大豆DNA導(dǎo)入春小麥后的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀分析及RAPD標(biāo)記驗證

賈影影，劉鳳樓，王掌軍，劉生祥，陳麗萍，郭麗靜

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

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大豆DNA導(dǎo)入春小麥后的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀分析及RAPD標(biāo)記驗證

賈影影，劉鳳樓，王掌軍，劉生祥，陳麗萍，郭麗靜

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

為探討大豆DNA導(dǎo)入對春小麥農(nóng)藝和品質(zhì)性狀的影響，在2012-2014年間，對寧春4號、寧春44號、高代品系J058號及其通過花粉管通道法分別導(dǎo)入大豆品種鐵豐31號、承豆6號、汾豆78號和鐵9808號基因組DNA的后代株系進行了籽粒蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和沉降值及株高、穗長、穗粒數(shù)、穗粒重和千粒重等農(nóng)藝性狀分析，并利用RAPD標(biāo)記對導(dǎo)入系進行了驗證。結(jié)果表明，大豆基因組DNA導(dǎo)入系的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀與導(dǎo)入受體相比發(fā)生了明顯的變化。以寧春4號為受體、鐵9808號為供體的導(dǎo)入系019的經(jīng)濟系數(shù)和千粒重分別高出親本14.33%和14.84%，且與受體差異顯著。以寧春4號為受體、承豆6號為供體的導(dǎo)入系013在2012年所有導(dǎo)入系中蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值均最大，兩年試驗的多重比較結(jié)果中僅導(dǎo)入系013的蛋白質(zhì)含量與親本寧春4號間差異顯著，且較親本高出13.33%。18個RAPD引物中有3個引物擴增出清晰帶型，在受體小麥和供體大豆親本間存在多態(tài)性，且部分導(dǎo)入系出現(xiàn)供體條帶，如導(dǎo)入系013、015、019和020。試驗最終獲得了農(nóng)藝性狀優(yōu)良、蛋白質(zhì)含量增高的導(dǎo)入系013作為后續(xù)研究的重點。

春小麥；大豆；花粉管通道法；農(nóng)藝性狀；品質(zhì)分析；RAPD標(biāo)記

小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一，同時也是我國重要的商品糧和儲備糧。目前，我國大面積種植的小麥品種的面粉加工品質(zhì)偏低，多數(shù)品種均達不到國外優(yōu)質(zhì)小麥分級標(biāo)準(zhǔn)[1]。因此，通過引入外源基因創(chuàng)制小麥品質(zhì)育種中可利用的種質(zhì)或中間材料是提升小麥品質(zhì)的有效途徑之一。

大量研究和實踐表明[2-7]，通過花粉管通道法可以成功的將外源物種的DNA導(dǎo)入小麥中，并獲得理想的變異材料，實現(xiàn)了對受體植株的遺傳改良，獲得了新種質(zhì)或新品系、品種。張 立等[8]利用花粉管通道法將豌豆DNA導(dǎo)入小麥并對其后代進行分子驗證，結(jié)果證明利用花粉管通道法提高小麥蛋白質(zhì)含量是可行的。王秀玲等[9]將野生大豆總DNA導(dǎo)入小麥中，獲得了轉(zhuǎn)基因小麥品系。劉 萍等[10]將燕麥總DNA導(dǎo)入普通小麥寧春4號中，獲得了12個穩(wěn)定的變異品系，并對穩(wěn)定變異的品系進行了RAPD標(biāo)記驗證，從分子水平上證明了燕麥DNA可以通過花粉管通道進入受體小麥，并與受體基因組DNA整合，在后代中遺傳和表達。歐巧明等[6]利用花粉管通道法導(dǎo)入高粱DNA創(chuàng)造了2個均含有7+8、5+10優(yōu)質(zhì)亞基的穩(wěn)定優(yōu)良小麥變異新品系，其HMW-GS發(fā)生明顯變異，與受體小麥相比，變異新品系的品質(zhì)指標(biāo)得到了提升。

