Kr1基因在小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交中的表達(dá)及甲基化變異

蔡 華，趙維萍，葛 奇，阮在浩

(滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州 239000)

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Kr1基因在小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交中的表達(dá)及甲基化變異

蔡 華，趙維萍，葛 奇，阮在浩

(滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州 239000)

Kr1基因是小麥遠(yuǎn)緣雜交不親和主效基因，為了解其表達(dá)及調(diào)控機(jī)制，本研究系統(tǒng)比較了小麥自花授粉和小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交兩個(gè)過(guò)程中 Kr1基因的表達(dá)差異，同時(shí)分析了這兩個(gè)過(guò)程中 Kr1基因部分序列的DNA甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明， Kr1基因在小麥自花授粉過(guò)程中始終處于低量表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài)，而在小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中的表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化，具體表現(xiàn)為授粉前低量表達(dá)，授粉后迅速大量表達(dá)，24 h后又恢復(fù)為低量表達(dá)，高峰表達(dá)時(shí)期在外源花粉授入后0.5～2 h左右。DNA甲基化分析顯示，小麥自花授粉前后 Kr1基因一直處于較高水平的甲基化狀態(tài)，分別為58%和62%；而在授以玉米花粉后， Kr1基因迅速去甲基化，在0.5 h內(nèi)降到12%，在其后的1、2、24 h內(nèi)一直維持在10%～12%的低甲基化水平，表明DNA甲基化修飾參與了 Kr1基因在小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交中的表達(dá)調(diào)控。

小麥； Kr1基因；遠(yuǎn)緣雜交；DNA甲基化

小麥(TriticumestivumL.)近緣屬種中蘊(yùn)藏著大量?jī)?yōu)異基因，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交將其轉(zhuǎn)移到小麥中，這對(duì)豐富小麥遺傳基礎(chǔ)、選育優(yōu)良新品種具有重要意義[1]。然而，小麥遠(yuǎn)緣雜交面臨的首要問(wèn)題是突破來(lái)自不同基因組雙親的雜交不親和(Cross-incompatibility，CI)障礙。細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明，位于5B染色體上的 Kr1 基因是小麥遠(yuǎn)緣雜交不親和主效基因[2-5]。Alagu等用中國(guó)春5B單體( kr1kr1，2n=41)× Mara( Kr1Kr1，2n=42)構(gòu)建的重組自交系群體(Recombinant Inbred Lines，RIL)進(jìn)行cDNA-AFLP分析，獲得一條長(zhǎng)751 bp 的 Kr1基因差異表達(dá)cDNA片段[6]。我們以此序列為模板，在中國(guó)春中同源克隆了一條DNA序列，該序列與NCBI網(wǎng)站上已公布的小麥自交不親和(Self-incompatibility，SI)S位點(diǎn)受體激酶基因相同區(qū)域的同源性達(dá)87%[7]，但迄今 Kr1基因完整的分子結(jié)構(gòu)仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，小麥遠(yuǎn)緣雜交的不親和性在不同雜交系統(tǒng)中表現(xiàn)各異，例如用親緣關(guān)系較近的黑麥或球莖大麥的花粉給小麥?zhǔn)诜蹠r(shí)，極難獲得雜種胚，而用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的玉米或鴨茅狀摩擦禾的花粉給小麥?zhǔn)诜蹠r(shí)，雜種胚的獲得率可達(dá)30%以上[8-10]，這種不親和性的差異與植物遠(yuǎn)緣雜交的正常機(jī)制不符。在小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交中還發(fā)現(xiàn)，相同基因型小麥與不同基因型玉米雜交時(shí)，雜種胚的獲得率差異顯著，且受低溫、暗培養(yǎng)、不同2,4-D處理等外界環(huán)境因素影響顯著[11-16]。目前小麥遠(yuǎn)緣雜交不親和性的分子機(jī)制尚不清楚。

