斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥3種病原多重PCR檢測(cè)方法的建立

劉禮輝，張德鋒，李寧求，付小哲，林 強(qiáng)，石存斌

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380)

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斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥3種病原多重PCR檢測(cè)方法的建立

劉禮輝，張德鋒，李寧求，付小哲，林 強(qiáng)，石存斌

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380)

【目的】 建立可同時(shí)快速檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥3種病原(嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華菌)的多重PCR檢測(cè)方法?！痉椒ā?根據(jù)嗜水氣單胞菌溶血素基因(Hly)、維氏氣單胞菌脫氧核糖核酸酶Ⅰ基因(DNaseⅠ)以及鮰愛德華菌溶血活化基因(Eha)的保守序列，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，優(yōu)化并建立斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥3種主要病原菌的多重PCR方法，對(duì)其特異性和靈敏度進(jìn)行考察，并將其用于臨床樣品的檢測(cè)?！窘Y(jié)果】 建立的多重PCR方法，當(dāng)Hly基因、DNaseⅠ基因以及Eha基因的引物濃度分別為1.0，1.0和0.5 μmol/L，退火溫度為59.5 ℃時(shí)，各目的片段均可較好地?cái)U(kuò)增。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的多重PCR方法可從嗜水氣單胞菌、 維氏氣單胞菌和鮰愛德華菌分別擴(kuò)增出1 091，262和450 bp的目的片段，從多種細(xì)菌DNA的混合種也可擴(kuò)增出上述目的片段，而對(duì)其他對(duì)照組的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的多重PCR最低可分別檢測(cè)出200 CFU/mL的嗜水氣單胞菌、300 CFU/mL的維氏氣單胞菌和200 CFU/mL的鮰愛德華菌；對(duì)臨床樣本的檢出率為100%，與傳統(tǒng)生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%?！窘Y(jié)論】 建立的多重PCR檢測(cè)方法特異、靈敏、快速，可單獨(dú)或同時(shí)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華菌3種主要病原菌，也可以用于其他水生動(dòng)物上嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華菌的檢測(cè)。

斑點(diǎn)叉尾鮰；敗血癥；嗜水氣單胞菌；維氏氣單胞菌；鮰愛德華菌；多重PCR

斑點(diǎn)叉尾鮰(IctaluruspunctatusRafinesque)屬鯰形目(Silurformes)、鮰科(Ictaluridae)、叉尾鮰屬(Ictalurus)，是美國主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。自1984 年斑點(diǎn)叉尾鮰被引進(jìn)我國后，經(jīng)過30 多年的推廣，現(xiàn)在已經(jīng)在30 個(gè)省(區(qū)、市)開展了該魚的養(yǎng)殖[1]。隨著我國斑點(diǎn)叉尾鮰集約化養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，其病害問題日益突出，嚴(yán)重制約斑點(diǎn)叉尾鮰的健康養(yǎng)殖，其中最主要的細(xì)菌病有腸道敗血癥和出血性敗血癥等，表現(xiàn)為肛門紅腫，體表出血，鰭條基部充血，脾和腎腫大等。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)患病斑點(diǎn)叉尾鮰出血病病原的研究發(fā)現(xiàn)，引起斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥的主要病原菌為鮰愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri，Ei)[2-3]和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，Ah)[4-6]，近年來發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii，Av) 也是引起斑點(diǎn)叉尾鮰發(fā)生多器官敗血癥的常見致病菌，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)多病原混合感染的情況[7-8]。

目前，對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥病原的檢測(cè)主要采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離方法，而該法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且操作復(fù)雜，敏感性較低。目前有關(guān)病原檢測(cè)的方法有選擇性培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)法、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、單克隆抗體技術(shù)及PCR檢測(cè)技術(shù)等，但這些方法每次試驗(yàn)通常只能檢測(cè)一種致病菌。而目前斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥的常見病原菌為鮰愛德華菌、嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌等，這就可能需要多次檢測(cè)才能確定致病菌，使得檢測(cè)時(shí)間延長，檢測(cè)費(fèi)用增加，并且延誤治療。因此，本研究擬建立一種能同時(shí)檢測(cè)鮰愛德華菌、嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌的多重 PCR檢測(cè)方法，旨在為斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥病原的快速診斷、疾病防控和流行病學(xué)研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 嗜水氣單胞菌ATCC19570株、維氏氣單胞菌ATCC51106株、鮰愛德華菌ATCC33202株、?？茞鄣氯A菌ATCC33379株、溶藻弧菌ATCC19108株、副溶血弧菌ATCC17802株、海豚鏈球菌ATCC29178株、無乳鏈球菌ATCC12386株、遲緩愛德華菌ATCC49231株、溫和氣單胞菌ATCC43979株，均購買自上海晶賽生物工程有限公司；嗜水氣單胞菌XS9141、Ci1293、Ci1294和Hm093株，維氏氣單胞菌IB340、Ci12910、Ci12912 和Ci12914株，鮰愛德華菌HSN-1株,舒氏氣單胞菌WL-2株[9]，柱狀黃桿菌GHS061212株[10]，均為珠江水產(chǎn)研究所水產(chǎn)動(dòng)物病害與免疫防控實(shí)驗(yàn)室分離株。柱狀黃桿菌GHS061212的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[10]，其他菌均采用腦心浸(BHI)液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24～48 h。