目前，雖然大豆DNA導(dǎo)入小麥已有研究，但對大豆DNA導(dǎo)入春小麥并對導(dǎo)入材料進行多年對比分析的探索鮮有報道。鑒于此，本研究在2012-2014年間，對寧春4號、寧春44號、高代品系J058號及其通過花粉管通道法分別在以上3份材料中導(dǎo)入大豆品種鐵豐31號、承豆6號、汾豆78號和鐵9808號基因組DNA的后代株系進行籽粒蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值等品質(zhì)性狀及株高、穗長、穗粒數(shù)、穗粒重和千粒重等農(nóng)藝性狀分析，并利用RAPD標(biāo)記對品質(zhì)及農(nóng)藝性狀表現(xiàn)較好的導(dǎo)入系進行驗證，以期獲得表現(xiàn)優(yōu)良的導(dǎo)入后代株系，為小麥高產(chǎn)及品質(zhì)育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料及其種植

供試材料包括普通小麥品種寧春4號、寧春44號、高代品系J058號以及分別以寧春4號、寧春44號、J058號為受體通過花粉管通道法導(dǎo)入大豆品種鐵豐31號、承豆6號、汾豆78號和鐵9808號基因組總DNA的35個后代株系(經(jīng)過5年連續(xù)選擇，性狀已基本穩(wěn)定)(表1)，均由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種實驗室小麥育種組提供。

表1 大豆DNA導(dǎo)入春小麥的35個株系

所有供試材料于2012-2014年3月4日至3月7日種植于寧夏中部黃河沖積平原永寧縣內(nèi)的寧夏大學(xué)實驗農(nóng)場內(nèi)，全生育期灌水3次。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，6行區(qū)，行長1.20 m，行間距0.15 m，區(qū)間距0.30 m，人工開溝撒播。按照大田常規(guī)栽培管理措施進行管理。

1.2 農(nóng)藝性狀的測定

隨機選取2013年和2014年種植的長勢一致的供試材料各15株，在成熟期收獲并晾曬風(fēng)干后進行室內(nèi)考種，分別測定各單株的株高、穗長、穗下莖節(jié)長、穗粒數(shù)、穗粒重、千粒重、經(jīng)濟產(chǎn)量(植株脫粒后的籽粒重量)和生物產(chǎn)量(收獲后未脫粒前的植株重量)，取平均值。同時，計算經(jīng)濟系數(shù)。經(jīng)濟系數(shù)=經(jīng)濟產(chǎn)量/生物產(chǎn)量。

1.3 品質(zhì)性狀的測定

隨機稱取從2012年和2013年收獲的各受體親本及農(nóng)藝性狀表現(xiàn)較好的12個導(dǎo)入系(007、013、015、019、020、024、025、028、033、035、037和045)的種子樣品各3份，利用瑞典波通9200整粒谷物近紅外分析儀(寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所)測定蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量及沉降值，取平均值。

1.4 RAPD標(biāo)記分析

RAPD標(biāo)記分析所用材料同1.3。18條隨機引物(表2)均由上海生工生物工程公司合成。采用SDS法提取3個受體小麥、4個供體大豆及相應(yīng)導(dǎo)入系材料葉片的全基因組DNA。RAPD擴增體系(10 μL)：10× PCR緩沖液1.0 μL，Mg2+(25 mmol·L-1) 0.6 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1) 0.4 μL，引物(30 ng·μL-1)2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.1 μL，ddH2O 3.9 μL，模板DNA(15 ng·μL-1)2.0 μL。按照以上擴增體系將PCR反應(yīng)液配制好后混勻，用10 μL的石蠟油覆蓋，在PCR儀中進行擴增。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，37～55 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s，45個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，每個體系中加1.5 μL的溴酚藍混勻，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段的多態(tài)性，試驗重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 19.0軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及其導(dǎo)入系的農(nóng)藝性狀

