響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)芽苦蕎富集γ-氨基丁酸的培養(yǎng)條件

朱云輝，郭元新

(安徽科技學(xué)院 食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

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響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)芽苦蕎富集γ-氨基丁酸的培養(yǎng)條件

朱云輝，郭元新

(安徽科技學(xué)院 食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

【目的】 研究發(fā)芽苦蕎富集γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的最佳培養(yǎng)條件，為苦蕎芽菜的開發(fā)利用提供支持?！痉椒ā?在谷氨酸鈉(Monosodium glutamate,MSG)質(zhì)量濃度、鈣離子(Ca2+)濃度、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時間4個單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對發(fā)芽苦蕎的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立GABA富集的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，并分析模型的有效性與因素間的交互作用?！窘Y(jié)果】 4個因素對GABA富集的影響大小依次為MSG質(zhì)量濃度>發(fā)芽溫度>發(fā)芽時間>Ca2+濃度；發(fā)芽苦蕎富集GABA的最佳培養(yǎng)條件為：MSG濃度6.90 mg/mL，發(fā)芽溫度32 ℃，發(fā)芽時間3.5 d，Ca2+濃度5.8 mmol/L，在此條件下發(fā)芽苦蕎GABA含量為(258.77±3.95) μg/g，與預(yù)測值259.89 μg/g相差較小?！窘Y(jié)論】 建立的回歸模型能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測發(fā)芽苦蕎的GABA富集量。該培養(yǎng)方法穩(wěn)定性好，GABA富集量高。

發(fā)芽苦蕎；γ-氨基丁酸(GABA)；培養(yǎng)條件；響應(yīng)面法

苦蕎學(xué)名韃靼蕎麥(Fagopyrumtataricum)，富含其他糧食作物中幾乎沒有的蘆丁及硒元素，同時還含有18種氨基酸、9種脂肪酸及豐富的膳食纖維和葉綠素等，是一種糧藥兼用的蓼科蕎麥屬雙子葉作物。研究表明，苦蕎發(fā)芽后營養(yǎng)成分更加合理，蕎麥蛋白酶抑制劑及植酸含量降低，若能科學(xué)控制發(fā)芽條件，還能富集γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)等功能成分[1-4]。

GABA是一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，作為一種天然活性成分，廣泛存在于原核和真核生物體中，是目前研究較為深入的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種代謝活動，具有降低血壓、改善神經(jīng)機(jī)能、助精神安定、促進(jìn)生長激素分泌及酒精代謝等藥理功能[5-6]。隨著年齡的增長和精神壓力的加大，人腦中GABA的積累異常困難，而通過日常飲食補(bǔ)充可有效改善這種狀況[7]。但正常的植物組織中GABA含量很低，為0.3～32.50 μmol/g[8]，無法滿足人體需求[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在低氧和澇災(zāi)、機(jī)械刺激、冷害、熱激及鹽脅迫等逆境下，植物體內(nèi)的GABA含量成倍增加[10-12]。植物中的GABA合成主要來自GABA支路中由谷氨酸脫羧酶(GAD,EC 4.1.1.15)催化的不可逆的α-谷氨酸脫羧反應(yīng)，GAD是一種Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴型酶，具有一個鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)[13]，發(fā)芽溫度、底物谷氨酸(Glu)及鈣離子(Ca2+)濃度，均與GAD的活性有關(guān)。通過脅迫、優(yōu)化培養(yǎng)條件富集糙米[14]、大麥[15]、粟谷[16-17]、豆類[5,18-20]等種子中GABA的研究已有報(bào)道，但對發(fā)芽苦蕎的研究主要集中在種子萌發(fā)過程中營養(yǎng)成分、黃酮等功能組分的變化上[2,21]，而對發(fā)芽苦蕎富集GABA的研究較少。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了發(fā)芽苦蕎富集GABA的培養(yǎng)條件，研究Ca2+濃度、谷氨酸鈉(MSG)質(zhì)量濃度、發(fā)芽時間、發(fā)芽溫度4個因素對GABA富集的影響，建立了可靠的模型，以期為苦蕎芽菜的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎(榆6-21)種子，2013年秋采自中國內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市，于-20 ℃冰箱中貯藏備用。

