鴨坦布蘇病毒病研究進展

黃　健莊育彬黃秀玉魯　瑩溫亞萍王全溪*（.福建農(nóng)林大學動物科學學院　福州　35000；.福建省晉江市農(nóng)業(yè)局　福建晉江　35058）

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鴨坦布蘇病毒病研究進展

黃健1莊育彬1黃秀玉1魯瑩1溫亞萍2王全溪1*
（1.福建農(nóng)林大學動物科學學院福州350002；2.福建省晉江市農(nóng)業(yè)局福建晉江350582）

摘要鴨坦布蘇病毒病（Duck tembusu virus disease）自2010年暴發(fā)以來，眾多科研工作者對于該病毒的病原學、病理學、致病機理、防治措施等方面進行研究，并取得豐碩的成果。本文針對鴨坦布蘇病毒病的病原學、病理學、致病機理、防治措施等方面進行綜述。

關(guān)鍵詞鴨坦布蘇病毒病病原學病理學致病機理

Advance of duck tembusu virus disease

Huang Jian1Zhuang Yubin1Huang Xiuyu1Lu Yin1Wen Yaping2Wang Quanxi1*
（1.College of animal science, Fujian agriculture and forestry university, Fuzhou 350002; 2.Agricultural bureau of Jinjiang city, Fujian province 350582）

Abstract Since 2010 Duck tembusu virus disease outbreaked, many research of the viral etiology, pathology, pathogenesis, prevent measures have been carried on and got fruitful achievement.This article aimed at the virus etiology, pathology, pathogenesis, prevention measures and so on.

Key words Duck tembusu virus disease virus etiology pathology pathogenesis

2010年6月至10月，福建、山東、浙江、上海、江蘇等主要蛋鴨產(chǎn)區(qū)陸續(xù)暴發(fā)一種急性傳染病，其主要臨床癥狀為蛋鴨、種鴨產(chǎn)蛋驟然大幅下降，剖檢病變以出血性卵巢炎為主。該病造成約數(shù)億羽蛋鴨和千萬羽肉鴨發(fā)病，經(jīng)濟損失達數(shù)十億元，造成了較為嚴重的后果。根據(jù)主要病變和臨床特點，曹貞貞等將該病命名為出血性卵巢炎[1]。但是隨著病原學研究的深入，該病最終被確診是由一種新型黃病毒-鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus, DTMUV）感染引起。現(xiàn)對DTMUV的病原學、病理學、檢測方法等最新研究進展進行綜述。

1　病原學

黃病毒科含黃病毒屬（Flavivirus）、瘟病毒屬（Petivirus）和丙型肝炎病毒屬（Hepacivirus）3個病毒屬，共有60余種病毒，傳播媒介主要是節(jié)肢動物（蚊、蜱、白蛉等），或節(jié)肢動物為病毒的儲存宿主，但可以通過昆蟲叮咬傳染從而引起自然疫源性疾病。

坦布蘇病毒形態(tài)上呈小球形，直徑約為50 nm，為包囊膜的單股正鏈RNA病毒，并且膜內(nèi)有20面對稱的核衣殼蛋白?；蚪M約為11 kb，編碼3 425個氨基酸的殘基的多聚蛋白前體（polyprotein），依次為5'-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4ANS4B-NS5-3'。其5'端非編碼區(qū)長度為90～100個核苷酸，有帽子結(jié)構(gòu)；其3'端非編碼區(qū)長度為550～ 650個核苷酸，無poly(A)尾[2]。其中，E蛋白是主要的膜蛋白，是受體識別功能抗原決定蛋白。因此，E蛋白是作為疫苗和藥物研發(fā)的靶蛋白。

2　病理學研究進展

DTMUV感染造成蛋鴨全身多器官的病理學損傷，其中最主要的特征性病理變化是卵泡膜充血、出血；大量卵泡變性、壞死。同時伴有嚴重的內(nèi)臟病理損傷，其中肺臟、肝臟淤血，肺臟內(nèi)有大量細胞滲出；肝腫大、壞死，肝細胞出現(xiàn)嚴重的脂肪性變性，切片可見空泡狀，紅細胞溶血，伴有淋巴細胞滲出和增生；可能有腦膜充血、水腫，部分有炎性細胞浸潤；脾臟腫大；腎小管上皮細胞腫脹；胰腺表面出現(xiàn)凝固性壞死灶[3]。