對親本及導(dǎo)入系材料連續(xù)兩年(2013、2014)農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果(表3)分析表明，寧春4號導(dǎo)入系除穗長和穗下莖節(jié)長外其他農(nóng)藝性狀的最大值均顯著高于親本，其中，導(dǎo)入系015的株高高出親本2.72%，導(dǎo)入系013的穗粒數(shù)多出親本11.21%，導(dǎo)入系019的穗粒重、經(jīng)濟系數(shù)和千粒重分別較親本高出14.43%、14.33%和14.84%。且寧春4號的導(dǎo)入系穗粒重的變異系數(shù)最大，為21.45%；穗下莖節(jié)長的變異系數(shù)最小，為6.48%；其他性狀的變異系數(shù)均在6.48%～14.22%之間。J058號的導(dǎo)入系除穗下莖節(jié)長外其他農(nóng)藝性狀的最大值均顯著高于親本，其中導(dǎo)入系020的株高和穗粒數(shù)分別較親本高4.91%和23.11%，導(dǎo)入系028的經(jīng)濟系數(shù)和千粒重分別較親本高7.72%和8.44%。J058號導(dǎo)入系穗粒重的變異系數(shù)最大，為23.56%；穗下莖節(jié)長的變異系數(shù)最小，為7.22%；其他性狀的變異系數(shù)均在7.25%～17.93%之間。寧春44號導(dǎo)入系除千粒重外其他農(nóng)藝性狀的最大值均顯著高于親本，且穗長、穗下莖節(jié)長的最小值也顯著高于親本，其中，導(dǎo)入系033的株高和千粒重分別比親本高6.91%和1.03%，導(dǎo)入系035的穗長、穗下莖節(jié)長和穗粒數(shù)較親本分別高12.51%、4.22%和10.54%，導(dǎo)入系045的穗粒重和經(jīng)濟系數(shù)分別較親本高7.31%和7.11%。寧春44號導(dǎo)入系穗粒重的變異系數(shù)最大，為20.88%；千粒重的變異系數(shù)最小，為5.30%；其他性狀的變異系數(shù)均在5.52%～16.79%之間。結(jié)果表明，導(dǎo)入系019、028和045的產(chǎn)量性狀均比較突出，但導(dǎo)入系019有利變異更為明顯。

表2 18條隨機引物序列信息

表3 親本及其導(dǎo)入系的農(nóng)藝性狀比較

數(shù)字后不同字母表示親本及相對應(yīng)的導(dǎo)入系間差異在0.05水平上顯著；試驗中各個親本及相對應(yīng)的導(dǎo)入系均參與了多重比較，但表中僅列出了親本及相對應(yīng)的導(dǎo)入系中最大值和最小值的多重比較結(jié)果。

The different letters following data indicate significant difference between the parents and corresponding introgression lines at 0.05 level; Multiple comparisons were done between the parents and corresponding introgression lines,but only the data for parents,the maximum and minimum value of the lines are shown in the table.

2.2 親本及其導(dǎo)入系的品質(zhì)性狀

親本及導(dǎo)入系材料連續(xù)兩年(2012、2013)的品質(zhì)性狀分析結(jié)果顯示，各導(dǎo)入系的品質(zhì)性狀也發(fā)生了改變。以寧春4號為受體的材料中，導(dǎo)入系013、015蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量及沉降值均高于親本(圖1A、圖1B、圖1C)，其中品質(zhì)性狀表現(xiàn)比較突出的導(dǎo)入系013的各品質(zhì)指標(biāo)在2012年比親本均高出20%。由于2012年材料中親本J058號數(shù)據(jù)的缺失，僅分析了2013年J058號及其導(dǎo)入系的品質(zhì)數(shù)據(jù)。導(dǎo)入材料中濕面筋含量均高于親本(圖1B)，蛋白質(zhì)含量和沉降值除導(dǎo)入系020外也均高于親本(圖1A、圖1C)，其中品質(zhì)性狀較為突出的導(dǎo)入系028的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和沉降值分別比親本高出 7.54%、26.81%和17.91%。以寧春44號為受體的材料中，導(dǎo)入系的沉降值均高于親本(圖1C)，蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量除了導(dǎo)入系035外均高于親本(圖1A、圖1B)，其中性狀表現(xiàn)突出的導(dǎo)入系033蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和沉降值在2012年分別較親本高出3.01%、13.11%和23.61%。