GABA標(biāo)品(純度≥99.9%)和對二甲氨基苯磺酰氯(DABS-CI,99%)，美國Sigma公司；乙腈為色譜純，氯化鈣和MSG等其他化學(xué)試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LHP-160型智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1200液相色譜儀，安捷倫公司；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)，合肥科大創(chuàng)新股份有限公司；真空冷凍干燥系統(tǒng)，美國Labconce公司。

1.3 方 法

1.3.1 苦蕎發(fā)芽 取30 g苦蕎種子用去離子水清洗后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的次氯酸鈉消毒15 min，再用去離子水沖洗至pH中性，30 ℃下浸泡4 h。然后置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中暗培養(yǎng)，培養(yǎng)箱濕度控制在85%～90%，期間每隔8 h左右噴灑設(shè)定濃度的Ca2+(以CaCl2溶液代替)和MSG混合溶液，保持濾紙濕潤。

1.3.2 GABA含量的測定 參考Guo等[5]的方法測定發(fā)芽苦蕎中的GABA含量。樣品預(yù)處理方法為：將發(fā)芽苦蕎冷凍干燥后，粉碎得粒徑180 μm的發(fā)芽苦蕎粉，稱取0.5 g苦蕎干粉溶于5 mL體積分?jǐn)?shù)7%的乙酸中，按照Bai等[17]的方法對樣品進(jìn)行純化；將純化后的上清液于0.1 MPa、45 ℃條件下進(jìn)行真空干燥，殘余物溶于2 mL 1 mol/L NaHCO3(pH 9)緩沖溶液中，4 000×g離心10 min。GABA含量測定采用高壓液相色譜HPLC(Agilent 1200,USA)，色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA reversed-phase column(3.5 μm)，4.6 mm×150 mm，條件設(shè)置參照Syu等[22]的方法，取1 mL pH為9.0的氨基酸溶液，加入2 mg/mL含對二甲氨基苯磺酰氯的丙酮溶液1 mL，于67 ℃保溫10 min后冰浴終止反應(yīng)；然后使用DAD檢測器于425 nm處進(jìn)行紫外檢測，流動相A為乙腈，流動相B為0.045 mol/L CH3COONa(pH=4)緩沖液，分離時間30 min，溫度30 ℃。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 按照1.3.1的方法，保持其他條件不變，分別考察Ca2+濃度、MSG質(zhì)量濃度、發(fā)芽時間和發(fā)芽溫度4個因素對發(fā)芽苦蕎中GABA富集量的影響。

(1)Ca2+濃度的影響。分別用0，3.0，6.0，9.0，12.0 mmol/L的CaCl2溶液及6.0 mg/mL的MSG溶液處理發(fā)芽苦蕎，30 ℃下發(fā)芽4 d。

(2)MSG質(zhì)量濃度的影響。分別用0，3.0，6.0，9.0，12.0 mg/mL的MSG溶液及6.0 mmol/L的CaCl2溶液處理發(fā)芽苦蕎，30 ℃下發(fā)芽4 d。

(3)發(fā)芽時間的影響。用6.0 mmol/L的CaCl2溶液及6.0 mg/mL的MSG溶液處理發(fā)芽苦蕎，分別30 ℃下發(fā)芽0，2，4，6，8 d。

(4)發(fā)芽溫度的影響。用6.0 mmol/L的CaCl2溶液及6.0 mg/mL的MSG溶液處理發(fā)芽苦蕎，分別在15，20，25，30，35 ℃下發(fā)芽4 d。

1.3.4 GABA富集條件優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用4因素3水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，對影響發(fā)芽苦蕎GABA富集的Ca2+濃度、MSG質(zhì)量濃度、發(fā)芽時間和發(fā)芽溫度4個因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平見表1。采用響應(yīng)面分析方法(RSM)對苦蕎發(fā)芽過程中GABA的富集條件進(jìn)行優(yōu)化。采用Design Expert 8.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，通過微分方法計(jì)算預(yù)測的最佳點(diǎn)。

