自組裝多肽的合成，多肽自組裝成納米纖維凝膠及其與珊瑚，BMP-2組成復(fù)合材料
——結(jié)構(gòu)觀察與展望

陳辰 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科 （福建 廈門 361003）

自組裝多肽的合成，多肽自組裝成納米纖維凝膠及其與珊瑚，BMP-2組成復(fù)合材料
——結(jié)構(gòu)觀察與展望

陳辰 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科 （福建 廈門 361003）

目的：合成含有連接蛋白核心序列Link N的多肽兩親性分子RADA16，研究其自組裝形成凝膠支架的超微結(jié)構(gòu)。將RADA16，珊瑚和BMP-2組成復(fù)合材料體系，研究其超微結(jié)構(gòu)。方法：將RADA16溶解于10%無菌蔗糖溶液中，濃度為1%（10mg/ml，m/v），將RADA16用等體積細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12溶液觸發(fā)多肽自組裝，掃描電鏡。將RADA16與BMP-2溶液等比例混合（1:1），再將其浸沒珊瑚，并用等體積細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12溶液觸發(fā)多肽自組裝，掃描電鏡檢測。結(jié)果：成功合成RADA16多肽兩親性分子，多肽溶液RADA16混合自組裝形成凝膠。原子力顯微鏡檢測顯示：RADA16自組裝形成納米纖維，直徑大于31.9士3.8 nm，長度可達(dá)到幾微米。掃描電鏡顯示：RADA16自組裝形成片層與網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。RADA16附著于珊瑚孔隙中，BMP-2粘附于多肽上，成功合成復(fù)合材料體系（自組裝多肽，珊瑚，BMP-2）。結(jié)論：多肽RADA16在特定的條件下可以自組裝形成納米級凝膠支架（RADARADARADARADARADA），復(fù)合材料體系（自組裝多肽，珊瑚，BMP-2）可以作為骨折修復(fù)組織工程的生物支架材料。

珊瑚 多肽 BMP-2 自組裝 納米纖維 凝膠 支架

骨折是骨科創(chuàng)傷常見病，是引起肢體殘疾最常見的原因之一，目前的治療手段，如復(fù)位外固定，切開復(fù)位內(nèi)固定等雖然可以完成骨折的復(fù)位和固定，但有可能破壞骨折周圍的軟組織環(huán)境和血供，可能導(dǎo)致骨折的延遲愈合甚至不愈合[1～2]。

生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，組織工程是一個(gè)快速發(fā)展的新方向。

骨組織工程可以為骨組織修復(fù)提供環(huán)境和材料，因而為骨折治療提供了新的手段。最近的研究表明，細(xì)胞&材料復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，如機(jī)械強(qiáng)度、超微結(jié)構(gòu)等，越接近目標(biāo)組織的結(jié)構(gòu)越有利于細(xì)胞生物功能的執(zhí)行。與傳統(tǒng)生物材料相比，復(fù)合材料體系具有下列優(yōu)點(diǎn)：①全部由生物性成分組成，生物相容性好，無明顯毒性，易代謝，無明顯排異反應(yīng)；②復(fù)合結(jié)構(gòu)與目標(biāo)組織結(jié)構(gòu)相近；③含水量高，營養(yǎng)物質(zhì)易于運(yùn)輸，代謝廢物易于排出；④制備簡單、可進(jìn)行功能再設(shè)計(jì)，結(jié)構(gòu)可接受更多的材料組合；⑤復(fù)合材料體系單個(gè)單位體積較小，適于微創(chuàng)手術(shù)操作[3]。

本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究的基礎(chǔ)上，研究復(fù)合材料體系（自組裝多肽/珊瑚/BMP-2）在體外的對種子細(xì)胞BMSCs的生物學(xué)行為的影響，以期為骨組織工程打開新的思路。

1.材料與方法

（1）多肽分子的合成

RADA16：ACN-RADARADARADARADA-CONH2o

（2）多肽的溶解

將90ml去離子水與10g蔗糖混合，待蔗糖完全溶解。將其分裝與兩個(gè)50ml離心管中。將10mg自組裝多肽粉末與1ml蔗糖溶液混合于2ml微型管中。在37°C恒溫下，懸浮超聲自組裝多肽溶液30min。