在2012和2013年，導(dǎo)入系013蛋白質(zhì)含量均最高，且與親本寧春4號差異顯著，較親本平均高出13.33%(圖1D)；導(dǎo)入系025和013濕面筋含量比其他材料高，且與親本J058號和寧春4號差異顯著，分別較親本高出27.13%和16.44%(圖1E)；各導(dǎo)入系的沉降值與對應(yīng)親本間差異均不顯著(圖1F)。綜合來看，導(dǎo)入系013的品質(zhì)性狀最佳。

A：2012和2013年親本及其導(dǎo)入系蛋白質(zhì)含量的變化；B：2012和2013年親本及其導(dǎo)入系濕面筋含量的變化；C：2012和2013年親本及其導(dǎo)入系沉降值的變化；D：親本及其導(dǎo)入系蛋白質(zhì)含量的比較；E：親本及其導(dǎo)入系濕面筋含量的比較；F：親本及其導(dǎo)入系沉降值的比較；1：寧春4號；2：007；3：013；4：015；5：019；6：J058號；7：020；8：024；9：025；10：028；11：寧春44號；12：033；13：035；14：037；15：045；2012年007與J058號數(shù)據(jù)缺失；字母表示親本及相對應(yīng)的導(dǎo)入系間差異在0.05水平上顯著。

A: Variation of protein content of parents and their introgression lines in 2012 and 2013; B: Variation of wet gluten content of parents and their introgression lines in 2012 and 2013; C: Variation of sedimentation value of parents and their introgression lines in 2012 and 2013; D: Comparison on protein content of parents and their introgression lines; E: Comparison on wet gluten content of parents and their introgression lines; F: Comparison on sedimentation value of parents and their introgression lines; 1: Ningchun 4; 2: 007; 3: 013; 4: 015; 5: 019; 6: J058; 7: 020; 8: 024; 9: 025; 10: 028; 11: Ningchun 44; 12: 033; 13: 035; 14: 037; 15: 045; Data of 007 and J058 was missing in 2012; The different letters indicate significant difference between the parents and corresponding introgression lines at 0.05 level.

圖1 2012和2013年親本及其導(dǎo)入系的品質(zhì)性狀分析

Fig.1 Quality analysis of parents and their introgression lines in 2012 and 2013

2.3 RAPD標(biāo)記分析結(jié)果

18條引物對所有供體、受體及12個導(dǎo)入系材料的全基因組DNA進行了RAPD擴增分析，結(jié)果顯示，僅有其中3條引物(S64、S103和S437)對19個樣品的DNA擴增產(chǎn)物帶型出現(xiàn)明顯差異(圖2)，占全部所用引物的16.70%。

擴增結(jié)果中，小麥與大豆的目的條帶均在500～2 000 bp之間，且每條引物的帶型結(jié)果中均表現(xiàn)為3個小麥親本的主帶大小相同或相似，四個大豆供體的主帶大小相同或相似，同時小麥?zhǔn)荏w與大豆供體擴增條帶間均存在明顯差異，3條引物的重復(fù)試驗也顯示出相同的結(jié)果。其中，引物S64在受體親本和導(dǎo)入供體中均擴增出3條條帶，在導(dǎo)入系013中，與親本寧春4號有明顯差異，新增了1條條帶，且與供體大豆DNA條帶明顯不同；導(dǎo)入系045中，只擴增出2條條帶，與親本J058號相比出現(xiàn)條帶消失的現(xiàn)象，其余導(dǎo)入系的條帶均與對應(yīng)親本一致(圖2A)。引物S103是3個引物中表現(xiàn)較好的，能區(qū)別三個小麥親本及導(dǎo)入供體，導(dǎo)入系013與親本寧春4號相比出現(xiàn)了條帶的增加，但導(dǎo)入系015與小麥親本相比又出現(xiàn)了條帶的消失，且均出現(xiàn)了供體條帶，導(dǎo)入系019、020、024、025和028也均出現(xiàn)供體條帶，尤其是導(dǎo)入系036和037與親本J058號及導(dǎo)入供體有明顯差異，與親本相比均出現(xiàn)條帶的消失(圖2B)。引物S437在受體小麥與導(dǎo)入供體中擴增結(jié)果差異明顯，且部分導(dǎo)入系與對應(yīng)親本存在條帶的增加和消失，但大部分導(dǎo)入系的條帶均與受體小麥相一致(圖2C)。說明大豆DNA導(dǎo)入春小麥后導(dǎo)入系發(fā)生了不同程度的變異。