表 1 發(fā)芽苦蕎中GABA富集條件優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽苦蕎富集GABA的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 Ca2+濃度的影響 不同濃度Ca2+對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的影響如圖1所示。由圖1可見,當(dāng)Ca2+濃度達(dá)到6.0 mmol/L時，發(fā)芽苦蕎中GABA含量達(dá)到最大值，為253.09 μg/g，此后隨著Ca2+濃度增大，GABA含量呈減小趨勢。

2.1.2 MSG質(zhì)量濃度的影響 在6.0 mmol/L Ca2+處理下，不同質(zhì)量濃度MSG對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的影響如圖2所示。由圖2可見，隨著MSG質(zhì)量濃度的增高，發(fā)芽苦蕎中GABA含量逐漸增大，并在6.0 mg/mL時達(dá)到最大值，為241.64 μg/g，分別是0，3.0，9.0，12.0 mg/mL的1.49，1.19，1.07和1.16倍。

圖 1 Ca2+濃度對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的影響

圖 2 MSG質(zhì)量濃度對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的影響

2.1.3 發(fā)芽時間的影響 如圖3所示，隨著發(fā)芽時間的延長，發(fā)芽苦蕎GABA的富集量逐步增加，并在4 d達(dá)到最大值(236.94 μg/g)，是發(fā)芽0 d的1.80 倍，發(fā)芽4 d后，GABA富集量緩慢下降。

2.1.4 發(fā)芽溫度的影響 如圖4所示，在Ca2+濃度為6.0 mmol/L，MSG質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL，發(fā)芽4 d的條件下，發(fā)芽溫度為15～30 ℃時，發(fā)芽苦蕎GABA富集量逐漸上升，且速率較快，于30 ℃達(dá)到最大值，為249.63 μg/g，分別為15，20，25，35 ℃的 1.49，1.30，1.15及1.09倍。

2.2 發(fā)芽苦蕎富集GABA最佳培養(yǎng)條件的確定

2.2.1 響應(yīng)面回歸方程的建立及方差分析 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以影響發(fā)芽苦蕎GABA富集的Ca2+濃度(X1)、MSG質(zhì)量濃度(X2)、發(fā)芽時間(X3)、發(fā)芽溫度(X4)與GABA含量(Y)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，通過對結(jié)果(表2和圖5)進(jìn)行回歸分析及多元二次回歸方程擬合發(fā)現(xiàn)，X1X4與X2X3的F值分別為0.036(P>0.85)和0.030(P>0.85)，對GABA富集量的影響微小，故將其歸為誤差項(xiàng)，重新擬合后得回歸方程為:

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及根據(jù)回歸方程得出的預(yù)測值見表2。預(yù)測值與實(shí)測值的相關(guān)關(guān)系見圖5。

圖 3 發(fā)芽時間對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的影響

圖 4 發(fā)芽溫度對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的影響

表 2 發(fā)芽苦蕎GABA富集條件優(yōu)化的Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果和預(yù)測值

圖 5 發(fā)芽苦蕎中GABA含量實(shí)測值與預(yù)測值之間的關(guān)系

表 3 發(fā)芽苦蕎GABA富集條件優(yōu)化回歸模型的方差分析

2.2.2 響應(yīng)面模型交互項(xiàng)的解析 對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次回歸方程的響應(yīng)曲面及其等高線見圖6～圖9。從圖6可見，Ca2+濃度與MSG質(zhì)量濃度對發(fā)芽苦蕎中GABA富集量的交互作用顯著(P<0.05)，Ca2+濃度固定時，隨著MSG質(zhì)量濃度的遞增，GABA富集量呈先上升后下降的趨勢；MSG質(zhì)量濃度不變時，隨著Ca2+濃度的升高，GABA富集量也呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)Ca2+濃度為5.77 mmol/L，MSG質(zhì)量濃度為 6.90 mg/mL時為響應(yīng)面最高點(diǎn)，GABA富集量最大達(dá)到258.42 μg/g。