1.1.2 主要試劑和儀器 2×TaqPCR MasterMix(由TaqDNA Polymerase、2×TaqPCR Buffer、3 mmol/L MgCl2、400 μmol/L dNTP mix以及PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑組成的預(yù)混體系)購自康為世紀(jì)生物科技(北京)有限公司，DNA Marker DL1000 和DNA Marker DL2000 購自大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖和細(xì)菌 DNA 基因組抽提試劑盒購自O(shè)MEGA(中國總代理)廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司，多重 PCR 引物由上海生工生物工程有限公司廣州分公司合成。主要儀器有高速離心機(jī)(Eppendorf 公司，德國)、核酸蛋白檢測(cè)儀(Eppendorf 公司，德國)、梯度PCR儀 (SENSO，德國)、普通PCR 儀(晶格，中國)、核酸電泳儀(北京六一，中國)和凝膠成像系統(tǒng)VerSa Doc2000(Bio-Rad，美國)。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)菌DNA的提取 按OMEGA細(xì)菌 DNA 基因組抽提試劑盒的說明提取所有菌株的DNA，用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定模板DNA的濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)嗜水氣單胞菌溶血素基因(Hemolysin，Hly)、維氏氣單胞菌脫氧核糖核酸酶Ⅰ基因(Deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ)以及鮰愛德華菌溶血活化基因(Hemolysin activator，Eha)序列，通過Primer 5.0軟件，經(jīng)NCBI Blast比對(duì)分別設(shè)計(jì)多對(duì)引物，并用陽性DNA進(jìn)行PCR特異性試驗(yàn)，最后篩選特異性高的3對(duì)PCR引物，其序列見表1。

表 1 用于Hly、DNaseⅠ和Eha基因PCR擴(kuò)增的引物信息

1.2.3 單項(xiàng)PCR引物的特異性驗(yàn)證 對(duì)提取的細(xì)菌 DNA 模板，采用上述Hly、DNaseⅠ和Eha的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢驗(yàn)單項(xiàng)引物的特異性。PCR反應(yīng)體系：2×PCR MasterMix 25 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各1.0 μL，模板DNA 0.5 μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，57 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)； 最后72 ℃ 10 min。 PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用膠回收試劑盒回收，按照載體說明書與pMD18-T Vector 連接， 轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑選陽性菌落，提取其質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR 鑒定后，送廣州中美泰和生物工程公司測(cè)序，并進(jìn)行序列BLAST比對(duì)分析。

1.2.4 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 (1)模板質(zhì)量濃度組合比的優(yōu)化。測(cè)定提取的嗜水氣單胞菌ATCC19570株、維氏氣單胞菌ATCC51106株、鮰愛德華菌ATCC33202株的DNA質(zhì)量濃度(ATCC19570株為200 ng/μL，ATCC51106株為555 ng/μL，ATCC33202株為420 ng/μL)后，均稀釋為50 ng/μL，按模板不同質(zhì)量濃度進(jìn)行組合，組合中嗜水氣單胞菌ATCC19570株、維氏氣單胞菌ATCC51106株、鮰愛德華菌ATCC33202株的DNA終質(zhì)量濃度分別為0.5、0.5、0.5 ng/μL,0.5、1、0.5 ng/μL，0.5、0.5、1 ng/μL，0.5、1、1 ng/μL，1、0.5、0.5 ng/μL，1、1、0.5 ng/μL，1、0.5、1 ng/μL，1、1、1 ng/μL。PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×PCR MasterMix 25 μL，3個(gè)基因的上、下游引物(10 pmol/μL)各1.0 μL，再用雙蒸水補(bǔ)齊至50 μL。以單項(xiàng)PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增程序來確定最佳模板質(zhì)量濃度。