研究表明，遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)大量DNA胞嘧啶甲基化變異[17-19]，它關(guān)閉或啟動(dòng)某些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[20-21]。如在水稻[22-23]、玉米[24]等遠(yuǎn)緣雜交的研究中發(fā)現(xiàn)，雜交后代DNA 甲基化變異與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。Liu 等[25-26]發(fā)現(xiàn)小麥遠(yuǎn)緣雜交和異源多倍體化過(guò)程中會(huì)誘發(fā)穩(wěn)定遺傳的胞嘧啶甲基化變異，變異的序列包括低拷貝編碼和非編碼序列。張 勇等[27]在小麥-黑麥易位系中發(fā)現(xiàn)，外源種質(zhì)可以誘發(fā)小麥基因組發(fā)生廣泛的DNA甲基化變異。Shaded等[28]比較了一粒小麥×山羊草遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中全基因組的甲基化變異，發(fā)現(xiàn)8.7%的CpG 甲基化位點(diǎn)發(fā)生了變異，與親本相比，有4.4%的甲基化變異是在異源多倍體中發(fā)生的。針對(duì)上述問(wèn)題，本研究在前期已克隆小麥 Kr1基因部分片段的基礎(chǔ)上，以小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交為試驗(yàn)對(duì)象，研究授粉前后不同時(shí)間段小麥柱頭 Kr1基因的表達(dá)差異；采用亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法(Bisulfite Sequencing，BS)，分析外源花粉導(dǎo)入引發(fā)小麥 Kr1基因發(fā)生DNA 甲基化的變異特性，解析DNA甲基化作用于小麥遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生表觀遺傳變異的分子機(jī)制，以期為揭示小麥遠(yuǎn)緣雜交不親和機(jī)制、促進(jìn)小麥遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用材料種植于滁州學(xué)院試驗(yàn)田。試驗(yàn)所用的普通小麥種質(zhì)為中國(guó)春，玉米品種為鳳糯1號(hào)。小麥于適播期種植于試驗(yàn)田。為使小麥與玉米的花期相遇，自1月2日起，每隔7 d播種30粒玉米于塑料小盆缽營(yíng)養(yǎng)土中，置于15 ℃生長(zhǎng)箱使幼苗越冬，期間給予每天12 h光照，共播種8批。玉米幼苗于3月上旬移栽至小麥試驗(yàn)田，用于遠(yuǎn)緣雜交授粉。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取

小麥開(kāi)花前2～3 d進(jìn)行人工去雄，套袋隔離。1～2 d后收集供試的新鮮玉米花粉和新鮮小麥花粉，分別給去雄的麥穗逐花授粉，授粉后仍套袋隔離，并標(biāo)記自花授粉和小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交授粉的麥穗。分別采集開(kāi)花前、自花授粉和遠(yuǎn)緣雜交授粉后0.5、1、2、24 h的麥穗，剝?nèi)⌒』▋?nèi)的子房用于提取基因組DNA?；蚪MDNA提取參照TransGen公司(北京)的試劑盒EasyPure Plant Genomic DNA Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

參照寶生物工程(大連)有限公司的TaKaRa試劑盒RNAiso Plus說(shuō)明書(shū)分別提取開(kāi)花前、自花授粉和小麥×玉米遠(yuǎn)緣授粉后0.5、1、2、24 h的小麥子房總RNA。參照TaKaRa試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈。

1.2.3 Kr1基因表達(dá)的RT-PCR分析

根據(jù)已公布的小麥 Kr1基因cDNA序列(Genbank登錄號(hào)：167554889)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)多對(duì)outer和inner引物，在中國(guó)春cDNA中進(jìn)行5′和3′延伸，最后獲得1條長(zhǎng)1 273 bp的cDNA片段，再以此序列為模板，設(shè)計(jì)特異引物KR1-F1：5′-GCTGTGGTTCTTCTTCC GCTAC-3′和KR1-R1：5′-CCAAGGTCCTGA TTTCCA-3′ (由上海英俊生物科技有限公司合成)，利用MG96G-PCR儀進(jìn)行RT-PCR分析。

