氨基酸序列后，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的突變并未引起編碼氨基酸的改變，為Gln→Gln同義突變。用Chromas 軟件查看測序圖譜并判斷CAT基因型，單峰為純合基因型，套峰為雜合基因型（圖2）。對兩組實(shí)驗(yàn)對蝦不同基因型的個(gè)體數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并發(fā)現(xiàn)該SNP位點(diǎn)有AG、GG兩種基因型。

圖2 CAT基因PCR產(chǎn)物測序峰Fig.2 SNPs by PCR product sequencing

2.3 CAT基因多態(tài)位點(diǎn)基因頻率及遺傳結(jié)構(gòu)

根據(jù)測序結(jié)果，檢測低溶解氧應(yīng)激敏感組和應(yīng)激耐受組凡納濱對蝦的CAT基因基因型，計(jì)算各組該多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率，結(jié)果見表1。表1可見，AG和GG基因型頻率分別為0.292、0.708，未發(fā)現(xiàn)AA基因型。等位基因A和G的頻率分別為0.146和0.854。AG基因型在應(yīng)激耐受組中的頻率為0.522，高于GG基因型的頻率，而GG基因型在應(yīng)激敏感組中的頻率為0.92，占絕對優(yōu)勢。

表1 CAT基因型和等位基因頻率Table 1 Genotypic and allelic frequencies for CAT gene

CAT基因SNP位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)Ne、預(yù)期雜合度He、觀測雜合度 Ho、多態(tài)信息含量 PⅠC及 Hardy-Weinberg平衡性等遺傳多樣性指標(biāo)見表2。其中，多態(tài)信息含量PⅠC值為0.218，處于低度多態(tài)（PⅠC≤0.25）。Hardy-Weinberg平衡性分析結(jié)果表明，在凡納濱對蝦群體中，該突變位點(diǎn)符合哈迪－溫伯格平衡 (HWE) (P＞0.05)。

表2 凡納濱對蝦CAT 基因多態(tài)性分析Table 2 Genetic diversity of CAT gene in Litopenaeus vannamei

2.4 CAT基因多態(tài)性與耐低溶氧性狀的相關(guān)性

分析CAT 基因SNP位點(diǎn)的各基因型及等位基因與低溶氧耐受性相關(guān)性，結(jié)果表明，在g.155A＞G位點(diǎn)中，AG和GG 2種不同基因型的分布與低溶氧耐受性關(guān)聯(lián)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.277，P=0.002），其中AG 型在低溶氧耐受組中頻率為52.17%，占優(yōu)勢地位，GG型則在應(yīng)激敏感組中所占比例大，為92%。2種等位基因A、G也顯示出與低溶氧耐受性的關(guān)聯(lián)性（χ2=7.693，P=0.006）。由此可見，CAT基因g.155A＞G位點(diǎn)的多態(tài)性對凡納濱對蝦低溶氧耐受性有極顯著的影響，AG基因型個(gè)體低溶氧耐受性能優(yōu)于GG基因型。

3 討 論

3.1 凡納濱對蝦CAT基因的SNP分析

SNP廣泛存在于動(dòng)植物基因中，多數(shù)SNP發(fā)生在基因的非編碼區(qū)。位于編碼區(qū)的SNP又分為兩類：一類是未引起編碼蛋白改變的同義突變，一類是由于突變導(dǎo)致錯(cuò)誤編碼蛋白質(zhì)而引起蛋白質(zhì)功能改變的非同義突變。SNP位點(diǎn)的突變形式包括轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失，其中轉(zhuǎn)換、顛換、發(fā)生的頻率較高[18-19]。本研究中，PCR產(chǎn)物經(jīng)直接測序，在凡納濱對蝦 CAT基因序列中篩選出一個(gè) SNP位點(diǎn)g.155A＞G，屬于Gln→Gln的同義突變。錢昭英等[20]在凡納濱對蝦組織蛋白酶 CTSL基因的編碼區(qū)中發(fā)現(xiàn)1個(gè)為同義突變的SNP位點(diǎn)，經(jīng)分析該SNP位點(diǎn)對凡納濱對蝦的生長性狀有顯著影響。李春笑等[21]在兔（Leporidae）成纖維細(xì)胞生長因子FGF5基因的編碼區(qū)中發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP位點(diǎn)，其中有1個(gè)位點(diǎn)為同義突變。Lee等[22]和Liao等[23]學(xué)者均認(rèn)為，SNP位點(diǎn)的同義突變并未改變其編碼的氨基酸序列，但堿基改變可能間接影響原基因的功能結(jié)構(gòu)，從而影響基因的選擇性剪切和剪切效率，改變mRNA的折疊，影響mRNA的穩(wěn)定性以及基因的翻譯過程等。因此，可認(rèn)為凡納濱對蝦CAT基因g.155A＞G位點(diǎn)的同義突變并未改變其編碼的氨基酸，亦未直接影響過氧化氫酶的生理功能，但可能間接影響CAT基因的功能結(jié)構(gòu)，從而影響CAT酶的表達(dá)和催化。