(2)引物濃度組合比的優(yōu)化。以取得的最佳模板質(zhì)量濃度比混勻作為模板，對(duì)各引物對(duì)的終濃度進(jìn)行組合，組合中Hly、DNaseⅠ和Eha的引物對(duì)終濃度分別為0.5、0.5、0.5 μmol/L，0.5、0.5、1 μmol/L，0.5、1、0.5 μmol/L，0.5、1、1 μmol/L，1、0.5、0.5 μmol/L，1、0.5、1 μmol/L，1、1、0.5 μmol/L，1、1、1 μmol/L)，PCR反應(yīng)體系中另含2×PCR MasterMix 25 μL，最后用雙蒸水補(bǔ)齊至50 μL。采用多重PCR反應(yīng)確定最佳引物濃度。

(3)退火溫度的優(yōu)化。PCR反應(yīng)采用模板質(zhì)量濃度和引物濃度優(yōu)化后的體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，分別于48.4，51.5，54.0，56.8，59.5，62.1，64.5和66.0 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)； 最后72 ℃ 10 min。篩選出多重PCR擴(kuò)增的最佳退火條件。

1.2.5 多重PCR的特異性試驗(yàn) 分別準(zhǔn)備樣品1(嗜水氣單胞菌 ATCC19570株、鮰愛德華菌 ATCC33202株、維氏氣單胞菌 ATCC51106株、溫和氣單胞菌 ATCC43979株、舒氏氣單胞菌WL-2株、遲緩愛德華菌 ATCC49231株)、樣品2(嗜水氣單胞菌 ATCC19570株、維氏氣單胞菌 ATCC51106株)、樣品3(嗜水氣單胞菌 ATCC19570株、鮰愛德華菌 ATCC33202株)、樣品4(維氏氣單胞菌 ATCC51106株、鮰愛德華菌 ATCC33202株)、樣品5(嗜水氣單胞菌 ATCC19570株)、樣品6(維氏氣單胞菌 ATCC51106株)、樣品7(鮰愛德華菌 ATCC33202株)和樣品8(溫和氣單胞菌 ATCC43979株、舒氏氣單胞菌WL-2株、副溶血弧菌ATCC17802株、溶藻弧菌 ATCC19108株、遲緩愛德華菌 ATCC49231株)，以各樣品的基因組DNA為模板，按最佳多重PCR體系及方法進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)引物的特異性。

1.2.6 多重PCR的敏感性試驗(yàn) 取28 ℃培養(yǎng)20 h的嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌及培養(yǎng)48 h的鮰愛德華菌菌液，參照國標(biāo)方法(GB/T 4789.2-2003)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，調(diào)整3種菌的濃度分別為2×108CFU/mL的嗜水氣單胞菌、3×108CFU/mL的維氏氣單胞菌、2×108CFU/mL的鮰愛德華菌，再分別對(duì)菌液進(jìn)行102～107的倍比稀釋。取上述不同稀釋度菌液1 mL離心(10 000g，1 min)后收集菌體，提取基因組DNA制備PCR模板，用優(yōu)化的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)多重PCR反應(yīng)的靈敏度。

1.2.7 多重PCR方法的臨床應(yīng)用 應(yīng)用建立的多重PCR方法對(duì)50份臨床病例進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)組織病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，以驗(yàn)證多重PCR檢測(cè)方法的實(shí)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR方法的建立

2.1.1 引物的特異性 提取1.1節(jié)中多種細(xì)菌的基因組DNA，Hly、DNaseⅠ和Eha基因的單項(xiàng)PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

M．DL1000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL1000 DNA Marker；圖A，Ah1～Ah5依次為嗜水氣單胞菌 ATCC19570株、XS9141株、Ci1293株、Ci1294株和Hm093株 Figure A,Ah1-Ah5 were A.hydrophila strains Ah strain ATCC19570,XS9141,Ci1293,Ci1294 and Hm093,respectively；圖B，Av1～Av5依次為維氏氣單胞菌ATCC51106株、IB340株、Ci12910株、Ci12912株和 Ci12914株 Figure B,Av1-Av5 were A.veronii strains ATCC51106,IB340,Ci12910,Ci12912 and Ci12914,respectively；圖C，Ei1和 Ei2依次為鮰愛德華菌ATCC33202株和 HSN-1株 Figure C,Ei1-Ei2 were E.ictaluri strains ATCC33202 and HSN-1,respectively；

