程序性壞死在肝臟疾病中的研究進(jìn)展

謝偉 李璽 張召輝

·綜 述·

程序性壞死在肝臟疾病中的研究進(jìn)展

謝偉 李璽 張召輝

在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的過程中，肝細(xì)胞的壞死和凋亡一直被認(rèn)為是肝臟疾病的基本病理途徑。但是，近年來研究發(fā)現(xiàn)一種新的細(xì)胞死亡方式：程序性壞死(Necroptosis)，它可以像凋亡那樣由特定因子啟動，按照一定通路發(fā)生程序性的細(xì)胞壞死，在肝臟疾病中也發(fā)揮重要的作用。本文將對程序性壞死的發(fā)現(xiàn)、特征、與凋亡和自噬的關(guān)系、有關(guān)信號通路的研究進(jìn)展以及在肝臟疾病中的研究現(xiàn)狀等做一綜述。

細(xì)胞死亡；細(xì)胞凋亡；程序性壞死；肝臟

肝細(xì)胞死亡是肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的最終結(jié)果，當(dāng)前比較公認(rèn)的細(xì)胞死亡方式有壞死、凋亡以及自噬三類。凋亡和自噬均是細(xì)胞主動程序性的自我調(diào)控過程，因而被稱為程序性死亡[1]。既往細(xì)胞壞死被認(rèn)為是無序不受調(diào)控的被動細(xì)胞死亡，而目前認(rèn)為這種被動無序性死亡只有在劇烈的理化因素?fù)p害下才會發(fā)生。近年來研究發(fā)現(xiàn)，部分細(xì)胞壞死可以像凋亡和自噬那樣由特定因子啟動，按照一定通路發(fā)生程序性細(xì)胞死亡，這種新的死亡方式，由Degterev等[2]于2005年首次報道，并命名為程序性壞死(necroptosis)。程序性壞死在大腦、心臟、腎臟等組織中研究較多，在肝臟中研究較少，本文將對程序性壞死在肝臟疾病中的研究現(xiàn)狀做一綜述。

一、程序性壞死的發(fā)現(xiàn)

1964年，Lockshin等[3]首次提出程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death,PCD)的概念，即發(fā)育過程中發(fā)生的某類由特定基因調(diào)控的細(xì)胞死亡。1972年，Kerr等[4]報道在局部缺血的情況下觀察到大鼠肝細(xì)胞不斷地轉(zhuǎn)變成由細(xì)胞質(zhì)膜包裹小圓團(tuán)形態(tài)，他將這種特殊的細(xì)胞死亡方式命名為細(xì)胞凋亡。1973年，Schweichel和Merker[5]根據(jù)形態(tài)學(xué)特征將細(xì)胞死亡劃分為凋亡(apoptosis)、自噬(autophagy)和壞死(necrosis)。細(xì)胞凋亡是受死亡信號調(diào)控并伴隨天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶(caspase)活化的一種細(xì)胞主動自殺的死亡方式，凋亡時細(xì)胞皺縮、核仁裂解、胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體，不會引發(fā)周圍組織的炎癥反應(yīng)[6]。細(xì)胞壞死時細(xì)胞膨脹，質(zhì)膜破裂，細(xì)胞內(nèi)含物釋放到細(xì)胞外，引起周圍組織炎癥反應(yīng)，是一種不受基因調(diào)控的被動的細(xì)胞死亡方式。但是，Laster等[7]于1988年發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)可誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，提示壞死不完全是被動的，也可能是主動過程。隨后，Vercammen等[8]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在凋亡被抑制的條件下，TNF作用的細(xì)胞呈現(xiàn)壞死樣死亡，明確了部分壞死是主動過程，并提出其可能發(fā)生的條件。為探討這種死亡方式的機(jī)制，哈佛醫(yī)學(xué)院Degterev等[2](2005，袁鈞瑛實驗室)開展研究并篩選15 000種化合物，找到一個能特異性阻斷由TNF-α等引起細(xì)胞壞死的化學(xué)小分子命名為necrostatin-1(Nec-1)，Nec-1能選擇性抑制這種壞死樣的細(xì)胞死亡，但對凋亡沒有抑制作用。同時，定義這種死亡方式為程序性壞死(necroptosis)。