為使不同處理的小麥子房試驗(yàn)樣品標(biāo)準(zhǔn)一致，以小麥微管蛋白Tubulin基因( Genbank登錄號(hào)：DQ435662.1)作為內(nèi)參，內(nèi)參引物序列為F1：5′-TGCAAATCTTCGTCAAAACCC-3′和R1：5′-GGGAATGGGTAGACAAGACACT-3′。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物單鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。首先根據(jù)內(nèi)參引物的PCR結(jié)果調(diào)整各樣品的cDNA模板濃度，使所擴(kuò)增Tubulin基因的電泳條帶亮度一致，進(jìn)一步確定所需單鏈cDNA的模板量。 Kr1基因特異引物的半定量PCR反應(yīng)體系總體積為10 μL，各成分如下：Trans 2×EasyTaq○RPCR SuperMix 5 μL、1 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1 μL，加滅菌超純水至10 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 Kr1基因的甲基化反應(yīng)及其測(cè)序

采用亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法分析小麥遠(yuǎn)緣雜交前后 Kr1基因的甲基化反應(yīng)?；蚪MDNA的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換處理(包括純化和脫磺基反應(yīng))、處理后DNA的回收、脫磺基、中和、純化等過(guò)程均按上海生工UNIQ-10 Column Methy DNA Purification Kit0試劑盒說(shuō)明，參照汪艷杰等[29]的方法進(jìn)行。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的 Kr1基因DNA序列[7]，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換后的 Kr1基因DNA序列，分析甲基化變異。用于設(shè)計(jì)引物的序列經(jīng)過(guò)methyl primer express software v1.0軟件轉(zhuǎn)換，其中C轉(zhuǎn)換為T(mén)，但CpG的C因甲基化修飾保持不變，仍為C，通過(guò)分析經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換處理后的 Kr1基因PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，判斷CpG是否發(fā)生甲基化，每次測(cè)序均挑選10個(gè)克隆，CpG發(fā)生甲基化比例=甲基化的CpG數(shù)目/(甲基化的CpG數(shù)目+非甲基化的CpG數(shù)目)×100%。用于甲基化分析的引物序列為KR1-F2：5′-AAGATA AGTATTTTGGGA-3′和KR1-R2：5′-CTCC ACGCTTCACCCTT-3′。

經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換處理后的 Kr1基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為50 μL，各成分如下：處理純化的DNA模板3 μL、引物KR1-F2和KR1-R2各1 μL、dNTPs 1 μL、10×PCR Buffer(with Mg2+)5 μL、5 U·μL-1Taq酶0.8 μL、滅菌超純水 38.2 μL。PCR反應(yīng)程序如下：98 ℃預(yù)變性4 min；20個(gè)循環(huán)，94 ℃變性45 s，66 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；20循環(huán)，94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；72 ℃延伸8 min。3%凝膠電泳觀察結(jié)果，并使用膠回收純化試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由南京金斯瑞公司純化、TA克隆后測(cè)序。

1.2.5 序列分析

應(yīng)用DNAMAN軟件的Alignment對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)，并在NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行BLAST分析。應(yīng)用序列處理在線(xiàn)工具包(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)尋找被測(cè)序列的最大開(kāi)放閱讀框ORF等。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA和總RNA

普通小麥中國(guó)春各個(gè)處理樣品的基因組DNA和總RNA凝膠電泳檢測(cè)見(jiàn)圖1。從圖1可見(jiàn)，各處理的基因組DNA和總RNA濃度基本一致，純度較好，可以作為后序PCR反應(yīng)的擴(kuò)增模板。