由圖1可見，嗜水氣單胞菌ATCC19570、XS9141、Ci1293、Ci1294和Hm093株均擴(kuò)增出 1 091 bp的片段，維氏氣單胞菌ATCC51106、IB340、Ci12910、Ci12912和Ci12914株均擴(kuò)增出262 bp的片段，鮰愛德華菌ATCC33202和HSN-1株均擴(kuò)增出450 bp的片段，而其他種類細(xì)菌和空白對(duì)照均未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，表明供試引物具有較高的特異性。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示所獲得的3個(gè)基因Hly、DNaseⅠ和Eha測(cè)序結(jié)果與GenBank 中登錄的嗜水氣單胞菌Hly(CP000462.1)、維氏氣單胞菌DNaseⅠ(CP002607.1)和鮰愛德華菌Eha(CP001600.2)基因的同源性均為100%。

2.1.2 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 1)模板質(zhì)量濃度組合比的優(yōu)化。對(duì)3種菌基因組DNA不同質(zhì)量濃度組合比進(jìn)行優(yōu)化的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(圖2)顯示，嗜水氣單胞菌ATCC19570株、維氏氣單胞菌ATCC51106株、鮰愛德華菌ATCC33202株 DNA的質(zhì)量濃度組合為0.5，0.5，0.5 ng/μL(泳道1)時(shí)擴(kuò)增效率低于其他質(zhì)量濃度組合。同樣體積的DNA中維氏氣單胞菌(第3、5和7泳道)的含量較少時(shí)，DNaseⅠ基因(262 bp)的特異性條帶相對(duì)較弱，但也能有效擴(kuò)增。泳道6中3個(gè)基因的特異性條帶都均一且亮度較高，為理想擴(kuò)增結(jié)果，所以最佳模板組合為嗜水氣單胞菌1 ng/μL、維氏氣單胞菌1 ng/μL、鮰愛德華菌0.5 ng/μL。

2)引物濃度組合比的優(yōu)化。取不同濃度的引物組合進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，結(jié)果(圖3)表明，當(dāng)維氏氣單胞菌DNaseⅠ的引物濃度為0.5 μmol/L(泳道1、2、5和6)時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果顯示DNaseⅠ基因(262 bp)的擴(kuò)增效率較低。當(dāng)鮰愛德華菌Eha基因的引物濃度為1.0 μmol/L(泳道2、4、6和8)時(shí)，嗜水氣單胞菌Hly基因(1 091 bp)的擴(kuò)增效率相對(duì)降低。因此，嗜水氣單胞菌Hly、維氏氣單胞菌DNaseⅠ、鮰愛德華菌Eha進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增時(shí)引物終濃度分別為1.0，1.0和0.5 μmol/L時(shí)擴(kuò)增效果最好。

M．DL2000 DNA Marker；1-8．嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華菌3種菌基因組DNA模板質(zhì)量濃度比分別為0.5，0.5，0.5；0.5，1，0.5；0.5，0.5，1；0.5，1，1；1，0.5，0.5；1，1，0.5；1，0.5，1；1，1，1 ng/μL DNA concentration of three pathogens

M．DL2000 DNA Marker；1～8．嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華菌3種菌基因引物濃度比分別為0.5，0.5，0.5；0.5，0.5，1；0.5，1，0.5；0.5，1，1；1，0.5，0.5；1，0.5，1；1，1，0.5；1，1，1 μmol/L Primers concentration forA.hydrophila,A.veronii and E.ictaluri were 0.5，0.5，0.5；0.5，0.5，1；0.5，1，0.5；0.5，1，1；1，0.5，0.5；1，0.5，1；1，1，0.5；1，1，1 μmol/L,respectively

3)退火溫度的優(yōu)化。選取不同的退火溫度(48.4,51.5,54.0，56.8，59.5，62.1，64.5和66.0 ℃)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，結(jié)果(圖4)顯示，各溫度下3個(gè)基因均得到有效擴(kuò)增，其中在第5泳道(59.5 ℃)和第6泳道(62.1 ℃)3個(gè)基因的擴(kuò)增效率最為均一，為避免退火溫度太高引起的假陰性，因此選59.5 ℃為優(yōu)化后的最佳退火溫度。

多重PCR優(yōu)化結(jié)果表明，其最佳反應(yīng)體系為：2×TaqPCR MasterMix 25 μL，PHly上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，PDNaseⅠ上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，PEha上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，以2∶2∶1比例混合的嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鮰愛德華菌基因組DNA 1 μL，加雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。最佳反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，59.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；然后再72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束。

2.2 多重PCR 的特異性檢測(cè)

多重PCR擴(kuò)增測(cè)試菌的結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，樣品1檢測(cè)出1 091，450和262 bp共3條特異性的擴(kuò)增條帶，樣品2檢測(cè)出1 091和262 bp的 2條特異性條帶，樣品3檢測(cè)出1 091和450 bp 的 2條特異性條帶，樣品4檢測(cè)出450和262 bp的2條特異性條帶，樣品5檢測(cè)出1 091 bp的特異性條帶，樣品6檢測(cè)出262 bp的特異性條帶，樣品7檢測(cè)出450 bp的特異性條帶，樣品8檢測(cè)結(jié)果為陰性?？梢姡⒌臋z測(cè)方法對(duì)嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華菌具有特異性。