（3）多肽的自組裝

將經(jīng)過超聲處理的多肽溶液500ul至于2ml新的微型管中。將兩個(gè)微型管放置于溫箱中，37°C孵育30min取出微型管，倒置并觀察多肽自組裝的情況。按1:1的比例向兩個(gè)微型管中各加入500ul的DMEM/F12培養(yǎng)基，用200ul吸量管槍頭輕輕吹打，使多肽溶液和DMEM/F12培養(yǎng)基充分混合。多肽溶液終濃度為0.5%。將兩個(gè)微型管再次放入溫箱中，37°C恒溫孵育2～3h。取出微型管，再次觀察自組裝多肽的成膠情況，并取少量自組裝多肽溶液置于載玻片上，可選擇加入0.lmol/L CaCl2溶液促進(jìn)自組裝，觀察多肽自組裝的情況。

（4）珊瑚微結(jié)構(gòu)的觀察

將珊瑚用手鋸，切割成5×5×5mm的立方體，超聲去除孔隙中的雜質(zhì)，高壓蒸汽滅菌后，樣本鍍金處理，通過掃描電鏡（冷場）檢測，放大倍數(shù)控制在50～100倍。用Topomatrix圖像分析軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

（5）自組裝多肽凝膠支架超微結(jié)構(gòu)觀察

將之前制備完成的RADA16溶液再次超聲處理20min，加入相同體積的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基，其目的是觸發(fā)多肽的自組裝。使用冷凍真空干燥法干燥6h或梯度乙醇脫水法，使其外觀呈黏樣粉末狀。樣本鍍金處理后，通過掃描電鏡（冷場）檢測，放大倍數(shù)控制在7500～10000倍。用Topomatrix圖像分析軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

（6）復(fù)合材料體系超微結(jié)構(gòu)觀察

將RADA16與BMP-2溶液等比例混合（1:1），再將其浸沒珊瑚，加入相同體積的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基，其目的是觸發(fā)多肽的自組裝。使用冷凍真空干燥法干燥6h或梯度乙醇脫水法。樣本鍍金處理后，通過掃描電鏡（冷場）檢測，放大倍數(shù)控制在7500～10000倍。用Topomatrix圖像分析軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

（7）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件），數(shù)據(jù)使用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，復(fù)合材料體系（實(shí)驗(yàn)組），RADA16+BMP-2（對照組1）和珊瑚+BMP-2（對照組2）之間的比較采用標(biāo)準(zhǔn)t檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2.結(jié)果

（1）多肽分子合成

成功合成了多肽分子RADA16

使用用高效液相色譜儀（HPLC）和質(zhì)譜儀（MS）進(jìn)行純化和分析。

多肽分子RADA16的分子量為1712.79Da，純度為95.12%。

（2）多肽自組裝形成凝膠多肽

RADA16溶解后形成無色透明水凝膠，微形管倒置30min后凝膠仍緊密黏附于管底，無滑脫；為了進(jìn)一步觀察多肽自組裝的情況，我們將RADA16多肽溶液置于載玻片上，用CaCl2溶液促進(jìn)其自組裝。RADA16多肽溶液在CaCl2溶液觸發(fā)下形成無色粘彈性凝膠。

圖1. CaCl2溶液觸發(fā)RADA16多肽溶液形成自組裝多肽凝膠。

圖2. 100倍珊瑚掃描電鏡下觀。

圖3. 10000倍RADA16自組裝多肽凝膠掃描電鏡下觀，納米纖維及片層樣規(guī)則結(jié)構(gòu)形成。

圖4. 10000倍掃描電鏡下觀，骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2均勻附著于RADA16自組裝多肽凝膠上。

（3）珊瑚微結(jié)構(gòu)的觀察

珊瑚于電鏡下呈多孔狀結(jié)構(gòu)，孔隙排布緊密，大小均勻，孔隙大小從200um到500um不等。

（4）自組裝多肽凝膠超微結(jié)構(gòu)觀察

為使得自組裝多肽不至在高溫下變性融化，我們選用冷場掃面電鏡觀察自組裝多肽凝膠的超微結(jié)構(gòu)。冷場掃描電鏡真空室內(nèi)溫度接近室溫，與熱場掃描電鏡真空室500°C左右的高溫相比，更適用于生物材料的檢測。掃描電鏡圖像顯示：多肽RADA16自組裝形成納米纖維及片層堆疊結(jié)構(gòu)（RADA16，凝膠纖維直徑D=13.2±1.6nm）。其長度從幾百納米到幾微米不等。