二、程序性壞死的特征

程序性壞死是一種主動程序性的細(xì)胞死亡方式，有別于傳統(tǒng)意義上的壞死。就目前的研究來看其具有以下一些特征[9-11]：①具有壞死的典型形態(tài)特征(完整性嚴(yán)重受損，細(xì)胞和細(xì)胞器腫脹、細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞內(nèi)容物流失)而核內(nèi)染色質(zhì)缺乏明顯的形態(tài)改變。它與凋亡和自噬有明顯的區(qū)別，三者可以通過光、電鏡觀察予以區(qū)分。②程序性壞死的普遍下游應(yīng)答表現(xiàn)是自噬，主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)大量的自噬小體形成。使用自噬特異性阻斷劑后，壞死的進(jìn)程不會被改變，但自噬小體不再形成，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)而出現(xiàn)大量的電子致密物沉積。③可被Nec-1特異性抑制，而不會被凋亡和自噬的特異性抑制劑Z-VAD.fmk[N‐benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me)fluoromethylketone]和3‐甲基腺嘌呤等阻斷。Nec-1的分子量為259.3D，屬于生物堿類物質(zhì)，其主體是一個吲哚與乙內(nèi)酰脲的連接體，它對于凋亡和自噬沒有任何抑制作用，不具有直接的抗氧化作用，對正常細(xì)胞的形態(tài)、增殖、黏附以及ATP、鈣和氧自由基水平等均無顯著影響。④部分發(fā)生程序性壞死的細(xì)胞中伴隨活性氧的增多。⑤可導(dǎo)致明顯的炎癥反應(yīng)，大量炎性細(xì)胞活化及浸潤。

1．程序性壞死與凋亡 程序性壞死與凋亡是由死亡受體介導(dǎo)的兩種不同的細(xì)胞死亡方式：凋亡有兩條信號通路，即由細(xì)胞膜上的死亡受體介導(dǎo)的線粒體非依賴性途徑和由線粒體釋放細(xì)胞色素C啟動的線粒體依賴性途徑，兩條途徑均需caspase的活化及其誘發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)[12]；程序性壞死不依賴于caspase，也不需線粒體釋放細(xì)胞色素C。但兩者之間也存在聯(lián)系，一般情況下，細(xì)胞在caspase活性被抑制而不能發(fā)生凋亡的情況下會啟動程序性壞死。紫草素誘導(dǎo)的程序性壞死能在Nec-1存在下轉(zhuǎn)化為凋亡，這種轉(zhuǎn)化可能與線粒體膜通透性的改變有關(guān)。另外，在一些細(xì)胞內(nèi)凋亡與程序性壞死同時存在，但在某些腫瘤細(xì)胞內(nèi)同時存在凋亡與程序性壞死的缺陷[13]。這些現(xiàn)象提示凋亡與程序性壞死之間可能是相互關(guān)聯(lián)的。

2．程序性壞死與自噬 研究發(fā)現(xiàn)，程序性壞死過程中伴隨有自噬現(xiàn)象[14]，自噬是以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量自噬體為特征的細(xì)胞“自我消化”的一系列生化過程，也是一種非caspase依賴性的細(xì)胞死亡。Nec-1能通過抑制自噬上游的信號通路抑制程序性壞死中自噬的發(fā)生，而不能直接抑制自噬本身的發(fā)生，這提示自噬是程序性壞死的下游應(yīng)答表現(xiàn)，而并不是導(dǎo)致程序性壞死的原因。另外發(fā)現(xiàn)在Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas-associated death domajn protein,FADD)缺失的T細(xì)胞中，程序性壞死能促進(jìn)自噬的發(fā)生而減低其增殖，但其中的具體機(jī)制尚不清楚。