M．DL2000 DNA Marker；1～8．退火溫度分別為48.4，51.5，54.0，56.8，59.5，62.1，64.5和66.0 ℃

M．DL2000 DNA Marker；1～8.樣品1～8的 DNA DNA of sample 1-8

2.3 多重PCR的敏感性檢測(cè)

從圖6可以看出，多重PCR方法對(duì)嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鮰愛德華菌3種病原菌的靈敏度分別為2×102，3×102和2×102CFU/mL。

M．DL1000 DNA Marker;1～6依次為102～107稀釋菌液的嗜水氣單胞菌(A)、維氏氣單胞菌(B)和

2.4 臨床樣品的多重PCR檢測(cè)

50份待檢樣本中，采用多重PCR方法同時(shí)檢出嗜水氣單胞菌和鮰愛德華菌的樣品有2份，同時(shí)檢出嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌的樣品有1份，單一檢出嗜水氣單胞菌、鮰愛德華菌和維氏氣單胞菌的樣品分別有31份、2份和14份，其檢出率為100%。再采用傳統(tǒng)生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證，符合率達(dá)100%。

3 討 論

斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥是造成斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖損失最嚴(yán)重的疾病，該病有急性和慢性死亡2種類型，急性型來勢(shì)猛，呈暴發(fā)性，有明顯的死亡高峰期，死亡率較高；慢性型則死亡緩慢，無死亡高峰期，日死亡率低，但死亡可持續(xù)1個(gè)月左右，導(dǎo)致累計(jì)死亡率較大。鮰愛德華菌、嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌引起斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥在發(fā)病癥狀上都會(huì)表現(xiàn)為體表出血(多出現(xiàn)在頭部、腹部、體側(cè)或鰭條基部)，感染后癥狀難以區(qū)分，且有時(shí)會(huì)出現(xiàn)這幾種菌復(fù)合感染的可能。因此，快速、準(zhǔn)確地獲知該病的病原是控制該病和減少經(jīng)濟(jì)損失最有效的方法[11]。目前，這3種病原菌的鑒定主要通過病原分離及傳統(tǒng)生化鑒定等方法，在診斷過程中易引起誤診和漏檢。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR檢測(cè)方法也被廣泛用于疾病病原檢測(cè)領(lǐng)域，如采用PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)LAMP及特異噬菌體等多種方法對(duì)單一病原鮰愛德華菌[12-15]、致病性嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌進(jìn)行檢測(cè)[16-17]。多重PCR方法因其快速、靈敏和特異的特點(diǎn)，及具有一次檢測(cè)多個(gè)病原基因的優(yōu)勢(shì)，針對(duì)某些難培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的細(xì)菌檢測(cè)以及臨床混合感染的診斷尤為有效[18]。饒靜靜等[19]建立了多重PCR方法，對(duì)嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌的混合感染進(jìn)行了檢測(cè)；隗黎麗等[20]建立了鮰愛德華菌和遲鈍愛德華菌的二重PCR檢測(cè)技術(shù)；Persson等[21]通過多重PCR技術(shù)開展了氣單胞菌的快速鑒定方法的研究。由于斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥病日益嚴(yán)重與復(fù)雜，因此需要建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法用于該病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