（5）復(fù)合材料體系超微結(jié)構(gòu)觀察

為使得自組裝多肽及BMP-2不至在高溫下變形融化及失活，我們選用冷場掃面電鏡觀察自組裝多肽凝膠的超微結(jié)構(gòu)。冷場掃描電鏡真空室內(nèi)溫度接近室溫，與熱場掃描電鏡真空室500°C左右的高溫相比，更適用于生物材料的檢測。掃描電鏡圖像顯示：自組裝多肽的納米結(jié)構(gòu)分布于珊瑚的空隙中，而在自組裝多肽的納米架構(gòu)上，均勻黏附著骨形態(tài)發(fā)生蛋白顆粒。由此，珊瑚，自組裝多肽，骨形態(tài)發(fā)生蛋白三者形成了層層遞進(jìn)的超微復(fù)合材料體系。

3.討論

在兼顧了骨折傳統(tǒng)治療的基礎(chǔ)上，組織工程，特別是骨組織工程為骨折的治療開辟了一個(gè)嶄新的前景。正如之前所提到的，對于組織工程而言，主要包括如下基本元素：生物材料，種子細(xì)胞和調(diào)控因子。這三者組合在一起，能在體外模擬組織再生的條件，從而達(dá)到修復(fù)組織損傷與退變的目的。

通過組織工程學(xué)的原理來修復(fù)創(chuàng)傷，特別是骨折，已成為目前學(xué)界的研究熱點(diǎn)。而組織工程三要素中，構(gòu)建具有良好結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的支架材料，卻一直是組織工程的難點(diǎn)之一。在以往的研究中，被用于骨組織重建再生的材料有很多，如藻酸鹽、殼聚糖等。這些材料雖然能呈現(xiàn)出一定的，促進(jìn)細(xì)胞黏附，增殖和細(xì)胞分化的性能。但相對與人天然骨組織的性能而言，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。故構(gòu)建出具有優(yōu)良生物學(xué)活性，同時(shí)能提供合適的微環(huán)境給種子細(xì)胞增殖分化的生物材料就成了目前的主要研究方向[4～5]。

自組裝多肽納米纖維凝膠的自組裝機(jī)理如下：肽是由氨基酸經(jīng)由酰胺鍵連接的短的低聚物。氨基酸是組成蛋白質(zhì)和肽天然積木結(jié)構(gòu)[6]。氨基酸包括胺，羧酸和官能團(tuán)以及獨(dú)特的側(cè)鏈。共計(jì)大約20種不同的氨基酸，以及20種不同的側(cè)鏈，這些賦予了其獨(dú)特的性質(zhì)和可變性。存在于氨基酸側(cè)鏈的差異使它們能夠按照它們的化學(xué)組合被分成不同的類別，例如疏水性/親水/脂族/芳族或中性/正/負(fù)電荷。氨基酸之間的眾多相互作用也使得其能發(fā)展出復(fù)雜的自組裝納米結(jié)構(gòu)。這些類型的相互作用包括氫鍵，靜電相互作用，疏水相互作用，芳族相互作用（π-π堆疊）和范德華力[7]。人們利用氨基酸變化的特性操縱肽的自組裝，以此來設(shè)計(jì)新的功能性生物材料。即自組裝多肽納米纖維凝膠[8～9]。自組裝多肽納米纖維凝膠不僅具備原來多肽分子的生物性能，由于其規(guī)則排列形成的三維超微結(jié)構(gòu)，使得其還具有更接近于天然結(jié)構(gòu)的材料性能[10]。

珊瑚作為一種天然材料，主要成分為羥基磷灰石，其成分與骨組織的剛性成分較為相似，而其孔隙結(jié)構(gòu)具有較高的孔隙率，無論對活性成分或是種子細(xì)胞都有很好的容