2.2 Kr1基因在小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交中的表達(dá)分析

以Tubulin內(nèi)參調(diào)平后的cDNA為模板，以KR1-F1和KR1-R1為特異引物，對(duì)小麥自花授粉和小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交前后不同時(shí)間段的小麥子房進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)如圖2，挑出有產(chǎn)物的條帶純化后測(cè)序。序列分析表明，該cDNA片段與模板序列同源率達(dá)98.34%，表明擴(kuò)增產(chǎn)物為目的基因片段。圖2同時(shí)顯示，小麥 Kr1基因的表達(dá)在自花授粉和遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中截然不同。自花授粉時(shí)，開(kāi)花前 Kr1基因低量表達(dá)，自花授粉后 Kr1基因基本失活，表明自花授粉在一定程度上抑制了柱頭中 Kr1基因的表達(dá)，這與小麥屬于嚴(yán)格自花閉花授粉植物的自交親和特性相符；遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中， Kr1基因的表達(dá)呈現(xiàn)劇烈變化，在小麥柱頭接受到玉米花粉0.5 h內(nèi)迅速大量表達(dá)，并一直維持到授粉后2 h左右才逐漸降低，24 h后 Kr1基因的表達(dá)量接近開(kāi)花前的較低水平，表明遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程促進(jìn)了小麥柱頭中 Kr1基因的表達(dá)。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，初步推斷 Kr1基因在小麥自花授粉系統(tǒng)中處于低量表達(dá)至不表達(dá)狀態(tài)，而在小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交系統(tǒng)中的表達(dá)特性為：授粉前低量表達(dá)→授粉后表達(dá)迅速上升→隨后表達(dá)量逐漸降低→一段時(shí)間后又恢復(fù)為低量表達(dá)，高峰表達(dá)時(shí)期在玉米花粉授入后0.5～2 h左右。

A圖為基因組DNA； B圖為總RNA； M:Marker；1:開(kāi)花前的子房； 2:自花授粉0.5 h后的子房； 3:授玉米花粉0.5 h后的子房； 4:授玉米花粉1 h后的子房； 5:授玉米花粉2 h后的子房； 6:授玉米花粉24 h后的子房。

A figure is genomic DNA ；B figure is total RNA；M:Marker；1:Ovary before flowering；2:Ovary after self-pollination 0.5 h；3:Ovary after granting maize pollen 0.5 h；4:Ovary after granting maize pollen 1 h；5:Ovary after granting maize pollen 2 h；6:Ovary after granting maize pollen 24 h.

圖1 小麥基因組DNA和總RNA

Fig.1 Genomic DNA and total RNA of wheat

M:Marker；1:開(kāi)花前的子房； 2:自花授粉0.5 h后的子房； 3:授玉米花粉0.5 h后的子房； 4:授玉米花粉1 h后的子房； 5:授玉米花粉2 h后的子房； 6:授玉米花粉24 h后的子房。

M:Marker；1:Ovary before flowering；2:Ovary after self-pollination 0.5 h；3:Ovary after granting maize pollen 0.5 h；4:Ovary after granting maize pollen 1 h；5:Ovary after granting maize pollen 2 h；6:Ovary after granting maize pollen 24 h.

圖2 Kr1基因在小麥×玉米中的表達(dá)

Fig.2 Kr1 gene expression in wheat×maize

2.3 Kr1基因的DNA 甲基化分析

亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換處理過(guò)的基因組DNA經(jīng)特異引物KR1-F2和KR1-R2擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)212 bp(圖3)?；厥諟y(cè)序分析結(jié)果表明，與模板 Kr1基因cDNA序列(Genbank登錄號(hào)：167554889)相比，CG的胞嘧啶C不變，非CG的胞嘧啶C全部轉(zhuǎn)換為T(mén)(圖4)，說(shuō)明亞硫酸氫鹽對(duì)小麥 Kr1基因的DNA序列轉(zhuǎn)換充分。從各處理的 Kr1基因甲基化狀態(tài)，以及由此統(tǒng)計(jì)分析得到各個(gè)樣品的甲基化水平和變化特點(diǎn)(圖5和表1)可以看出，在小麥自花授粉系統(tǒng)中，開(kāi)花前和自花授粉0.5 h后的子房中 Kr1基因一直處于較高的甲基化水平狀態(tài)，CpG發(fā)生甲基化的比例分別為58%和62%。高水平的甲基化會(huì)顯著抑制 Kr1基因的表達(dá)，這也較好地解釋了 Kr1基因在小麥開(kāi)花前的低量表達(dá)和自花授粉0.5 h后不表達(dá)的現(xiàn)象。