坦布蘇病毒對于雛鴨的致病性研究試驗中，李寧等[4]對1周齡櫻桃谷雛鴨肌肉接種坦布蘇病毒FX2010株，發(fā)現(xiàn)攻毒后第3 d，雛鴨出現(xiàn)食欲下降、排黃白色稀糞；第5 d則出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，出現(xiàn)部分雛鴨急性死亡現(xiàn)象，其死亡率高達22.5%（9/40）。病理剖檢病變?yōu)樾膬?nèi)膜出血，脾腫脹、壞死，肝、腎變性壞死，腦膜充血。肝、腎實質(zhì)細胞變性、壞死，間質(zhì)炎性細胞浸潤或見出血；脾臟淋巴細胞局灶性壞死并伴有大量異嗜性細胞；大腦出現(xiàn)典型的病毒性腦炎變化。雛鴨感染后第1 d，各個器官能檢測到病毒的存在，第3 d時，除了脾臟外其他器官病毒含量均達到峰值，后逐漸下降。攻毒后第5 d，雛鴨血清中出現(xiàn)微弱的中和抗體，然后逐漸升高，第17 d達到峰值。該試驗發(fā)現(xiàn)，鴨坦布蘇病毒感染雛鴨后能迅速侵入機體的各個器官并大量復制，病毒呈現(xiàn)組織泛嗜性特征，并能造成全身各個器官的組織損傷，甚至導致雛鴨由于急性敗血癥而死亡。

哺乳動物血液生化指標的動態(tài)變化能間接反應機體心臟、肝臟、腎臟等器官相應的生理狀態(tài)，對于評判器官或者組織收到病毒侵害程度具有指導意義。為此，王友令等[5]將200羽1 d齡雛鴨隨機分為2組，150羽攻毒試驗組、50羽對照組。按100ELD50劑量進行攻毒，7 d內(nèi)每日秤取體重并采血分離血清，進行生化指標檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攻毒3 d后攻毒組體重與對照組存在顯著差異（P＜0.01），攻毒組谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（GGT）、膽堿酯酶（CHE）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酐（Cre）、尿酸（UA）等各指標在不同時間段與對照組存在極顯著差異（P＜0.01）。該研究對TMUV毒株感染雛鴨1～7 d內(nèi)血清酶、血糖和血脂等多項指標進行了測定，其中ALT和AST是目前臨床應用最廣的實驗室檢測肝臟功能的指標。雛鴨接種感染TMUV后，攻毒組ALT/AST含量較對照組升高；ALT在3～4 d內(nèi)與對照組差異極顯著；AST在2～4 d內(nèi)與對照組差異極顯著；CHE和GGT的活性在接種后2～4 d與對照組比較升高。說明病毒感染導致雛鴨肝細胞受到嚴重破壞，出現(xiàn)大量死亡的肝細胞。同時，攻毒組雛鴨膽堿酯酶較對照組升高，2～4 d內(nèi)與對照組差異顯著。而在攻毒后3 d，攻毒組甘油三脂均高于對照組，該結(jié)果表明雛鴨膽堿酯酶的升高與肝脂質(zhì)代謝異常有關(guān)。接種后2 d，攻毒組GGT活性均較對照組有極顯著升高，進一步表明該病發(fā)病急、對肝臟損傷嚴重的特征。血清中LDH和CK活性升高是作為鑒定機體肌肉和心肌變性或壞死性損傷的生化指標。該試驗中，攻毒后攻毒組乳酸脫氫酶的含量較對照組明顯升高，2～4 d內(nèi)與對照組差異極顯著，5～7 d時攻毒組與對照組差異顯著。攻毒后2～5 d內(nèi)，攻毒組肌酸激酶的含量也高于對照組，但無顯著差異。攻毒后攻毒組肌酐的含量較對照組無顯著差異，表明雛鴨的心肌受到一定程度的損傷。尿酸是禽類蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)的分解代謝產(chǎn)物，影響血清尿酸水平的因素較多。攻毒后3～6 d內(nèi)，攻毒組血清尿酸的濃度較對照組明顯升高，表明腎小管功能收到一定程度的損傷。綜上所述，感染坦布蘇病毒的患鴨出現(xiàn)機體生長的嚴重抑制，并對肝臟、腎臟、心臟等器官造成嚴重損傷，機體代謝機能紊亂。因此，坦布蘇病毒對于鴨本身造成的損害是毀滅性的，無論是對機體還是生產(chǎn)性能都會有大的影響。