三、程序性壞死的信號通路

1．程序性壞死的引發(fā) 程序性壞死可由不同的刺激引起，如TNF-α[15]，自殺相關(guān)因子配體(factor associated suicide ligand,FasL)，TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumornecrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)，TWEAK，T細(xì)胞受體，干擾素，抗癌藥物，病原體相關(guān)分子模式激活RIG-I樣或Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)[16]，基因毒性應(yīng)激[17]，氧化應(yīng)激，干擾素和病毒介導(dǎo)DNA依賴的活化劑調(diào)節(jié)因子?？梢l(fā)程序性壞死的死亡受體包括Fas、TNF受體1(TNF receptor 1，TNFR1)、TNFR2、TNF相關(guān)凋亡介導(dǎo)的連接受體1(TNF-relatedapoptosis-induced ligand receptor 1,TRAILR1)、TRAIL2等，這些受體會激活凋亡通路。但在某些細(xì)胞系中，當(dāng)caspase活性受到抑制時，就會出現(xiàn)一種不依賴于caspase活性的程序性細(xì)胞壞死途徑[18]。程序性細(xì)胞壞死也可由病原識別受體(pathogen recognition receptor,PRR)家族啟動，包括質(zhì)膜、內(nèi)涵體膜相關(guān)Toll樣受體、胞質(zhì)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide binding and oligomerization domain-like receptor,NLR)等，它們是免疫系統(tǒng)執(zhí)行功能過程中細(xì)胞識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)的受體，可識別包括病毒和細(xì)菌的核酸、脂蛋白、脂多糖、肽葡聚糖等在內(nèi)的PAMP，一般可參與炎癥細(xì)胞因子應(yīng)答。在某些細(xì)胞類型中，PAMP可通過激活PRR來誘導(dǎo)程序性細(xì)胞壞死發(fā)生。例如脂多糖是革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分之一，在caspase-8活性被抑制時，可與TLR4相互作用引起巨噬細(xì)胞的程序性細(xì)胞壞死。此外，一些病毒可編碼caspase-8抑制蛋白，抑制因感染引起的宿主細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致程序性壞死發(fā)生，后者可能與這些病毒持續(xù)性感染所致慢性炎癥有一定關(guān)系[19]。

2.程序性壞死的傳遞

(1)雖然存在多種受體和配體能誘導(dǎo)和調(diào)控程序性壞死的發(fā)生，但目前研究最為透徹的是TNFR1與配體TNF-α的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。TNF-α與細(xì)胞膜上的死亡受體——TNFRl/2結(jié)合，激活TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(TNFR1-associated death domain protein,TRADD)與TNFR相關(guān)因子2或5(TRAF2/5)、受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIP1)和細(xì)胞凋亡抑制蛋白1或2(cellular inhibitor-of-apoptosis proteins1/2,cIAP1/2)形成復(fù)合物Ⅰ(complex Ⅰ)[15]。RIP1去泛素化后脫離復(fù)合物Ⅰ，在胞質(zhì)內(nèi)與TRADD、Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(fas-associated protein with death domain,FADD)、caspase-8形成復(fù)合物Ⅱa。復(fù)合物Ⅱa進(jìn)一步發(fā)展方向取決于caspase-8的活化狀態(tài)：當(dāng)caspase-8激活時具有裂解RIP1/受體相互作用蛋白3(RIP3)的作用，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡鏈接反應(yīng)；而當(dāng)caspase-8活性被抑制時，RIP1/RIP3被磷酸化，磷酸化的RIPl/RIP3及RIP3下游混合譜系激酶域樣因子(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)形成復(fù)合物Ⅱb，即壞死復(fù)合體，最終誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。在RIP3下游通路的研究中發(fā)現(xiàn)[16]，壞死復(fù)合體中磷酸化的RIP3可以與MLKL蛋白相結(jié)合，MLKL的磷酸化及其細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變是執(zhí)行程序性壞死的關(guān)鍵因素。近期研究發(fā)現(xiàn)[17]，復(fù)合物中的組分之一還包括一種線粒體蛋白磷酸酶，磷酸甘油酸變位酶5(phosphoglycerate mutase family member 5,PGAM5)。PGAM5在多種原因造成的細(xì)胞壞死通路中起到樞紐的作用，通過調(diào)節(jié)氧自由基的過量增長和鈣離子的過度滲漏等引起的細(xì)胞壞死。另外，磷酸化的RIP3可以上調(diào)谷氨酰胺合成酶、糖原磷酸化酶、谷氨酸脫氫酶1等代謝酶的活性，從而增強(qiáng)細(xì)胞的能量代謝，導(dǎo)致過量活性氧生成[20]，進(jìn)一步引發(fā)細(xì)胞死亡。

