酶法檢測(cè)糖化白蛋白的性能驗(yàn)證及其在2型糖尿病患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值

曹輝彩，趙家慧，陳妹紅，靳麗亞，王之秀，陳翼霖

(1.河北省保定市第一中心醫(yī)院東院檢驗(yàn)科, 河北 保定 071000；2.河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院2014級(jí)臨床3班，河北 保定 071000；3.河北省保定市第一中心醫(yī)院總院心電圖室，河北 保定 071000)

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·論 著·

酶法檢測(cè)糖化白蛋白的性能驗(yàn)證及其在2型糖尿病患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值

曹輝彩1，趙家慧2，陳妹紅3*，靳麗亞1，王之秀1，陳翼霖1

(1.河北省保定市第一中心醫(yī)院東院檢驗(yàn)科, 河北 保定 071000；2.河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院2014級(jí)臨床3班，河北 保定 071000；3.河北省保定市第一中心醫(yī)院總院心電圖室，河北 保定 071000)

目的對(duì)寧波瑞源公司酶法檢測(cè)糖化白蛋白(glycated albumin，GA)定量進(jìn)行性能驗(yàn)證并評(píng)價(jià)其臨床應(yīng)用價(jià)值。方法收集標(biāo)本檢測(cè)酶法測(cè)定GA的精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍評(píng)價(jià)、試劑空白吸光度、參考區(qū)間驗(yàn)證，驗(yàn)證其在2型糖尿病患者中的臨床性能。結(jié)果 低、中和高3個(gè)濃度GA 樣品的批內(nèi)精密度分別為1.45%、1.08%、1.06%,批間精密度分別為1.68%、1.13%、1.19%,相對(duì)偏倚為1.54%,在參考物質(zhì)允許的偏倚范圍內(nèi),準(zhǔn)確度符合相關(guān)文件的要求。GA線性分析方程式為Y=0.998X +1.170,r=1.000,表明GA在129～925 μmol/L范圍內(nèi)白蛋白與鈷結(jié)合線性良好。試劑空白吸光度是反映試劑質(zhì)量的指標(biāo)之一,本實(shí)驗(yàn)測(cè)得空白吸光度平均值為0.004 2，顯示該試劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾非常小。20例無(wú)感染的健康體檢者中19例在正常參考區(qū)間范圍內(nèi)。證明說明書推薦的參考區(qū)間適合本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人群。血清GA對(duì)于診斷糖尿病的靈敏度、特異度分別為90.4%、95.8%。GA可用于糖尿病的診斷和療效評(píng)估。結(jié)論酶法檢測(cè)GA的性能指標(biāo)均符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量的要求，適用于臨床樣本的檢測(cè)及糖尿病患者的療效評(píng)估。

糖尿病，2型；白蛋白類；實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。DM患者的血糖如果長(zhǎng)期升高,會(huì)導(dǎo)致眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害和功能障礙。據(jù)臨床數(shù)據(jù)表明,將有30%～40% DM患者發(fā)病10年后至少發(fā)生一種并發(fā)癥,且并發(fā)癥一旦產(chǎn)生，藥物治療很難逆轉(zhuǎn)，因此強(qiáng)調(diào)盡早預(yù)防DM并發(fā)癥發(fā)生。血糖監(jiān)測(cè)在DM患者治療過程中起著非常重要的作用,控制好血糖能及時(shí)延緩DM患者并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展,短期平均血糖控制是血糖長(zhǎng)期達(dá)標(biāo)非常重要的手段。DM的短期監(jiān)控指標(biāo)有血糖、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)、糖化白蛋白(glycosylated albumin,GA)等。HbA1c可以反映近2～3個(gè)月的血糖控制水平，而人體中的葡萄糖與血清蛋白的N-末端發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)，其中 90% 以上為 GA，GA 可以反映近2～3周血糖控制的平均水平，可評(píng)價(jià)短期內(nèi)血糖變化，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值[1]。本研究采用酶法測(cè)定GA的各項(xiàng)性能指標(biāo),驗(yàn)證其是否符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量要求,同時(shí)對(duì)其在2型DM患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 樣品來源

1.1.1 用于臨床性能驗(yàn)證的樣品 選取2015年5—12月我院內(nèi)分泌科收治的明確診斷為DM的患者156例作為病例組，男性97例，女性59例，年齡14～95歲，平均(60.4±19.1)歲。同時(shí)選取2015年11—12月在我院參加體檢的血糖正常健康體檢者216例作為對(duì)照組，男性112例，女性104例，年齡20～84歲，平均(51.0±17.1)歲。