a:開(kāi)花前的子房； b:自花授粉0:5 h后的子房； c:授玉米花粉0.5 h后的子房； d:授玉米花粉1 h后的子房； e:授玉米花粉2 h 后的子房； f:授玉米花粉24 h后的子房。

a:Ovary before flowering；b:Ovary after self-pollination 0.5 h；c:Ovary after granting maize pollen 0.5 h；d:Ovary after granting maize pollen 1 h；e:Ovary after granting maize pollen 2 h；f:Ovary after granting maize pollen 24 h.

圖3 Kr1基因經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換后的基因組DNA-PCR

Fig.3 Kr1 gene after sulfite conversion genomic DNA-PCR

在小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交系統(tǒng)中， Kr1基因甲基化水平在雜交前后發(fā)生了極明顯的變化。授粉前小麥子房中 Kr1基因的高水平甲基化狀態(tài)在受到玉米花粉刺激后迅速降低(圖5)，在授粉后0.5 h很短的時(shí)間內(nèi)， Kr1基因甲基化水平由58%快速降到12%，其后的1、2、24 h內(nèi)一直維持在10%到12%的低甲基化水平，說(shuō)明小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交引起 Kr1基因明顯去甲基化變異。

引物序列用下畫(huà)線(xiàn)標(biāo)出，每一個(gè)CpG 位點(diǎn)都用加框顯示。

The primer sequence is marked with a line, and each CpG locus is displayed in a box.

圖4 小麥 Kr1基因DNA 序列(上鏈)和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換后的DNA 序列(下鏈)

Fig.4 DNA sequence of wheat Kr1 gene(up-chain) and DNA sequence after sulfite conversion(down-chain)

a:開(kāi)花前的子房； b:自花授粉0.5 h后的子房； c:授玉米花粉0.5 h后的子房； d:授玉米花粉1 h后的子房； e:授玉米花粉2 h后的子房； f:授玉米花粉24 h后的子房；○和●分別代表沒(méi)有甲基化的和甲基化的CpG。

a:Ovary before flowering；b:Ovary after self-pollination 0.5 h；c:Ovary after granting maize pollen 0.5 h；d:Ovary after granting maize pollen 1 h；e:Ovary after granting maize pollen 2 h；f:Ovary after granting maize pollen 24 h；○and ● represent no methylation and methylation of CpG,respectively.

圖5 小麥 Kr1基因的甲基化狀態(tài)