(2)受體相互作用蛋白(receptor-interacting proteins,RIPs)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，該蛋白質(zhì)家族含有高度保守的絲/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。RIP家族蛋白質(zhì)作為重要的信號分子參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，針對病原感染、炎癥、細(xì)胞分化和DNA損傷等不同應(yīng)激信號，RIP蛋白啟動和調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，決定細(xì)胞走向凋亡、壞死或存活等不同命運(yùn)。RIPs家族由7個成員組成，包括RIP(RIP1)、RIP2(RICK/CARDIAK)、RIP3(RIPK3)、RIP4(DIK/PKK)、RIP5(SgK288)、RIP6(LRRK1)及RIP7(LRRK2)。

(3)RIP1的N端包含一個絲/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，C端包含一個死亡結(jié)構(gòu)域和一個稱為RIP同源結(jié)合基序(RIP homotypic interaction motif,RHIM)的結(jié)構(gòu)域。RIP1的泛素化狀態(tài)決定它是一個促細(xì)胞存活的分子還是促細(xì)胞死亡的激酶。RIP1激酶的死亡結(jié)構(gòu)域可以和死亡受體結(jié)合，如TNFR1，F(xiàn)as，TRAILR1，TRAILR2。它還可以和包含死亡域的配體蛋白結(jié)合，例如TRADD和FADD，激活NF-κB信號通路，維持細(xì)胞生存[21]。研究表明敲除RIP1的小鼠不能激活促生存的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，在出生后3 d之內(nèi)就死于廣泛的凋亡。同時RIP1激酶活性是TNF、FasL、TRAIL這些死亡受體介導(dǎo)的凋亡向程序性壞死的轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵[22]。Necrostatin-1是一種RIP1激酶的變構(gòu)抑制劑，能在不同的細(xì)胞膜上阻斷死亡受體介導(dǎo)的程序性壞死，而RIP1的泛素化狀態(tài)在這兩條信號通路中扮演著極為重要的角色。泛素化的RIP1，其K63泛素鏈能促進(jìn)TAKl-TAB2-TAB3復(fù)合物的形成，從而促進(jìn)MAPK通路和NF-κB通路的激活，促進(jìn)細(xì)胞生存和炎癥的發(fā)生。凋亡蛋白阻斷劑cIAP可以維持RIP1泛素化狀態(tài)，從而阻斷凋亡通路使細(xì)胞沿著生存的方向發(fā)展。線粒體來源的caspase第2激活因子(secondmitochondria-derived activator of caspase,Smac)是一個重要促凋亡蛋白，Smac類似物可被cIAP降解，它的存在使得非泛素化的RIP1與casepase-8以及FADD形成不依賴TRADD的復(fù)合物Ⅱ，又稱為復(fù)合物Ⅱb。casepase-8受到抑制時，同樣可以引起復(fù)合物Ⅱb中RIP1和RIP3的相互作用進(jìn)而發(fā)生程序性壞死。當(dāng)cIAP1和cIAP2因基因敲除或者因Smac類似物活性被抑制時，RIP3的K63泛素化狀態(tài)受抑制以及TNF誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)位減少[14]，細(xì)胞也向凋亡和程序化壞死轉(zhuǎn)變。去泛素化酶CYLD和A20可以引起RIP1的去泛素化，敲除CYLD人類Jurket細(xì)胞，TNF誘導(dǎo)的程序性壞死也減少[20]，說明CYLD通過調(diào)節(jié)泛素化進(jìn)而影響程序性壞死的進(jìn)程。