A～C分別代表引物S64、S103和S437的擴增結(jié)果；M：2000 bp DNA ladder；1：寧春4號；2：寧春44號；3：J058號；4：鐵豐31號；5：承豆6號；6：汾豆78；7：鐵9808；8：007；9：013；10：015；11：019；12：020；13：024；14：025；15：028；16：033；17：036；18：037；19：045。

A-C indicate amplication results with primer S64,S103 and S437,respectively; M: 2000 bp DNA ladder ; 1: Ningchun 4; 2: Ningchun 44; 3: J058; 4: Tiefeng 31; 5: Chengdou 6; 6: Fendou 78; 7: Tie 9808; 8: 007; 9: 013; 10: 015; 11: 019; 12: 020; 13: 024; 14: 025; 15: 028; 16: 033; 17: 036; 18: 037; 19: 045.

圖2 3條RAPD引物對大豆、小麥及其導(dǎo)入系的擴增結(jié)果

Fig.2 Amplication results for soybeans,common wheats and their introgression lines with RAPD markers

3 討 論

利用花粉管通道法轉(zhuǎn)移外源DNA已被廣泛應(yīng)用于小麥[8,12-13]、棉花[14-15]和玉米[16-17]等作物。當(dāng)外源DNA導(dǎo)入小麥后，其導(dǎo)入材料的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀都是衡量變異的重要指標(biāo)。由于豆類作物含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白，因此，前人在豆類DNA通過花粉管通道法導(dǎo)入普通小麥的實踐中已經(jīng)積累了一定的經(jīng)驗[8-9]。本研究通過花粉管通道法將大豆基因組DNA導(dǎo)入春小麥中，對小麥親本及其導(dǎo)入系農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的多年對比研究表明，盡管導(dǎo)入系的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀發(fā)生了部分明顯的變異,但大部分性狀都與受體小麥保持一致，這與以往的研究結(jié)果類似[12,18-19]。外源基因?qū)刖哂须p重作用：一是基因轉(zhuǎn)移作用；二是誘變作用[20]。在本研究中，導(dǎo)入系穗長、穗粒數(shù)、穗粒重、經(jīng)濟系數(shù)變化最明顯，另外株高、穗下莖節(jié)長、千粒重等農(nóng)藝性狀也有明顯變異。其中，以寧春4號為受體、鐵9808為供體的導(dǎo)入系019，在連續(xù)兩年的田間試驗中除穗長外其余性狀均表現(xiàn)出與親本寧春4號有差異顯著的變異。除此以外，不同小麥親本中均出現(xiàn)了穗粒數(shù)、穗粒重、經(jīng)濟系數(shù)和千粒重較親本有所提高的導(dǎo)入系，如以寧春4號為親本的導(dǎo)入系013和015；以J058號為親本的020和028，以寧春44為親本的導(dǎo)入系033、035和045。

因大豆含有幾乎全面的營養(yǎng)成分，從而被譽為高效的“生物工廠”[9]，因此本研究選用大豆作為提高小麥品質(zhì)的基因源。試驗中部分導(dǎo)入系連續(xù)兩年的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和沉降值均高于受體親本，如導(dǎo)入系013、015、033和037。其他導(dǎo)入系如020和024在兩年試驗中品質(zhì)性狀均保持上升的趨勢，導(dǎo)入系033、037和045品質(zhì)性狀兩年試驗的結(jié)果均高于寧春44號，數(shù)據(jù)年際變化小。但兩年試驗的多重比較結(jié)果中僅有導(dǎo)入系013的蛋白質(zhì)含量與親本寧春4號間差異顯著，同時其濕面筋含量與寧春4號差異也顯著。除導(dǎo)入系025的濕面筋含量與親本J058號差異顯著外，其他導(dǎo)入系各品質(zhì)性狀與親本間的差異均未達到顯著水平。試驗結(jié)果從側(cè)面反映了品質(zhì)性狀數(shù)據(jù)年際間變化規(guī)律相對一致，但農(nóng)藝性狀因受環(huán)境影響，變化較大。