Fig.5 Methylation status of Kr1 gene in wheat

表1 各處理的 Kr1基因甲基化水平

3 討 論

植物授粉過(guò)程極其復(fù)雜，有時(shí)基因型相同的雌雄配子間并不能自交結(jié)實(shí)，即自交不親和；有時(shí)完全不同種屬之間的雌雄配子卻可以突破天然生殖障礙而實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交。遠(yuǎn)緣雜交對(duì)植物基因組進(jìn)化和新物種形成具有創(chuàng)造性作用[30]。在小麥中， Kr1基因失活是實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交的關(guān)鍵。遺傳學(xué)研究認(rèn)為，失活的 Kr1基因是隱性基因，敏感的 Kr1基因則表現(xiàn)為顯性，如中國(guó)春和黑麥遠(yuǎn)緣雜交的結(jié)實(shí)率為86.39%，其基因型為純合隱性 kr1kr1；“四棱白麥”和黑麥遠(yuǎn)緣雜交的結(jié)實(shí)率為0，其基因型為純合顯性 Kr1Kr1[31]，但迄今顯、隱性 Kr1基因的分子結(jié)構(gòu)差異并不清楚。本文比較了小麥自花授粉和小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交兩個(gè)系統(tǒng)中 Kr1基因的表達(dá)差異，結(jié)果顯示， Kr1基因在小麥自花授粉過(guò)程中處于不表達(dá)或低量表達(dá)狀態(tài)，而在小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中的表達(dá)是變化的；自花授粉過(guò)程在一定程度上抑制了柱頭 Kr1基因的表達(dá)，遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程有效促進(jìn)了小麥柱頭 Kr1基因的表達(dá)。據(jù)此我們推測(cè)，小麥柱頭 Kr1基因應(yīng)該對(duì)自身花粉不敏感，而對(duì)遠(yuǎn)緣物種的花粉敏感，這一點(diǎn)與蕓薹屬異花授粉植物的自交不親和性正好相反。張愛(ài)芬等[32]對(duì)不結(jié)球白菜自交不親和基因srk片段的克隆與表達(dá)分析表明，srk基因主要在自交不親和系的柱頭中高度表達(dá)，而在自交親和系中的表達(dá)量最低。srk基因在蕓薹屬植物中的自交不親和性可能類(lèi)似于 Kr1基因在小麥遠(yuǎn)緣雜交中的雜交不親和性，我們前期克隆的 Kr1基因DNA序列與小麥srk基因(Genbank登錄號(hào)：AY963808)共同區(qū)域的同源性達(dá)87%[7]，但進(jìn)一步的分析表明，該共同區(qū)域僅為115 bp，位于srk基因的第3外顯子內(nèi)，因此并不能充分證明 Kr1基因和srk基因的同源關(guān)系。而且除 Kr1基因外，在小麥5A染色體短臂上還存在另外一個(gè)抑制遠(yuǎn)緣雜交的 Kr2基因。同時(shí)， Kr1和 Kr2均存在等位的隱性基因，而僅顯性Kr基因才具有抑制遠(yuǎn)緣雜交的能力。因此，小麥遠(yuǎn)緣雜交不親和Kr基因和自交不親和srk基因之間的相互關(guān)系及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

小麥遠(yuǎn)緣雜交和異源多倍體化可誘發(fā)穩(wěn)定遺傳的基因組變異和胞嘧啶甲基化變異[25]。本實(shí)驗(yàn)表明，小麥 Kr1基因在自花授粉前后一直處于高水平的甲基化狀態(tài)，但授以玉米花粉后， Kr1基因的甲基化水平迅速降低，并在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持在低水平狀態(tài)。Lippman 等[33]對(duì)擬南芥DNA甲基化與基因抑制表達(dá)的研究表明，自交能導(dǎo)致甲基化程度的逐漸積累，而雜交能使甲基化程度得以解除或重新編排。因此， Kr1基因在自交過(guò)程中的高甲基化以及與玉米遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中的迅速去甲基化應(yīng)該有效調(diào)控 Kr1基因在自交和遠(yuǎn)緣雜交系統(tǒng)中的表達(dá)，并最終引發(fā)小麥自交親和及遠(yuǎn)緣雜交不親和。結(jié)合玉米花粉授后不同時(shí)間段小麥 Kr1基因的表達(dá)變化，推測(cè)其可能的調(diào)控機(jī)制為：在接觸外源花粉前，高水平的甲基化修飾使小麥柱頭 Kr1基因的表達(dá)處于抑制狀態(tài)，而玉米花粉的刺激使小麥柱頭的 Kr1基因迅速去甲基化，促使 Kr1基因大量表達(dá)，在很短時(shí)間內(nèi)激活胼胝質(zhì)反應(yīng)，形成胼胝質(zhì)塞，阻礙玉米花粉在小麥柱頭上萌發(fā)生長(zhǎng)和花粉管進(jìn)入胚囊，進(jìn)而抑制遠(yuǎn)緣雜交。但這種甲基化對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控可能不是唯一的，這是因?yàn)?，小?Kr1基因表達(dá)在遠(yuǎn)緣雜交后是動(dòng)態(tài)變化的，先是迅速大量表達(dá)，一段時(shí)間后又逐漸降低；而甲基化水平僅在雜交前后出現(xiàn)劇烈變化，雜交后不同時(shí)間內(nèi)的去甲基化變異并不顯著。需要說(shuō)明的是，因小麥自花授粉過(guò)程的準(zhǔn)確時(shí)間難以確定，本次試驗(yàn)的“自花授粉”是用同一基因型的小麥花粉給去雄的小麥柱頭授粉，以獲得自花授粉后不同時(shí)間段的試驗(yàn)材料。這種采用人工去雄和人工授粉相結(jié)合的“自花授粉”是否會(huì)對(duì)小麥 Kr1基因的表達(dá)及甲基化產(chǎn)生影響，尚需研究。