(4)RIP3除N端包含一個絲/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，其C端也包含一個RHIM結(jié)構(gòu)域。RIP3廣泛表達(dá)于胚胎和大量的成熟組織中，人的RIP3基因定位于染色體14qll.2，該區(qū)域在多種腫瘤中發(fā)生改變。體外激酶分析實驗表明，RIP3是一個激酶并且會發(fā)生自身磷酸化，對TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞壞死有抗性的細(xì)胞株沒有RIP3的表達(dá)，而對TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞壞死敏感的細(xì)胞都有內(nèi)源性RIP3的表達(dá)，這表明RIP3的表達(dá)與TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞壞死密切相關(guān)。進(jìn)一步實驗證實，在抗性細(xì)胞株中表達(dá)野生型RIP3可激活TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞壞死途徑，從而逆轉(zhuǎn)抗性細(xì)胞成為敏感型細(xì)胞。這些結(jié)果表明RIP3的表達(dá)是細(xì)胞發(fā)生TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的必要條件。在7個RIP家族成員中，只有RIP1和RIP3的C末端含有RHIM結(jié)構(gòu)域。RIP3的RHIM結(jié)構(gòu)域中有4個氨基酸易發(fā)生突變從而解除RIP1與RIP3的相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致RIP3在細(xì)胞壞死中功能的喪失，這表明RIP1/RIP3蛋白復(fù)合體在細(xì)胞壞死途徑中發(fā)揮著重要作用，同時也說明在細(xì)胞壞死信號的刺激下，RIP3蛋白將RIP1的功能從細(xì)胞凋亡途徑轉(zhuǎn)換到細(xì)胞壞死途徑，承擔(dān)著從凋亡到壞死的重要開關(guān)作用[23]。

(5)長期以來，RIP3下游效應(yīng)是一個未知領(lǐng)域，但研究發(fā)現(xiàn)MLKL作為RIP3底物[24]。MLKL是假性激酶，可以結(jié)合ATP，但它的催化是低效的。MLKL有N-末端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域區(qū)和C端激酶樣結(jié)構(gòu)域。MLKL通過其C-末端激酶樣結(jié)構(gòu)域綁定RIP3激酶的結(jié)構(gòu)域。MLKL參與在壞死復(fù)合體形成的起始階段[25]，RIP3的Serine227位點發(fā)生磷酸化，這對于其與MLKL的結(jié)合是必需的。沒有MLKL的參與，壞死復(fù)合體將會被抑制在前體階段，因此兩者的結(jié)合對程序性壞死的進(jìn)程非常關(guān)鍵。另一重要的磷酸化事件是MLKL T357、S358的雙重磷酸化，可暴露MLKL的激酶結(jié)構(gòu)域，使其能與下游的效應(yīng)因子相互作用，使壞死復(fù)合體進(jìn)入激活狀態(tài)。另外研究發(fā)現(xiàn)敲除MLKL的小鼠在一般情況良好的條件下可以正常存活[26]。

(6)近期有研究發(fā)現(xiàn)在壞死復(fù)合體中還包括一種線粒體蛋白磷酸酶PGAM5[27]。根據(jù)這份報告，RIP3能磷酸化PGAM5，導(dǎo)致PGAM5去磷酸化蛋白表達(dá)，招募線粒體分裂因子Drp1。然而，PGAM5在程序性壞死中的作用似乎并不重要[28]。此外，線粒體在細(xì)胞中的作用不很清晰，在程序性壞死中對線粒體和線粒體蛋白的重要性還不能肯定。關(guān)于PGAM5的作用還需繼續(xù)深入研究。

3.程序性壞死的執(zhí)行 程序性壞死和一般的細(xì)胞壞死有相同的亞細(xì)胞改變，例如細(xì)胞內(nèi)過氧化物急劇增加，線粒體膜高度磷酸化，膜通透性增加，細(xì)胞腫脹等，但其機(jī)制不同，且比較復(fù)雜，如：通過氧化應(yīng)激途徑，增加胞內(nèi)ROS導(dǎo)致程序性壞死；通過多聚ADP核糖聚合酶1作用；線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor,AIF)途徑導(dǎo)致DNA斷裂導(dǎo)致程序性壞死等；脂肪氧合酶脂質(zhì)過氧化作用；磷脂酶A2切割磷脂并釋放出脂肪酸作用等[29-30]。