1.1.2 用于性能驗(yàn)證的樣本 ①低值標(biāo)本：選擇本院內(nèi)分泌科患者血清，其濃度盡可能接近可報(bào)告范圍低限。②高值標(biāo)本：選擇本院內(nèi)分泌科患者的血清，其濃度盡可能接近可報(bào)告范圍高限。③中值血清：將上述低值血清與高值血清按1∶1的比例混合。

1.2 試劑和儀器 GA試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品均由寧波瑞源生物科技有限公司提供，批號(hào)分別為2015052301、20150602、20150602。血清白蛋白檢測(cè)校準(zhǔn)品(批號(hào):901UN) 由英國(guó)朗道提供。檢測(cè)儀器為日立7600全自動(dòng)生化分析儀。

1.3 驗(yàn)證方法 依照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)評(píng)價(jià)方案驗(yàn)證，每天測(cè)定低值和高值2個(gè)水平的指控,室內(nèi)質(zhì)控在控后進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)。

1.3.1 精密度的驗(yàn)證 精密度包括批內(nèi)和批間精密度,精密度的程度常用標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)來表示。按照臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)頒布的EP5-A2文件評(píng)價(jià)。批內(nèi)精密度：將3個(gè)濃度的樣本隨患者標(biāo)本同時(shí)檢測(cè),連續(xù)檢測(cè)20次；計(jì)算其均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)；以批內(nèi)變異系數(shù)小于1/4允許總誤差為結(jié)果可接受。批間精密度：每天測(cè)定1次3個(gè)濃度的評(píng)價(jià)樣本，共檢測(cè)20 d，累計(jì)20次,計(jì)算其均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)；以批間變異系數(shù)小于1/3允許總誤差為結(jié)果可接受。

1.3.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 準(zhǔn)確度指測(cè)得值與真值之間相符合程度,它的高低常以誤差的大小衡量。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)已知濃度的校準(zhǔn)品,計(jì)算相對(duì)偏倚。相對(duì)偏倚=(靶值-測(cè)定值)/靶值×100%, 若相對(duì)偏倚在允許的偏倚范圍內(nèi)結(jié)果為可接受[2]。

1.3.3 線性范圍驗(yàn)證 線性范圍是指試劑盒按說明書使用可準(zhǔn)確測(cè)量的范圍,是衡量其質(zhì)量的重要指標(biāo)。參照CLSI EP6文件,選取一份高濃度樣本(H)和份低濃度樣本(L),其結(jié)果盡可能接近廠家提供的檢測(cè)上限和下限,分別按5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H體積比混合成6個(gè)不同濃度的樣本,每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次,計(jì)算其均值。將實(shí)測(cè)值(Y)和理論值(X)進(jìn)行比較,計(jì)算Y=bX+a驗(yàn)證線性范圍。 要求r≥0.975,a值在1±0.05范圍內(nèi)，截距b小于檢測(cè)上限的5%。

1.3.4 試劑空白吸光度驗(yàn)證 試劑空白是指由于測(cè)試試劑本身給檢測(cè)結(jié)果帶來的誤差。其檢測(cè)方法是按照正常的檢測(cè)方法，把樣本換成去離子水。

1.3.5 參考區(qū)間驗(yàn)證 參考區(qū)間在我國(guó)通常又稱為“參考范圍”、“正常范圍”、“正常值”等,是指從參考下限到參考上限的區(qū)間。通常是中間95%區(qū)間,參照CLSI C28-A2文件,從本地參考人群中募集參考個(gè)體20例采樣并測(cè)定,測(cè)定值剔除離群值后若不滿20例需補(bǔ)足。將這20個(gè)測(cè)定值與需驗(yàn)證的參考區(qū)間比較,若落在參考限外的測(cè)定值不超過2個(gè)，則該參考區(qū)間可直接使用,若大于2個(gè)及以上檢測(cè)結(jié)果超出,重新篩選20例,重復(fù)上述操作。若仍然有3個(gè)或3個(gè)以上測(cè)定值超出,則實(shí)驗(yàn)室應(yīng)重新檢查所用的分析程序,考慮是否有人群差異,考慮是否需要自己建立參考區(qū)間。