Ca2+濃度與發(fā)芽時間對發(fā)芽苦蕎中GABA富集量的交互作用不顯著(P>0.05)(圖7)。隨著Ca2+濃度的遞增和發(fā)芽時間的延長，發(fā)芽苦蕎中GABA富集量先升高后下降，Ca2+濃度為5.77 mmol/L，發(fā)芽3.66 d時，GABA富集量達(dá)到最高(256.93 μg/g)。

由圖8可以看出，MSG質(zhì)量濃度與發(fā)芽溫度對發(fā)芽苦蕎中GABA富集量的交互作用不顯著(P>0.05)。隨著MSG質(zhì)量濃度遞增和發(fā)芽溫度升高，發(fā)芽苦蕎中GABA富集量先升高后下降，MSG質(zhì)量濃度為6.90 mg/mL、發(fā)芽溫度為31.72 ℃時，GABA富集量最高(259.42 μg/g)。

發(fā)芽時間和發(fā)芽溫度對發(fā)芽苦蕎中GABA富集量的交互作用不顯著(P>0.05)(圖9)。隨著發(fā)芽時間延長和溫度升高，發(fā)芽苦蕎中GABA富集量先升高后下降，發(fā)芽時間為3.66 d，發(fā)芽溫度為31.72 ℃時，GABA富集量達(dá)到最高(257.72 μg/g)。

圖 6 Ca2+濃度和MSG質(zhì)量濃度對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的交互影響

圖 7 Ca2+濃度和發(fā)芽時間對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的交互影響

圖 8 MSG質(zhì)量濃度和發(fā)芽溫度對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的交互影響

圖 9 發(fā)芽時間和發(fā)芽溫度對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的交互影響

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，得出回歸模型對發(fā)芽苦蕎中GABA富集量的最大預(yù)測值為259.89 μg/g，對應(yīng)的發(fā)芽條件為：Ca2+濃度5.77 mmol/L，MSG質(zhì)量濃度6.90 mg/mL，發(fā)芽時間3.66 d，發(fā)芽溫度 31.72 ℃，考慮到實(shí)際操作的可行性，將培養(yǎng)條件改進(jìn)為：Ca2+濃度5.8 mmol/L，MSG質(zhì)量濃度6.9 mg/mL，發(fā)芽時間3.5 d，發(fā)芽溫度32 ℃。對此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到GABA含量為(258.77±3.95) μg/g，驗(yàn)證值與理論值的相對誤差較小，說明利用響應(yīng)面法優(yōu)化的條件對發(fā)芽苦蕎富集GABA是可行的。

3 討 論

有研究表明，GAD催化Glu在α-位上不可逆的脫羧反應(yīng)是合成GABA的主要途徑[23]，提高GAD活力有助于GABA的積累[24]。GAD是一種Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴型酶，具有一個鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)[13]，因而通常認(rèn)為植物細(xì)胞受到脅迫時，胞內(nèi)Ca2+濃度會快速提升，促使GAD活力升高，進(jìn)而富集GABA[10,25]。添加Glu可提高發(fā)芽粟谷GAD活性，進(jìn)而促進(jìn)GABA的富集，然而當(dāng)Glu濃度過高時，并不利于GABA的大量生成[17]。本研究通過向發(fā)芽苦蕎中添加一定量的Ca2+和MSG，提高了GABA的富集量，這與前人的研究結(jié)果[17,20]一致。種子萌發(fā)后，種子中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)逐漸降解，GAD被激活，L-Glu進(jìn)行脫羧反應(yīng)生成GABA[2,4]。研究表明，苦蕎在發(fā)芽1～3 d時，GABA含量不斷升高[26]。以質(zhì)量濃度為0.2 mg/L的Cu2+對苦蕎進(jìn)行脅迫處理，發(fā)現(xiàn)第4天時GABA含量達(dá)到最大值，隨后不斷下降[27]。本研究以一定量的Ca2+和MSG脅迫發(fā)芽苦蕎，發(fā)現(xiàn)發(fā)芽苦蕎中的GABA含量隨著發(fā)芽時間延長也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。GAD受溫度影響很大，溫度會影響酶蛋白的構(gòu)象，酶與激活劑的親和力及參與酶促反應(yīng)功能團(tuán)的解離等[28]。Satyanarayan等[29]研究表明，多數(shù)植物中GAD酶活最適溫度在36～40 ℃，因種間差異，粟谷GABA富集的最高溫度為33 ℃[28]，大豆GABA富集的最適溫度為30.5～33.3 ℃[25]，而米胚和米糠分別為40和41.3 ℃[30-31]；當(dāng)溫度高于50 ℃時，GAD酶活很不穩(wěn)定，到60 ℃時酶失活87%[32]。溫度過高或過低都會影響GAD的構(gòu)象及其與底物的親和力，從而引起GAD活性下降，導(dǎo)致GABA富集量過低或下降[31]。本研究結(jié)果表明，溫度升高有助于發(fā)芽苦蕎富集GABA，并在31.72 ℃達(dá)到最高值。