四、程序性壞死的抑制劑

Necrostatins是特異阻斷程序性細(xì)胞壞死的一類抑制劑，包括Nec-1和一系列Nec-1衍生物及類似物，如Nec-li、7-Cl-O-Nec-1[31]、necrostatin-3,-4,-5,-7和necrostatin-21[32]。Nec-1的分子量為259.3D，屬于生物堿類物質(zhì)，又名甲基-硫乙內(nèi)酰脲-色氨酸(methyl-thiohydantoin-tryptophan)。Nec-1作為別構(gòu)抑制劑特異地與RIP1結(jié)合，穩(wěn)定RIP1構(gòu)象，從而抑制RIP1激酶結(jié)構(gòu)域自身磷酸化的活性，阻止下游細(xì)胞死亡的發(fā)生，并且完全抑制TNF誘導(dǎo)的壞死樣形態(tài)學(xué)改變[33]。Nec-li是Nec-1去甲基后的化合物，其不具有Nec-1抗程序性細(xì)胞壞死的活性，在研究中常作為Nec-1的陰性對照。7-C1-O-Nec-1是比Nec-1更特異更穩(wěn)定的抑制劑，其對RIP1有非常高的選擇性。Necrostatin-3在藥物代謝的穩(wěn)定性上具有優(yōu)越性。

五、程序性壞死的檢測

程序性細(xì)胞壞死與經(jīng)典壞死在形態(tài)學(xué)上相似，單從形態(tài)學(xué)分析難以鑒別與區(qū)分，故結(jié)合形態(tài)學(xué)、藥物和生化分析是目前研究程序性細(xì)胞壞死的主要方法。一般以出現(xiàn)壞死樣形態(tài)的改變，并可被necrostatins或敲除RIP1，RIP3所阻斷作為程序性壞死的基本判定標(biāo)準(zhǔn)[2]。已知RIP1、RIP3是程序性細(xì)胞壞死發(fā)生的上游信號通路的關(guān)鍵因素，RIP1、RIP3、MLKL復(fù)合體形成及磷酸化也可間接反映程序性細(xì)胞壞死的發(fā)生，所以RIP1-RIP3-MLKL復(fù)合體形成及磷酸化是判定程序性壞死的補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)[34-35]。

六、程序性壞死與肝臟疾病

Roychowdhury等[36]報道，乙醇喂養(yǎng)小鼠能夠激活凋亡和程序性壞死的信號通路。乙醇誘導(dǎo)的RIP3表達(dá)是獨立存在或缺乏caspase抑制劑存在的。用敲除Bid的小鼠或者是caspase抑制劑VX166來抑制凋亡從而達(dá)到預(yù)防酒精性肝損傷的效果是不明顯的。敲除RIP3對乙醇誘導(dǎo)小鼠的細(xì)胞凋亡沒有任何影響。慢性乙醇喂養(yǎng)的小鼠RIP3表達(dá)增加；然而，RIP1表達(dá)保持不變。而且，酒精性肝病病人肝活檢中，RIP3表達(dá)顯著增加，這提示在人類的肝臟病變中也有程序性壞死的存在。細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)敲除小鼠不能誘導(dǎo)RIP3，提示CYP2E1在酒精性肝損傷中表達(dá)于RIP3的上游。RIP3基因敲除小鼠可以減少pJNK陽性的肝細(xì)胞數(shù)，減少前炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，且能夠?qū)凭愿螕p傷有一定保護(hù)作用[37]。

在對乙酰氨基酚誘導(dǎo)小鼠肝中毒模型中，對乙酰氨基酚毒性作用增加RIP3表達(dá)，提高丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平，并導(dǎo)致廣泛的肝細(xì)胞壞死。使用RIP3寡核苷酸抑制劑和使用RIP3基因敲除小鼠不僅能降低ALT和氧化應(yīng)激的水平，而且能改變線粒體功能，減少RIP3表達(dá)能降低JNK和Drp1的活化，然后減少線粒體氧化應(yīng)激和裂解，最終防止細(xì)胞壞死[38]。Nec-1對APAP引起的肝細(xì)胞毒性的保護(hù)和RIP1/RIP3復(fù)合物在JNK上游表達(dá)的研究中也有相似的結(jié)果[39]。