本研究檢測(cè)引物是基于細(xì)菌的Hly、DNaseⅠ和Eha基因序列設(shè)計(jì)的。溶血素(HlyA)是氣單胞菌的重要毒力因子，大多數(shù)氣單胞菌屬于條件致病菌，具有致病菌株與非致病菌株之分，HlyA基因能夠用于致病菌株的檢測(cè)[22-24]。脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)是一種細(xì)胞外酶，主要用于腸桿菌科細(xì)菌種的鑒定[25-26]。愛德華菌溶血相關(guān)基因Eha作為毒力調(diào)控基因，在遲緩愛德華菌中研究較多，在鮰愛德華菌中研究較少。本研究根據(jù)Hly、DNaseⅠ和Eha這3個(gè)基因合成了3對(duì)特異性引物，從混合3種菌的菌液中提取了細(xì)菌DNA，運(yùn)用多重PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出了長度分別為1 091，262和450 bp的特異性片段。在建立多重PCR檢測(cè)方法時(shí)，由于各模板質(zhì)量濃度、各引物間的比例和退火溫度等因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響較大，因此有必要對(duì)多重PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，3種菌的模板質(zhì)量濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響不大，均能有效擴(kuò)增出特異性條帶。3對(duì)特異性引物間的比例對(duì)多重PCR擴(kuò)增效率有一定的影響，由于維氏氣單胞菌DNaseⅠ基因的擴(kuò)增片段較小，當(dāng)DNaseⅠ基因的引物含量較低時(shí)，容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，因此反應(yīng)體系中應(yīng)適量增加DNaseⅠ基因的引物含量；鮰愛德華菌Eha基因的引物濃度太高時(shí)會(huì)影響嗜水氣單胞菌Hly基因的擴(kuò)增，因此，反應(yīng)體系中引物終濃度以Hly上下游引物各1.0 μmol/L、DNaseⅠ上下游引物各1.0 μmol/L、Eha上下游引物各0.5 μmol/L時(shí)擴(kuò)增效果最好。本研究中退火溫度對(duì)多重PCR試驗(yàn)結(jié)果的影響不大，在48～66 ℃均能擴(kuò)增出特異條帶，其中59.5和62.1 ℃的擴(kuò)增效果最好，為了避免由于退火溫度高導(dǎo)致的漏檢，因此選用59.5 ℃作為多重PCR方法的最佳退火溫度。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化的多重PCR方法對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰及水產(chǎn)動(dòng)物中常見的病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性，顯示了良好的特異性。傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)鮰愛德華菌的最低檢測(cè)限為106CFU/mL，且全過程需要4～7 d，而本研究建立的多重PCR方法對(duì)嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鮰愛德華菌3種病原菌的靈敏度分別為2×102，3×102和2×102CFU/mL，且可以直接從組織中提取細(xì)菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增與電泳，整個(gè)過程只需3～5 h，說明本研究建立的多重PCR方法比傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定方法更敏感、快速且簡(jiǎn)便。

將本研究建立的多重PCR方法應(yīng)用于臨床上，檢測(cè)50份樣品中嗜水氣單胞菌、鮰愛德華菌和維氏氣單胞菌的感染情況，結(jié)果共檢出3例混合感染的陽性樣品以及47份單一感染的樣品，用傳統(tǒng)生物學(xué)檢測(cè)方法經(jīng)多次分離后的檢測(cè)結(jié)果與單項(xiàng)PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致，表明該方法能夠準(zhǔn)確鑒定這幾種菌引起的敗血癥病，可以滿足臨床檢測(cè)的需要，能夠用于斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥病的流行病學(xué)調(diào)查中。在PCR擴(kuò)增時(shí)，組織總DNA、菌落及菌液等均可作為反應(yīng)模板，不僅大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作過程，而且降低了檢測(cè)成本，同時(shí)也降低了采樣和病料保存要求；將組織總DNA用作檢測(cè)模板，使得該P(yáng)CR診斷方法可以將病料集中處理及診斷，增強(qiáng)了不同地區(qū)魚病流行病學(xué)調(diào)查的準(zhǔn)確性和可靠性。

4 結(jié) 論

建立的多重PCR檢測(cè)方法快速、特異、靈敏，可單獨(dú)或同時(shí)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥病的3種病原嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華菌，也可以用于其他水生動(dòng)物中嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華菌的檢測(cè)。

[1] 劉堂水，汪成竹，陳昌福.斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)菌性病原的分離與鑒定 [J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006,25(5):550-554.

Liu T S,Wang C Z,Chen C F.Isolation and identification of pathogenic bacteria from Channel Catfish,Ictaluruspunctatus[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2006,25(5):550-554.

[2] Evgeny V,Ludmila N,Malcolm B.The structure of the antigenic O-polysaccharide of the lipopolysaccharide ofEdwardsiellaictaluristrain MT104 [J].Carbohydrate Research,2005,340:1509-1513.

[3] Hawke J P.A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish,Ictaluruspunctatus[J].Fish Res Board Can,1979,36:1508-1512.

[4] Harikrishnan R,Nisha M,Balasundaram C.Hematological and biochemical parameters in common carp,Cyprinuscarpio,following herbal treatment forAeromonashydrophilainfection [J].Aquaculture,2003,221:41-50.

[5] Pridgeon J W,Klesius P H,Mu X,et al.Aninvitroscreening method to evaluate chemicals as potential chemotherapeutants to controlAeromonashydrophilainfection in channel catfish [J].J Appl Microbiol,2011,111:114-124.

[6] 蘇應(yīng)兵，鄒桂偉，袁科平，等.斑點(diǎn)叉尾鲴暴發(fā)性敗血癥病原的分離與鑒定 [J].淡水漁業(yè)，2006,36(5):37-41.