3　檢測方法研究進展

3.1分子生物學檢測方法王楠楠等針對坦布蘇病毒E基因設計了一對特異性引物，用PCR擴增E基因后將其連接到pMD19-T載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒。隨后把重組質(zhì)粒經(jīng)過PCR及測序，作為陽性模版繪制了SYBR Green I熒光定量PCR標準曲線，并進行特異性、敏感性和重復性試驗。試驗發(fā)現(xiàn)繪制的SYBR Green I絕對熒光定量RT-PCR標準曲線的線性關(guān)系顯著(r2＞0.999),平均試驗間變異系數(shù)為0.26%，檢測敏感性達到2×1010copises/μL，是常規(guī)RT-PCR的1 000倍[6]。應用試驗中，通過該方法對人工感染坦布蘇病毒的鴨組織進行檢測，在36份病料組織中35份為陽性，檢出率可達97%。其建立的坦布蘇病毒SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法相比于常規(guī)PCR，具有更快捷、更敏感、更準確的特點，對于坦布蘇病毒的臨床檢測具有重要的意義。

曾婷婷等通過2種病毒的保守序列，設計2種不同的引物和探針，并且分別標記熒光猝滅基因，建立雙重實時熒光定量RT-PCR方法。臨床試驗檢測到7份TMUV陽性樣品（包括6份產(chǎn)蛋鴨和1份雛鴨），與隨后的病毒分離結(jié)果一致。檢測程序包括采集、研磨、抽提核酸、反轉(zhuǎn)錄和PCR反應，需3～3.5 h。反應結(jié)束，可直接讀取結(jié)果和計算出病料的病毒含量[7]。該檢測方法特異、敏感、快速，在TMUV臨床檢測中具有重要意義，促進了其實用性能。

張偉等通過DTMUV E基因保守區(qū)域設計了6條引物，建立了DTMUV環(huán)介導等溫擴增（LAMP）檢測體系，并應用熒光顯色劑（SYBR Green I和鈣黃綠素、錳離子）對擴增產(chǎn)物進行可視化判定。試驗結(jié)果顯示，以SYBR Green I為染料，顯色敏感性為10 copises/μL的病毒，比普通PCR高100倍；以鈣黃綠素和錳離子組合作為顯色劑，其顯色極限為1 000 copises/μL的病毒，雖低于SYBR Green I的顯色敏感性，但是能有效避免氣溶膠造成的空氣污染，保證了陽性樣品的檢出率[8]。DTMUV LAMP檢測方法對試驗儀器、設備的要求不高，而且既快速又簡便，加之配合使用鈣黃綠素顯色劑使之能適合在基層實驗室、獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場使用，具有很高的實用意義。

3.2血清學

3.2.1乳膠凝集試驗乳膠凝集試驗具有簡單、快速的特點，對于基層養(yǎng)殖場快速診斷具有指導意義。施少華等在鴨坦布蘇病毒乳膠凝集試驗中，以制備好的鴨坦布蘇病毒單克隆抗體致敏乳膠檢測鴨坦布蘇病毒抗原，試驗采用300 μg最佳致敏抗體量、3 h作為最近致敏時間、37℃作為最佳致敏溫度，以乳膠凝集試驗和RT-PCR對73份自然感染的病料進行了檢測，其中陽性結(jié)果分別為27份、31份，兩者的陽性符合率達到87.1%[9]。王全溪等也分離并鑒定了鴨坦布蘇病毒LH株，并以純化的病毒致敏乳膠，用于檢測鴨坦布蘇病毒抗體。由于至今仍然沒有可靠的疫苗生產(chǎn)，抗體的檢測對該病的診斷具有重要的意義。