納性質(zhì)。珊瑚已在口腔科和頜面部修復(fù)方面有著廣泛的應(yīng)用，而在此系統(tǒng)中，珊瑚作為整體結(jié)構(gòu)中的剛性成分，保證了整個(gè)系統(tǒng)的強(qiáng)度，同時(shí)對骨折兩側(cè)短端的連接作用也有助于骨折的修復(fù)。RADA16（PuraMatrix）是一種由（R，精氨酸）和（A，天門冬氨酸）這兩種陽性和陰性氨基酸分別交替組成的自組裝多肽。RADA16多肽可以在適宜條件下自發(fā)的發(fā)生分子間自組裝形成有序三維纖維凝膠支架[11～12]。其已被廣泛應(yīng)用于藥物緩釋，細(xì)胞三維培養(yǎng)及組織再生。RADA16作為整體結(jié)構(gòu)中的柔性成分，其作用主要在于在珊瑚剛性結(jié)構(gòu)的保護(hù)下，在其孔隙中形成自發(fā)的三維結(jié)構(gòu)，一方面增加了珊瑚孔隙的表面積，另一方面其生物活性特性有助于提供種子細(xì)胞更適宜的生長微環(huán)境。研究表明，BMP-2在調(diào)節(jié)因子方面，骨形態(tài)發(fā)生蛋白無疑是最理想的選擇之一。其能夠在人體內(nèi)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，也在體外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，符合了骨形態(tài)發(fā)生蛋白的骨移植，其效果，好于單純的骨移植治療。所以其在系統(tǒng)中，承擔(dān)下了微環(huán)境中生長因子的重要職能[13]。

復(fù)合材料體系（自組裝多肽/珊瑚/BMP-2）具有以下優(yōu)點(diǎn)：①全部由氨基酸，天然材料和成分組成，生物相容性好，無明顯毒性，易代謝，無明顯排異反應(yīng)；②珊瑚的孔隙結(jié)構(gòu)與自組裝多肽形成的三維結(jié)構(gòu)與骨組織結(jié)構(gòu)相近；③珊瑚孔隙率高，自組裝多肽凝膠含水量高，達(dá)95%以上，營養(yǎng)物質(zhì)易于運(yùn)輸，代謝廢物易于排出；④制備簡單、自組裝多肽可進(jìn)行功能再設(shè)計(jì)，而珊瑚結(jié)構(gòu)可接受更多的材料組合；⑤復(fù)合材料體系單個(gè)單位體積較小，適于微創(chuàng)手術(shù)操作。此外，這種復(fù)合材料體系（自組裝多肽/珊瑚/ BMP-2）的機(jī)械強(qiáng)度接近于正常骨組織，為骨組織工程提供了新的思路[14～15]。

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Biosynthesis of Self-assembling Peptide, Peptide Self-assembling and Construction of Material System of Self-assembling Peptide, Natural Coral and BMP-2

CHEN Chen Dept of Orthopaedics, the first Affiliated Hospital of Xiamen University (Fujian Xiamen 361003)

Objective: To synthesize the self-assembling peptide RADA16 and investigate its microstructure. construct a material system of self-assembling peptide, natural coral and BMP-2 and investigate its microstructure. Methods: The RADA16 peptides was dissolved in 10% sterile sucrose at a final concentration of 1% (l0mg/ ml, m/v). Peptides solution is treated with equal volume of Dulbecco's, Modified Eagle Medium F-12(DMEM-F12) solutions. The microstructures of peptide scaffolds were observed using scanning electron microscopy (SEM). The RADA16 peptides solution and BMP-2 solution were put together with equal volume. Then the combined solution is put to merge the nature coral. The microstructures of the system is observed using scanning electron microscopy (SEM). Results: The RADA16 peptide is successfully synthesized. The SEM images demonstrated that the nanofibers was observed in RADA 16 peptide sample, and the length of these fibers could be ranging from several hundreds nanometers to a few microns. The material system of self-assembling peptide, natural coral and BMP-2 is successfully synthesized. The SEM images demonstrated that the structure of the system is with ruled and systemic layers and levels. Conclusions: The RADA16 scaffold and the material syetem of RADA16, natural coral and BMP-2 can be sussessfully made, which could be useful in the bone regeneration.

coral, BMP-2, peptide, self-assembly, nanofiber, hydrogel, scaffold

1006-6586(2016)06-0015-04

R318.08

A