Su Y B,Zou G W,Yuan K P,et al.Isolation and identification of the pathogen of fulminant septicaemia fromIctaluruspunctatus[J].Freshwater Fisherie,2006,36(5):37-41.

[7] 黃小麗，汪開毓.斑點(diǎn)叉尾鮰維氏氣單胞菌病的診斷與防治 [J].水產(chǎn)科技情報(bào)，2009(5):240-241.

Huang X L,Wang K Y.Diagnosis and treatment to channel catfish infected withAeromonasveronii[J].Fisheries Science & Technology Information,2009(5):240-241.

[8] 牟巧鳳.四川地區(qū)斑點(diǎn)叉尾鮰源維氏氣單胞菌分子流行病學(xué)調(diào)查 [D].成都:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

Mou Q F.Molecular epidemiological investigation ofAeromonasveroniifrom channel catfish in Sichuan district [D].Chengdu:Sichuan Agricultural University,2012.

[9] 劉 春，李凱彬，王 慶，等.雜交鱧( 斑鱧♀×烏鱧♂) 內(nèi)臟類結(jié)節(jié)病病原菌的分離、鑒定與特性分析 [J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2012,36(7):1119-1125.

Liu C,Li K B,Wang Q,et al.Isolation,identification and characterization ofAeromonasschubertiifrom hybrid snakehead (Channamaculata♀×C.argus♂) [J].Journal of Fisheries of China,2012,36(7):1119-1125.

[10] 劉禮輝，李寧求，石存斌，等.斑點(diǎn)叉尾鮰爛鰓病病原柱狀黃桿菌的分離及鑒定 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,36(17):7124-7126.

Liu L H,Li N Q,Shi C B,et al.Isolation and classification of pathogenic bacterium caused by gill-rote disease in channel catfish(Ictaluruspunctatus) [J].Journal of Anhui Agri Sci,2008,36(17):7124-7126.

[11] Durborrow R,Taylor P,Crosby D,et al.Fish mortality in the Mississippi Catfish farming industry in 1988:causes and treatment [J].Wildlife Dis,1991,27:144-147.

[12] Sakai T,Yuasa K,Sano M,et al.Identification ofEdwardsiellaictaluriandE.tardaby species-Specific polymerase chain reaction targeted to the upstream region of the fimbrial gene [J].Aquat Anim Health,2009,21(2):124-132.

[13] Bilodeau A,Waldbieser G,Terhune J,et al.A real-time polymerase chain reaction assay of the bacteriumEdwardsiellaictaluriin channel catfish [J].Aquat Anim Health,2003,15:80-86.

[14] Savan R,Igarashi A,Matsuoka S,et al.Sensitive and rapid detection ofEdwardsiellosisin fish by a loopmediated isothermal amplification method [J].Appl Environ Microb,2004,70(1):621-624.

[15] Walakira J,Carrias A A,Hossain M,et al.Dentification and characterization of bacteriopages specific to the catfish pathogen,Edwardsiellaictaluri[J].Appl Microbiol,2008,105(6):2133-2142.

[16] Graf J.Diverse restriction fragment length polymorphism patterns of the PCR-amplified 16S rRNA genes inAeromonasveroniistrains and possible misidentification ofAeromonasspecies [J].Clin Microbiol,1999,37:3194-3197.

[17] Kupfer M,Kuhnert P,Korczak B M,et al.Genetic relationships ofAeromonasstrains inferred from 16S rRNA,gyrB and rpoB gene sequences [J].Syst Evol Microbiol,2007,56:2743-2751.

[18] 陳光達(dá)，許信剛，童德文.PCV-2/PPV和PRV多重PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011,39(11):1-6.

Chen G D,Xu X G,Tong D W.Estalishment and initial application of multiplex PCR assay for detecting PCR-2,PPV,and PRV infection [J].Journal of Northwest A&F University(Nat Sci Ed),2011,39(11):1-6.

[19] 饒靜靜.嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌多重PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用 [D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

Rao J J.Multiplex PCR assay for the detection ofAeromonashydrophilaandEdwardsiellatarda[D].Nanjing:Nanjing Agrieultural University,2007.

[20] 隗黎麗，吳華東，劉 毅.黃顙魚“裂頭病”病原二重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用 [J].生物技術(shù)通報(bào)，2014(2):64-68.

Wei L L,Wu H D,Liu Y.Establishment and application of duplex PCR to the pathogen of “Cracked Head” from Yellow Catfish(Pelteobagrusfulvidraco) [J].Biotechnology Bulletin,2014(2):64-68.