1.3.6 臨床性能驗(yàn)證 臨床檢驗(yàn)結(jié)果的最終目是用于患者的臨床治療,因此檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)應(yīng)包括臨床性能驗(yàn)證[3],這種性能驗(yàn)證能力可用靈敏度和特異度來衡量[4]。靈敏度指由金標(biāo)準(zhǔn)確診有病的實(shí)驗(yàn)組內(nèi)所檢測(cè)出陽(yáng)性病例數(shù)的比率(%)，即本實(shí)驗(yàn)診斷的真陽(yáng)性率。靈敏度=[真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陰性)]×100%；特異度=[真陰性/(假陽(yáng)性+真陰性)]×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算均值、精密度、相對(duì)偏倚、參考區(qū)間、靈敏度和特異度，進(jìn)行線性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 精密度結(jié)果分析 低、中、高3個(gè)濃度的批內(nèi)精密度和批間精密度均低于CLIA′88分析質(zhì)量要求規(guī)定的1/3允許總誤差, 結(jié)果均可接受。見表1。

表1 GA精密度結(jié)果

2.2 準(zhǔn)確度結(jié)果分析 檢測(cè)與當(dāng)前檢測(cè)系統(tǒng)校準(zhǔn)的校準(zhǔn)品應(yīng)為不同批號(hào)配套校準(zhǔn)品,重復(fù)檢測(cè)3次,結(jié)果分別為487.132 μmol/L、488.321 μmol/L、486.741 μmol/L，其平均值為487.400 μmol/L,理論值為480 μmol/L,相對(duì)偏倚為1.54%,低于CLIA′88分析質(zhì)量要求規(guī)定的1/3允許總誤差(5%),結(jié)果可接受。

2.3 線性范圍評(píng)價(jià) 選擇GA低值標(biāo)本(L)和高值標(biāo)本(H)各1份，濃度分別為129 μmol/L、925 μmol/L。將6個(gè)不同濃度的標(biāo)本分別編號(hào)1、2、3、4、5、6。以實(shí)測(cè)均值Y為縱坐標(biāo),理論值X為橫坐標(biāo)做圖并計(jì)算其回歸方程Y=bX+a,并做散點(diǎn)圖進(jìn)行線性回歸分析。經(jīng)分析GA線性分析方程式為Y=0.998X+1.170,r=1.000，P<0.001。表明GA在129～925 μmol/L范圍內(nèi)白蛋白與鈷結(jié)合線性良好,結(jié)果見表2及圖1。

表2 GA線性范圍評(píng)價(jià)結(jié)果 (μmol/L)

圖1 GA線性分析

Y=0.998X+1.170,r=1.000，P<0.001

2.4 試劑空白吸光度 GA的試劑空白吸光度平均值為0.042。

2.5 參考區(qū)間驗(yàn)證 參考CLSI C28-A2的要求,將疑似離群點(diǎn)和相鄰點(diǎn)的差值(D)與數(shù)據(jù)全距(R)相除。若D/R≤1/3，即可排除離群點(diǎn),若>1/3考慮為離群值,將其剔除。本實(shí)驗(yàn)D/R≤1/3無(wú)離群值。20份檢測(cè)結(jié)果19例在試劑生產(chǎn)廠商提供的11%～16%參考范圍內(nèi)。初步證明說明書推薦的參考區(qū)間適合本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人群。見表3。

表3 GA參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果

2.6 臨床性能驗(yàn)證 檢測(cè)病例組和對(duì)照組GA水平,以GA>16%判定為陽(yáng)性。血清GA對(duì)于DM患者的靈敏度、特異度分別為90.4%、95.8%，見表4。

表4 GA的臨床性能驗(yàn)證 (例數(shù))