3.2 CAT基因SNP位點(diǎn)的遺傳結(jié)構(gòu)

本研究在對CAT基因g.155A＞G位點(diǎn)進(jìn)行基因型分型時(shí)發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)的SNP分型為AG、GG 2種，且AG和GG的基因型頻率分別是0.292、0.708，并未檢測到AA基因型，可能是由于該實(shí)驗(yàn)選擇的凡納濱對蝦樣本的遺傳多樣性不高。AG基因型在應(yīng)激耐受組中的頻率為0.522，占優(yōu)勢地位，而GG基因型在應(yīng)激敏感組中的頻率為0.92，占絕對優(yōu)勢。因此，在凡納濱對蝦選育過程中，理論上凡納濱對蝦CAT基因g.155A＞G位點(diǎn)為AG基因型的個(gè)體處于優(yōu)勢地位，而GG基因型的則處于劣勢地位。

遺傳多樣性高低直接反映物種的進(jìn)化趨勢以及對環(huán)境的適應(yīng)能力，遺傳多樣性越豐富則越有利于選擇育種。本研究顯示，凡納濱對蝦 CAT基因g.155A＞G位點(diǎn)的預(yù)期雜合度和觀測雜合度均小于0.05，表明該凡納濱對蝦群體CAT基因的變異程度較小，潛在選擇能力較低；多態(tài)信息含量PⅠC值小于 0.25，處在低度多態(tài)，表明等位基因片段多態(tài)性以及基因突變變異程度均較低。因此，可判斷該凡納濱對蝦群體的CAT基因的遺傳多樣性較小，選擇潛力較低，處在較穩(wěn)定的遺傳狀態(tài)。

3.3 與耐低溶氧性狀的關(guān)聯(lián)分析

在動(dòng)物遺傳育種過程中，通過SNP標(biāo)記選擇某些有重要生理功能的基因作為候選研究對象，探尋基因多態(tài)性與重要經(jīng)濟(jì)性狀間的關(guān)系，以找到影響經(jīng)濟(jì)性狀的主效基因或與主效基因緊密連鎖的其他候選基因，獲得與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的有效分子遺傳標(biāo)記，并運(yùn)用于后續(xù)的遺傳育種實(shí)踐，以提高育種效率[25-26]。吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）肌細(xì)胞生長抑制素MSTN基因中存在1個(gè)與魚體型顯著相關(guān)的 SNP位點(diǎn)[26]。凡納濱對蝦的蘭尼定受體基因中存在1個(gè)與溫度變化敏感性相關(guān)的SNP 位點(diǎn)[27]。本研究首次對凡納濱對蝦CAT基因進(jìn)行SNP位點(diǎn)篩查，發(fā)現(xiàn)1個(gè)與耐低溶氧性狀顯著相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)g.155A＞G，該SNP位點(diǎn)AG基因型的個(gè)體較GG基因型低溶氧耐受性高，表明A基因?yàn)榉布{濱對蝦耐低溶氧性狀的增效基因。因此，可推測CAT基因是影響凡納濱對蝦低溶氧耐受性潛在的主效基因或與主效基因連鎖的有效基因，可作為低溶氧耐受性狀的候選遺傳標(biāo)記，應(yīng)用于凡納濱對蝦的良種選育。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Single Nucleotide Polymorphisms in Catalase Gene and Their Association with Resistant Hypoxia Traits in Litopenaeus vannamei

CHEN Xiao-min,LⅠU Jian-yong,ZHANG Jia-chen,YUAN Rui-peng,QⅠAN Jia-hui
（Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524025,China）

The single nucleotide polymorphisms (SNP) in catalase (CAT) gene was studied between hypoxia resistant group and susceptible group of Litopenaeus vannamei by using direct sequencing technique,and the association between the polymorphisms and hypoxia tolerance traits was analyzed so as to find the SNP sites and provide the molecular basis for the genetic breeding of L.vannamei.The result shows that a SNP site is found in 155 bp of catalase gene,which is A/G transversion and synonymous with mutation.Ⅰn this population,allele frequency of A and G is 0.146 and 0.854,respectively.The SNP polymorphic information content (PⅠC) is 0.218,which in a low degree of polymorphism (PⅠC＜0.25),and the genotypes distribution fitted to the Hardy-Weinberg equilibrium (P＞ 0.05).The correlation between different genotypes and hypoxia tolerance traits of L.vannamei is analyzed by chi-square test.The results indicate that the genotypes of intron 1 are significantly associated with the hypoxia tolerance traits (χ2=9.277,P＜0.01).Among them,the AG genotype is dominant in the hypoxia tolerance (52.17%).Ⅰt is suggested that the CAT gene should be one of the candidates which significantly affect the hypoxia tolerance of L.vannamei,and can be used as themolecular genetic markers applying for L.vannamei breeding.

Litopenaeus vannamei; catalase gene; single nucleotide polymorphisms; hypoxia tolerance

Q78；Q959.223+.63

A

1673-9159（2016）06-0016-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.003

2016-05-23

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)科技攻關(guān)與研發(fā)項(xiàng)目（A201208B05）

陳曉敏（1990－），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物遺傳育種。E-mail:584917129@qq.com

劉建勇（1970－），男，博士，教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物遺傳育種。E-mail:liujy70@126.com