普通小麥含有AA、BB、DD三套染色體組，雖屬?lài)?yán)格自花授粉植物，但其進(jìn)化過(guò)程中涉及三次遠(yuǎn)緣雜交及染色體天然加倍，表明其基因組可能具有易于遠(yuǎn)緣雜交的天然特性[34]。但實(shí)際上，小麥遠(yuǎn)緣雜交很難實(shí)現(xiàn)，而且雜交親和性對(duì)外源花粉的敏感性差異極大。如 Kr1基因在小麥×黑麥中敏感，難以雜交成功，而在小麥×玉米中，卻可能獲得較高頻率的雜種胚。而且即使在小麥×玉米中，相同基因型的小麥與不同基因型的玉米雜交時(shí)，雜種胚獲得率也差異顯著。結(jié)合本次試驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)，小麥遠(yuǎn)緣雜交不親和基因的表達(dá)受外界環(huán)境，尤其是外源花粉的影響巨大；其在小麥×玉米中可能表現(xiàn)出較高親和性，這也許與玉米基因組含有大量轉(zhuǎn)座子有關(guān)，即在玉米花粉與小麥柱頭融合過(guò)程中，不同基因型玉米的轉(zhuǎn)座子可能會(huì)不同程度地插入到小麥遠(yuǎn)緣雜交不親和基因內(nèi)部，導(dǎo)致該基因不同程度的失活，最終引起不同雜交組合的親和性產(chǎn)生差異。

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Expression of Kr1 Gene and Its Methylation Variation in Wheat × Maize Distant Hybridization

CAI Hua,ZHAO Weiping,GE Qi,RUAN Zaihao

(School of Biological and Food Engineering, Chuzhou University, Chuzhou，Anhui 239000, China)

Kr1 gene is the major gene regulating incompatibility in wheat distant hybridization. To understand its expression and regulation mechanism, the difference of Kr1 expression in the two systems of wheat self-pollination and wheat × maize distant hybridization were compared systematically in this work, and the variations of DNA methylation of Kr1 gene during the self-pollination and distant hybridization processes were analyzed. The results showed that the expression level of Kr1 gene was always low or even no expression in the process of wheat self-pollination. However, its expression showed a dynamic change in wheat × maize distant hybridization, with low expression before pollination, a rapid great increase of expression after pollination, and low expression after 24 h. The peak expression period was present at about 0.5-2 h after pollinated with the foreign pollen. DNA methylation analysis shows that Kr1 gene stays a high level status before and after the self-pollination, with the proportion of 58% and 62%, respectively. However, after pollinated with maize pollen, Kr1 gene is rapidly de-methylated, dropping to a level of 12% in 0.5 h, and maintains at the low level of 10% to 12% methylation in the subsequent 1, 2, and 24 h. These findings indicate that DNA methylation modification is participated in the expression and regulation of Kr1 gene in wheat × maize distant hybridization.

Wheat； Kr1 gene;Distant hybridization;DNA methylation

時(shí)間：2016-07-07

2016-01-06

2016-01-25

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1308085MC34)；國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201403039)；國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(ZW2010002)。

E-mail：chczh@163.com

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)07-0825-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160707.1529.002.html