花粉管通道法導(dǎo)入外源DNA可以通過RAPD分析來驗證[9-10]。本研究所用的RAPD標(biāo)記均為前人利用豆類DNA對小麥進行遺傳轉(zhuǎn)化而設(shè)計的，因此，18個引物中有3個引物可以清晰的區(qū)分供體大豆和受體小麥親本。但由于大豆和小麥親緣關(guān)系較遠，外源基因整合檢測要比親緣關(guān)系較近的燕麥和高粱等困難。前人研究中，導(dǎo)入外源DNA后經(jīng)過RAPD分析得出，導(dǎo)入系既存在條帶的增加和消失，也同樣會出現(xiàn)供體條帶[9,21]。在本研究中，引物S64在導(dǎo)入系013處新增了1條條帶，引物S103在導(dǎo)入系013、015、019、020、024、025和028均出現(xiàn)了供體條帶，說明供體的某些DNA片段可能進入了受體基因組中。導(dǎo)入系013蛋白質(zhì)含量明顯提高且與親本寧春4號差異顯著，兩年平均值較親本高出13.3%。表明導(dǎo)入后代中品質(zhì)性狀發(fā)生了變異并能穩(wěn)定遺傳。但這種蛋白質(zhì)含量增高的變異是否因接受了外源大豆DNA片段，還需要進一步的深入分析。

[1]張 健.轉(zhuǎn) 1Ax1和 1Dx5基因小麥的品質(zhì)及農(nóng)藝性狀分析 [D].武漢:華中科技大學(xué),2012:1-2.

ZHANG J.Analysis of quality traits and agronomic traits of 1Ax1 and 1Dx5 in transgenic wheat [D].Wuhan:Huazhong University of Science and Technology,2012:1-2.

[2]令利軍,倪建福,張正英.花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)及在小麥分子育種中的應(yīng)用 [J].分子植物育種,2000,2(3):407-412.

LING L J,NI J F,ZHANG Z Y.Pollen tube pathway transgenic technique and application in wheat molecular breeding [J].MolecularPlantBreeding,2000,2(3):407-412.

[3]孔 青,豐 震,劉 林,等.外源DNA導(dǎo)入花粉管通道技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用 [J].分子植物育種,2005,3(1):113-116.

KONG Q,FENG Z,LIU L,etal.Application and development of foreign DNA introduction via the pollen-tube pathway [J].MolecularPlantBreeding,2005,3(1):113-116.

[4]SONG M,GU Y H,QIN G Y.Application of a transformation method via the pollen-tube pathway in agriculture molecular breeding [J].LifeScienceJournal,2007,4(1):77-79.

[5]王立新,常麗芳,段紹光,等.通過花粉管通道導(dǎo)入外源DNA創(chuàng)造抗白粉病小麥新品種 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,36(12):1576-1581.

WANG L X,CHANG L F,DUAN S G,etal.Transgenic wheat lines by transferring powdery mildew resistance gene through pollen tube pathway [J].ScientiaAgriculturaSinica,2003,36(12):1576-1581.

[6]歐巧明,崔文娟,王 煒,等.花粉管通道法導(dǎo)入高粱DNA創(chuàng)建優(yōu)良小麥新品系的分子聚合育種 [J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2013,31(2):6-12.

OU Q M,CUI W J,WANG W,etal.Molecule-pyramiding breeding of new improved wheat varieties by introducing sorghum DNA via pollen-tube pathway [J].AgriculturalResearchintheAridAreas,2013,31(2):6-12.