[21] Persson S,Al-Shuweli S,Yapici S,et al.Identification of clinicalAeromonasspecies by rpoB/gyrB sequencing and development of multiplex PCR for the detection ofA.hydrophila,A.caviae,A.veroniiandA.media[J].J Clin Microbiol,2015,53(2):653-656.

[22] Xie G S,Huang J,Zhang Q L,et al.A real-time PCR targeted to the upstream regions of HlyB for specific detection ofEdwardsiellatarda[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology,2012,30(5):731-737.

[23] Heuzenroeder M W,Wong C Y F,Flower R L P.Distribution of two hemolytic toxin genes in clinical and environmental isolates ofAeromonasspp.:correlation with virulence in a suckling mouse model [J].FEMS Microbiology Letters,1999,174(1):131-136.

[24] 饒靜靜，李壽崧，黃克和，等.致病性嗜水氣單胞菌多重PCR 檢測(cè)方法的建立 [J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2007,14(5):749-755.

Rao J J,Li S S,Huang K H,et al.Development of multiplex polymerase chain reaction for detection of pathogenicAeromonashydrophilaand its preliminary application [J].Journal of Fishery Sciences of China,2007,14(5):749-755.

[25] 蘇明權(quán)，孫怡群，徐修禮.脫氧核糖核酸酶鑒別腸桿菌科的應(yīng)用價(jià)值 [J].臨床檢驗(yàn)雜志，1988,6(2):91.

Su M Q,Sun Y Q,Xu X L.The diagnostic value of DNase for Enterobacteriace [J].Chinese Journal of Clinical Laboratory Science,1988,6(2):91.

[26] Barozzi I,Bora P,Morelli M J.Comparative evaluation of DN-ase-seq footprint identification strategies [J].Front Genet,2014(5):278.

Establishment of multiplex PCR to detect three pathogens of “septicaemia” from channel catfish,Ictaluruspunctatus

LIU Lihui,ZHANG Defeng,LI Ningqiu,FU Xiaozhe,LIN Qiang,SHI Cunbin

(PearlRiverFisheryResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,KeyLaboratoryofFisheryDrugDevelopment,MinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofAquaticAnimalImmuneTechnology,Guangzhou，Guangdong510380,China)

【Objective】 This study established a multiplex PCR method to rapidly detect three pathogens (Aeromonashydrophila,AeromonasveroniiandEdwardsiellaictaluri) of “septicaemia” from channel catfish,Ictaluruspunctatus.【Method】 Three pairs of primers were designed based on the conservative sequences of hemolytic toxin genes (Hly) ofA.hydrophila,deoxyribonucleaseⅠgenes (DNaseⅠ) ofA.veroniiand haemolysin activator genes (Eha) ofE.ictaluri.Then multiplex PCR condition was optimized and the multiplex PCR for simultaneously detectingA.hydrophila,A.veroniiandE.ictaluriwas established.The specificity and sensitivity were detected and it was applied to clinical samples detection.【Result】 All target fragments were amplified when the concentrations ofHlygene,DNaseⅠgene andEhagene were 1.0,1.0 and 0.5 μmol/L and the annealing temperature was 59.5 ℃.The specificity test showed that fragments of 1 091, 262 and 450 bp were amplified from the genomic DNA ofA.hydrophila,A.veroniiandE.ictaluri,respectively.Three fragments were amplified from mixed DNA sample ofA.hydrophila,A.veronii,E.ictaluriand other bacteria simultaneously,while no amplification was achieved from other negative control groups.The sensitivity test showed that the multiplex PCR had a high sensitivity with the detection limit of 200 CFU/mL forA.hydrophila,300 CFU/mL forA.veroniiand 200 CFU/mL forE.ictaluri.The coincidence rate of the multiplex PCR method and traditional biology detection method for suspicious clinical samples was 100%.【Conclusion】 The established multiplex PCR method was specific,sensitive and rapid to respectively or simultaneously detect the three pathogens ofA.hydrophila,A.veroniiandE.ictaluriof “septicaemia” from channel catfish,I.punctatusor other aquatic animals.

channel catfish;septicaemia;Aeromonashydrophila;Aeromonasveronii;Edwardsiellaictaluri;multiplex PCR

時(shí)間:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.006

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.012.html

2015-04-02

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD25B02)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-46)

劉禮輝(1982-)，女，湖南婁底人，助理研究員，碩士，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究。 E-mail:lhliu0614@163.com

石存斌(1964-)，男，湖南永州人，研究員，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究，E-mail:shicunbin2006@163.com

S941.41+3

A

1671-9387(2016)11-0039-08