相比其他器官如肺和脾，RIP3在健康小鼠的肝臟中表達(dá)很弱[40]，但在發(fā)生程序性壞死的細(xì)胞中，如敲除caspase-8的小鼠中，RIP3表達(dá)卻是上調(diào)的。在敲除TAK1導(dǎo)致小鼠慢性肝損傷的模型中[41]，出現(xiàn)了RIP3介導(dǎo)的程序性壞死和caspase-8介導(dǎo)的凋亡的相反作用。在這個模型中，聯(lián)合敲除TAK1和caspase-8，肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞增生程度很低，從而減少膽汁淤積和肝癌發(fā)生。相反，細(xì)胞凋亡能引起肝細(xì)胞增生和肝癌的發(fā)生，但是膽汁淤積較少。這種在肝細(xì)胞中的凋亡和壞死的相互關(guān)系在皮膚和腸道等器官也是類似的[42]。進(jìn)一步突出了RIP3介導(dǎo)的程序性壞死對敲除caspase-8小鼠肝細(xì)胞的損傷作用。

在刀豆素A(ConA)誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型中，發(fā)現(xiàn)Nec-1可以保護(hù)ConA誘導(dǎo)的肝炎、降低血清AST和ALT及PARP-1的表達(dá)[43]。另一項研究也報告了類似的結(jié)果，Nec-1不僅降低了ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷，而且提高了肝組織病理學(xué)評分，降低肝酶和炎性細(xì)胞因子，提高小鼠存活率[44]。此外，Nec-1降低RIP1、TNF-α、干擾素γ、白細(xì)胞介素2與白細(xì)胞介素6的表達(dá)。 在用Nec-1治療膿毒癥小鼠時，研究發(fā)現(xiàn)Nec-1會加重肝細(xì)胞的損傷。Nec-1可改變肝糖原成分，增加血清肝損傷標(biāo)志物、炎性細(xì)胞因子和caspase-3的活性。在大鼠創(chuàng)傷失血性休克/再灌注肝損傷中，Nec-1的應(yīng)用可改善肝功能，減輕肝臟損傷程度，同時減少炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)作用。牛痘病毒誘導(dǎo)被感染的小鼠肝臟中形成RIP1/RIP3復(fù)合物[45]，表明程序性壞死是抗病毒反應(yīng)的一部分。另有研究表明[46]，褪黑素能夠通過抑制程序性壞死相關(guān)的炎癥反應(yīng)來減少大鼠的肝臟纖維化。

在藥物性肝損傷的動物模型和病人肝臟活檢標(biāo)本中[47]，RIP3在T357和S358位點磷酸化MLKL，磷酸化的MLKL從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到血漿和細(xì)胞膜，直接破壞了細(xì)胞膜的完整性，提示磷酸化的MLKL可能是程序性壞死的潛在標(biāo)記[47]。

七、展望

隨著對程序性壞死研究的不斷深入，逐步發(fā)現(xiàn)程序性壞死作為一種可調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡，在許多肝臟疾病模型中都起著重要作用，這為尋找肝臟相關(guān)疾病的藥物治療靶點提供了新的研究思路和方向。因此，程序性壞死機(jī)制的深入研究對肝臟疾病的治療和新藥開發(fā)具有非常重要的意義。雖然近年來，研究相關(guān)調(diào)控機(jī)制及信號通路取得了一些進(jìn)展，但仍有許多問題有待進(jìn)一步研究。相信隨著程序性壞死研究的不斷深入，必然對壞死的調(diào)控干預(yù)、肝臟疾病的靶向治療及新藥物的研發(fā)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

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221000 江蘇徐州，徐州醫(yī)學(xué)院研究生院(謝偉)；徐州醫(yī)學(xué)院附屬淮海醫(yī)院普外科(李璽、張召輝)

李璽，Email：Lixi1949@yeah.net

R657.3

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2016.01.018

2015-11-18)