3.2.2間接ELISAS姬希文等為了快速檢測鴨坦布蘇病毒，利用純化的病毒奉賢株（FX2010）作為包被抗原，并確定1.675 μg/L孔作為最適包被濃度，在最佳包被條件下37℃放置2 h后，4℃下過夜，血清的最佳稀釋度為1：200，酶標抗體最適稀釋度為1：2 000優(yōu)化條件下反應。使用該方法對140份疑似鴨坦布蘇病毒病血清樣品進行檢測后，有108份表現(xiàn)為陽性，表明該試驗具有高敏感性、特異性的特點，為基層實驗室、獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場診斷鴨坦布蘇病毒病提供了新的一種方法[10]。

4　致病機理研究

坦布蘇病毒的宿主是除了番鴨以外的所有品種的產(chǎn)蛋鴨（如紹興鴨、縉云麻鴨、山麻鴨、金定鴨、康貝爾鴨、臺灣白改鴨）、肉種鴨（如櫻桃谷鴨和北京鴨），并且包括肉鴨及野鴨[6]等。而且對于產(chǎn)蛋雞[11]、鵝[3]也能感染。

鴨坦布蘇病毒病發(fā)病突然、傳播迅速。感染蛋鴨、種鴨主要表現(xiàn)為采食量突然大幅下降，并引起產(chǎn)蛋量大幅下降，由高峰期的90%～95%下降至5%～10%。發(fā)病率高達100%，死淘率5%～15%，繼發(fā)感染時死淘率可達30%。臨床表現(xiàn)為體溫升高，排出綠色的稀糞。早期患鴨一般不表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀，后期則出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀，癱瘓、行走不穩(wěn)、共濟失調(diào)為主要的特征。感染病毒后，種蛋的受精率降低10%左右，并且會在1～1.5月的病程結(jié)束后自行恢復。發(fā)病后15～20 d采食量開始恢復，綠色的糞便逐漸減少，產(chǎn)蛋率緩慢恢復，呈現(xiàn)上升趨勢。體質(zhì)較好的鴨體況可恢復至未感染之前。

商品肉鴨和育成期的種鴨總在20日齡前發(fā)病，以神經(jīng)癥狀為主，表現(xiàn)站立不穩(wěn)、倒地不起、行走不穩(wěn)，有食欲、飲欲，飲欲較為明顯加大，而采食則出現(xiàn)困難并最終導致死亡，死淘率10%～30%。

患鴨的特征性剖檢病變出現(xiàn)在卵巢，表現(xiàn)為嚴重的出血、萎縮、破裂，并在卵泡膜上出現(xiàn)充血、出血，同時大量卵泡處在變性、壞死或液化的階段，較為嚴重的甚至可以造成卵黃破裂、卵黃液進入腹腔形成卵黃性腹膜炎。輸卵管有黏液性滲出。并且有部分病例出現(xiàn)肝臟腫大、淤血，針尖狀白色點狀壞死。外觀蒼白，有白色條紋狀壞死的心臟。剖檢出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的患鴨時，則能發(fā)現(xiàn)腦膜出血，組織水腫，呈彌散樣、分支狀出血。

5　防治措施

李振華等制備DTMUV滅活油乳苗，對10日齡雛鴨分別注射PBS（作為對照）及0.2 mL、0.5 mL和0.8 mL疫苗，免疫28 d后進行攻毒試驗。結(jié)果顯示，0.5 mL組抗體水平及T淋巴細胞數(shù)量與對照組相比差異均極顯著（P＜0.01），0.2 mL組免疫攻毒保護率80%，0.5 mL和0.8 mL組免疫攻毒保護率均為100%，而PBS對照組均表現(xiàn)為典型的DTMUV癥狀，且3羽死亡[12]。

6　展　望

自2010年鴨坦布蘇病毒病暴發(fā)以來，科研工作者們對于該病病毒的研究也逐漸深入，對于病原學、病理學、流行病學等各個方面的研究均取得較大的進展。下一步，對于鴨坦布蘇病毒的研究將著重于致病機理的深入研究及疫苗的研究。

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*通信作者：王全溪，男，副教授。E-mail:wqx608@126.com。

基金項目：福建省大學生創(chuàng)新性項目（201510389093）資助。

文獻標識碼：A

文章編號：1003-4331（2016）01-0014-04