3 討 論

近年來,DM已成為繼腫瘤和心腦血管疾病之后第3位嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病[5-7]。DM患者血糖控制不良可導(dǎo)致DM腎病、心血管疾病等多種并發(fā)癥,GA與DM大血管、微血管并發(fā)癥的關(guān)系也尤為密切[8]。最新DM流行病學(xué)顯示目前全球?qū)⒔?億DM患者中約1/3存在視網(wǎng)膜病變或不同程度的DM相關(guān)眼損傷[9]。另有研究表明GA可以應(yīng)用于妊娠期DM的篩查[10]。血糖的良好控制可以延緩DM腎病進(jìn)展、減輕體內(nèi)臟器損傷、有效降低心血意外事件的發(fā)生及尿毒癥透析患者的病死率[11]。檢測(cè)GA水平也可用于監(jiān)控孕婦孕期血糖水平以及老年無(wú)癥狀性或夜間低血糖診斷。目前GA已作為血糖監(jiān)測(cè)首選指標(biāo)。GA半衰期較短，測(cè)定GA的濃度可有效反映患者過去2～3周內(nèi)平均血糖的水平，并不受臨時(shí)血糖濃度波動(dòng)的影響[12]。由于GA的衰期比HbA1c短，故GA反映血糖變化比HbA1c敏感。GA在治療效果的確認(rèn)以及臨床用藥量的調(diào)整方面比HbA1c更有優(yōu)勢(shì)。而且在許多血紅蛋白代謝異常的情況下HbA1c水平受到影響不能真實(shí)反映患者的血糖水平,而GA的結(jié)果不受影響,如DM腎病透析患者、貧血患者、妊娠期婦女的血糖檢測(cè)等。因此，GA能更及時(shí)、更確切地反映較短期內(nèi)DM的控制程度。

本研究GA檢測(cè)采用的是酶法,其原理是樣品中GA在被特異性的蛋白酶裂解釋放出糖化氨基酸,經(jīng)糖化氨基酸氧化酶氧化后產(chǎn)生過氧化氫,過氧化氫經(jīng)Trinder系統(tǒng)顯色后觀其顏色深淺與糖化血清蛋白含量成正比,與標(biāo)準(zhǔn)比較后可求得GA的含量。實(shí)驗(yàn)室在使用新的檢測(cè)方法或儀器設(shè)備時(shí),應(yīng)對(duì)其性能進(jìn)行初步評(píng)估[13]。本研究參照CLSI系列文件對(duì)寧波瑞源生物科技有限公司的GA檢測(cè)試劑盒和日立7600全自動(dòng)生化分析儀組成的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行了性能評(píng)價(jià)和臨床性能驗(yàn)證。結(jié)果顯示該試劑盒低、中、高3個(gè)濃度的批內(nèi)精密度分別為1.45%、1.08%、1.06%,批間精密度分別為1.68%、1.13%、1.19%，均符合廠商說明書要求小于5%,保證了檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。準(zhǔn)確度用來表示系統(tǒng)誤差的大小,本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià),結(jié)果符合相關(guān)文件的要求。本研究試劑空白吸光度平均為0.042,提示本試劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾非常小。參照CLSI EP6文件的要求對(duì)酶法測(cè)定GA進(jìn)行了線性范圍評(píng)價(jià),GA線性分析方程為Y=0.998X-1.170,r=1.000,表明GA在129～925 μmol/L范圍內(nèi)白蛋白與鈷結(jié)合線性良好。實(shí)驗(yàn)室在使用試劑生產(chǎn)廠商提供的參考區(qū)間之前,應(yīng)按C28-A2文件進(jìn)行參考區(qū)間的驗(yàn)證[14],本研究采用20份體檢合格的健康成人樣本來驗(yàn)證廠家提供的參考區(qū)間，20份檢測(cè)結(jié)果19例在試劑生產(chǎn)廠商提供的11%～16%參考范圍內(nèi)，初步證明說明書推薦的參考區(qū)間適合本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人群。血清GA對(duì)于診斷DM的靈敏度、特異度分別為90.4%、95.8%，能為醫(yī)生對(duì)DM的早期診斷及控制情況提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù),從而改善患者預(yù)后和減少并發(fā)癥。

綜上所述,GA檢測(cè)可準(zhǔn)確地反映DM患者短期平均血糖的水平及變化,具有非常重要的臨床價(jià)值。其檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和實(shí)用。GA與諸多DM慢性并發(fā)癥如慢性腎病、心血管病變有關(guān)。因此，通過GA檢測(cè)監(jiān)測(cè)DM早期病變，盡早發(fā)現(xiàn)和控制DM并發(fā)癥，是非常有價(jià)值的研究方向。

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(本文編輯：趙麗潔)

2016-03-17；

2016-09-09

曹輝彩(1975-)，女，河北趙縣人，河北省保定市第一中心醫(yī)院主任檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事臨床檢驗(yàn)學(xué)研究。

*通訊作者。E-mail:chc1718@163.com

R587.1

B

1007-3205(2016)11-1350-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.11.029