[7]周光宇,龔蓁蓁,王自芬.遠緣雜交的分子基礎(chǔ)-DNA片段雜交假設(shè)的一個論證 [J].遺傳學(xué)報,1979,6(4):405-412.

ZHOU G Y,GONG Z Z,WANG Z F.Exogenous hybrid molecular basis-an argument of DNA hybridization suppose [J].JournalofGeneticsandGenomics,1979,6(4):405-412.

[8]張 立.用花粉管通道法將豌豆DNA導(dǎo)入小麥及其后代的分子驗證 [D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2002:24-25.

ZHANG L.Molecular test of variant wheat after injected pea DNA by pollen tube pathway [D].Tai’an:Shandong Agricultural University,2002:24-25.

[9]王秀玲,盧 茜,劉 君,等.野生大豆DNA導(dǎo)入小麥及RAPD分子驗證 [J].南開大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2003,36(2):37-40.

WANG X L,LU Q,LIU J,etal.Characterization of wheat introduced wild soybean DNA and molecular identify by RAPD [J].ActaScientiarumNaturaliumUniversitatisNankaiensis(ScienceEdition),2003,36(2):37-40.

[10]劉 萍,康振生.燕麥DNA導(dǎo)入普通小麥變異觀察及RAPD分子驗證 [J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2006,24(3):100-102.

LIU P,KANG Z S.Oat(AvenasativaL.) exogenous DNA introduction into common wheat and RAPD analysis [J].AgriculturalResearchintheAridAreas,2006,24(3):100-102.

[11]焦 湞,谷運紅,李景原,等.離子束介導(dǎo)大豆DNA轉(zhuǎn)化小麥后代高蛋白株的RAPD標(biāo)記分析 [J].西北植物學(xué)報,2006,26(9):1878-1882.

JIAO Z,GU Y H,LI J Y,etal.RAPD marker analysis of high-protein offspring plants of wheat transformed with soybean DNA through particle beam mediation [J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2006,2626(9):1878-1882.

[12]倪建福,令利軍,歐巧明,等.外源DNA導(dǎo)入小麥的分子育種實踐 [J].麥類作物學(xué)報,2005,25(5):27-31.

NI J F,LING L J,OU Q M,etal.Molecular breeding by introducing exogenous DNA into wheat [J].JournalofTriticeaeCrops,2005,25(5):27-31.

[13]倪建福,周文麟,王亞馥.高粱DNA導(dǎo)入小麥選育出抗條銹白粒新品系 [J].蘭州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),1994,30(增刊):144-147.

NI J F,ZHOU W L,WANG Y F.Selection of a new white wheat line with sripe rust resistance by introducing sorghum DNA[J].JournalofLanzhouUniversity(NaturalSciences),1994,30(S):144-147.

[14]王志才,廖茂森,木合熱皮亞·艾爾肯,等.鹽穗木耐鹽基因通過花粉管通道法對棉花遺傳轉(zhuǎn)化的研究 [J].分子植物育種,2011,9(2):180-184.

WANG Z C,LIAO M S,AIERKEN M,etal.Study on pollen-tube pathway mediated cotton(Gossypiumhirsutum) transformation with salt-tolerant gene fromHalostachyscaspica[J].MolecularPlantBreeding,2011,9(2):180-184.

[15]王志才,張富春.外源基因轉(zhuǎn)化棉花育種研究的進展與應(yīng)用 [J].生物技術(shù)通報,2011(2):12-17.

WANG Z C,ZHANG F C.Advances and application of transgenic technology in cotton breeding [J].BiotechnologyBulletin,2011(2):12-17.

[16]周旭梅,高旭東,何 晶.利用花粉管通道法將外源DNA導(dǎo)入玉米的研究進展 [J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(1):36-38.

ZHOU X M,GAO X D,HE J.Research advance on exogenous DNA introduced into maize by pollen-tube pathway [J].LiaoningAgriculturalSciences,2008(1):36-38.

[17]董春林,張明義,林忠平,等.用花粉管通道法將抗旱耐鹽基因?qū)胗衩鬃越幌档难芯?[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(5):392-394.