4 結(jié) 論

用響應(yīng)面法對發(fā)芽苦蕎中富集GABA的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型具有顯著性(P<0.000 1)，決定系數(shù)為0.925 2，MSG質(zhì)量濃度對GABA富集量的影響極顯著(P<0.000 1)，發(fā)芽溫度對富集量的影響顯著(P<0.05)，Ca2+濃度與MSG質(zhì)量濃度對發(fā)芽苦蕎中GABA富集量的交互作用顯著(P<0.05)。由回歸方程得出，在Ca2+濃度5.77 mmol/L，MSG質(zhì)量濃度6.90 mg/mL，發(fā)芽溫度31.72 ℃，發(fā)芽時間3.66 d的條件下，發(fā)芽苦蕎中GABA富集量最大，預(yù)測值為259.89 μg/g?？紤]到實(shí)際操作的可行性，最后優(yōu)選的培養(yǎng)條件為，Ca2+濃度5.8 mmol/L，MSG質(zhì)量濃度6.9 mg/mL，發(fā)芽時間3.5 d，發(fā)芽溫度32 ℃，在此條件下GABA的富集量為(258.77±3.95) μg/g，與理論值基本相符，說明所建模型能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測發(fā)芽苦蕎GABA的富集量。

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Optimizing culture conditions for GABA accumulation in germinated tartary buckwheat based on response surface methodology

ZHU Yunhui,GUO Yuanxin

(CollegeofFoodandDrug,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang,Anhui233100,China)

【Objective】 The optimal culture conditions for γ-aminobutyric acid (GABA) accumulation in germinated tartary buckwheat were obtained to provide support for the development and utilization of tartary buckwheat sprouts.【Method】 On the basis of four single factor tests,response surface methodology was adopted to optimize the germinated conditions including monosodium glutamate (MSG) mass concentration,calcium ion (Ca2+) concentration,temperature,and time.A second order quadratic equation was established and the applicability of the model and interactions between factors were analyzed.【Result】 The effects of the four factors on GABA accumulation were in a decreasing order of MSG mass concentration>temperature>time>Ca2+concentration.The optimal conditions for GABA accumulation were MSG concentration of 6.90 mg/mL,temperature of 32 ℃,time of 3.5 d and Ca2+concentration of 5.8 mmol/L.The accumulation of GABA was (258.77±3.95) μg/g under the optimal conditions,which was similar to the predicted value of 259.89 μg/g.【Conclusion】 The established model well predicted the accumulation of GABA and the optimal culture method was stable with high GABA accumulation.

germinated tartary buckwheat;γ-aminobutyric acid (GABA);culture condition;response surface methodology

時間:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.020

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.040.html

2015-05-06

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1308085MC32)

朱云輝(1991-)，男，安徽宿州人，碩士，主要從事食品功能性成分的富集及品質(zhì)控制研究。 E-mail：zyh172926966@163.com

郭元新(1970-)，男，甘肅張掖人，教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及品質(zhì)控制研究。E-mail：guoyx@ahstu.edu.cn

TS201.1

A

1671-9387(2016)11-0141-08