DONG C L,ZHANG M Y,LIN Z P,etal.Study on transferring gene of salt tolerance and drought resistance into corn inbred line by pollen tube path [J].JournalofShanxiAgriculturalSciences,2011,39(5):392-394.

[18]歐巧明,倪建福,張正英,等.長穗偃麥草DNA導(dǎo)入引起的冬小麥后代性狀變異及其遺傳研究 [J].麥類作物學(xué)報,2005,25(5):18-22.

OU Q M,NI J F,ZHANG Z Y,etal.Variation in winter wheat characters arising from incorporation ofE.elongataDNA and their genetic analysis [J].JournalofTriticeaeCrops,2005,25(5):18-22.

[19]LI Z,NELSON R L,WIDHOLM J M,etal.Soybean transformation via the pollen tube pathway [J].SoybeanGeneticsNewsletter,2002,29:1-11.

[20]萬文舉,鄒東生,彭克勤.論生物誘變-外源DNA導(dǎo)入的雙重作用 [J].湖南農(nóng)學(xué)院學(xué)報,1992,18(4):886-891.

WAN W J,ZOU D S,PENG K Q.On biomutagen-induced mutation-double function of exogenous DNA interoduction [J].JournalofHunanAgriculturalCollege,1992,18(4):886-891.

[21]裴新梧,崔凱榮,孔英珍,等.導(dǎo)入高粱DNA選育豐產(chǎn)、抗逆小麥新品系及其RAPD分子驗證 [J].蘭州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),1999,35(2):130-134.

PEI X W,CUI K R,KONG Y Z,etal.Selection and RAPD identification of a new wheat line with high yield and stress resistance by introducing sorghum DNA [J].JournalofLanzhouUniversity(NaturalSciences),1999,35(2):130-134.

Study on Agronomic and Quality Traits and RAPD Marker Analysis of Transgenic Spring Wheat with Soybean DNA

JIA Yingying,LIU Fenglou,WANG Zhangjun,LIU Shengxiang,CHEN Liping,GUO Lijing

(School of Agriculture,Ningxia University,Yinchuan,Ningxia 750021,China)

For a better understanding of common wheat quality breeding,three spring wheat varieties/lines,Ningchun 4,Ningchun 44,and J058,and their introgression lines created by pollen-tube pathway using genomic DNA of soybean varieties Tiefeng 31,Chengdou 6,Fendou 78 and Tie 9808,respectively,were used.Quality traits,such as protein content,wet gluten content and sedimentation were analyzed and plant height,spike length,thousand-kernel weight,grains per spike and other agronomic traits were also investigated after harvest at the mature period during 2012-2014.Besides,RAPD marker analysis was conducted.The results showed that related agronomic traits and quality traits of introgression lines had changed in comparison with parents.The economic coefficient and the thousand-kernel weight of introgression line 019 were significantly higher than those of the parent Ningchun 4 with an increase rate of 14.33% and 14.84%,respectively.In 2012,quality traits of introgression line 013 were reached highest level in all tested lines.Multiple comparison results revealed that only the protein content of introgression line 013 reached significant level,with the increase rate of 13.33%,compared to the parent Ningchun 4.Eighteen random primers were employed to amplify genomic DNA of the donor soybeans and the receptor wheat materials as well as their introgression lines.Of them,three RAPD markers gave clear bands to separate the soybeans from wheat evidently.Polymorphic bands were detected between wheat parents and soybeans as well as part of introgression lines which had donor bands,such as introgression lines 013,015,019 and 020.The introgression line 013 which had remarkable agronomic traits and improved protein content was finally selected as a new material for future study.

Spring wheat; Soybean; Pollen tube pathway; Agronomic traits; Quality analysis; RAPD marker

時間：2016-07-07

2016-02-22

2016-05-23

寧夏回族自治區(qū)農(nóng)業(yè)育種專項(2013NYYZ-02)；國家自然科學(xué)基金項目(31301305)

E-mail：jiayingying123@126.com

劉鳳樓(E-mail:liufenglou@nxchampion.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)07-0833-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160707.1529.004.html