管氏腫腿蜂寄生對黃粉甲硫氧還蛋白基因轉(zhuǎn)錄的影響

黃鏡梅 劉乃勇 張祖兵 楊 斌 朱家穎

(1. 西南林業(yè)大學云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 云南省熱帶作物科學研究所，云南 景洪 666100)

?

管氏腫腿蜂寄生對黃粉甲硫氧還蛋白基因轉(zhuǎn)錄的影響

黃鏡梅1劉乃勇1張祖兵2楊 斌1朱家穎1

(1. 西南林業(yè)大學云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 云南省熱帶作物科學研究所，云南 景洪 666100)

硫氧還蛋白參與體內(nèi)必要的抗氧化作用和氧化還原調(diào)控過程，在昆蟲體內(nèi)能維持穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)，為初步了解硫氧還蛋白在黃粉甲體內(nèi)的作用以及管氏腫腿蜂寄生對該蛋白基因轉(zhuǎn)錄的影響，采用RACE技術(shù)，克隆獲得黃粉甲硫氧還蛋白基因，并進行多序列比對及熒光定量PCR分析。結(jié)果表明：cDNA序列長531 bp，開放閱讀框318 bp，其推導的氨基酸序列編碼106個氨基酸，3′端非編碼區(qū)序列為95 bp，5′端非編碼區(qū)序列為119 bp；預(yù)測理論分子量為11.97 kDa，等電點為4.22，含有一個保守的氧化還原活性位點 CGPC。黃粉甲硫氧還蛋白基因編碼的蛋白序列與其他昆蟲的硫氧還蛋白相似性高于60%；硫氧還蛋白基因在黃粉甲各發(fā)育階段中，在蛹期的表達水平最高，在成蟲期表達水平最低，在蛹期時的脂肪體中高度表達。被管氏腫腿蜂寄生后，黃粉甲硫氧還蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平明顯受到上調(diào)誘導。

黃粉甲；硫氧還蛋白；基因克隆；序列分析；管氏腫腿蜂

硫氧還蛋白 (thioredoxin, Trx) 廣泛地分布于從古生菌到哺乳動物中，蛋白質(zhì)分子量在12 kDa左右，含有一個高度保守的催化活性位點，屬于小分子還原酶家族成員[1]。它通過一對保守的半胱氨酸殘基參與必要的抗氧化作用和氧化還原調(diào)控過程，對細胞增殖、抗氧化活性、DNA合成、調(diào)控基因表達和控制細胞調(diào)亡等有影響[1-3]。目前，關(guān)于硫氧還蛋白能維持昆蟲體內(nèi)穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)和抵抗逆境危害的研究已經(jīng)有報道。如在黑腹果蠅 (Drosophilamelanogaster) 中證明了硫氧還蛋白-2基因的缺失能夠促進其他抗氧化酶基因的表達[4]。在家蠶 (Bombyxmori) 中，硫氧還蛋白參與抵抗極端溫度和病原微生物感染引起的氧化壓力[5]。在中華蜜蜂 (Apisceranacerana) 中，硫氧還蛋白參與抗氧化防御[6-8]。但是，迄今有關(guān)硫氧還蛋白的研究仍較少。為此，本研究利用RACE技術(shù)，克隆獲得黃粉甲 (Tenebriomolitor) 硫氧還蛋白基因的cDNA序列，并采用熒光定量PCR技術(shù)分析了硫氧還蛋白在黃粉甲不同發(fā)育間斷、在蛹期不同組織中和被管氏腫腿蜂 (Sclerodermaguani) 寄生后的表達情況，為進一步深入研究昆蟲中硫氧還蛋白家族基因的各種生理功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

管氏腫腿蜂為實驗室飼養(yǎng)種群，參照Zhu等[9]的方法用黃粉甲蛹在人工氣候培養(yǎng)箱中對管氏腫腿蜂進行繁殖，成蜂用蘸透20%蜂蜜水的脫脂棉球提供營養(yǎng)。在實驗室自然光照和常溫下，用飼料和洗凈的蔬菜飼養(yǎng)黃粉甲幼蟲。

1.2 主要試驗試劑

總RNA提取試劑Trizol、RACE 試劑盒SMARTTMRACE cDNA amplification kit (Clontech) 和DNA Marker DL 2000購自寶生物工程 (大連) 有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和熒光定量試劑盒SYBR Primer Script RT-PCR Kit購自Thermo公司，其他試劑均為國產(chǎn)或分析純。

1.3 總RNA 提取和cDNA合成

目的基因克隆的總RNA的提?。喝?頭黃粉甲蛹放入經(jīng)DEPC處理過的Eppendorf 管中勻漿，加入1 mL Trizol，備用。

熒光定量總RNA的提?。簠⒄語hu等[10]的方法取黃粉甲不同發(fā)育階段 (幼蟲1～3齡、蛹和成蟲)、黃粉甲蛹不同組織 (表皮、脂肪體和血淋巴) 及被管氏腫腿蜂寄生和未寄生 (6、12、24和48 h) 蛹，放入經(jīng)DEPC處理過的Eppendorf 管中勻漿，加入1 mL Trizol，備用。其中1齡和2齡幼蟲各4頭，3齡幼蟲2頭，蛹2頭，成蟲2頭；不同組織的樣品則各取20頭蛹解剖取樣；寄生和未寄生的各時間段各取2頭。

用Trizol試劑法分別提取上述收集好樣品的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測純度和濃度后，用SMARTTMRACE cDNA amplification kit (Clontech) 合成cDNA模板。

1.4 黃粉甲硫氧還蛋白基因克隆

根據(jù)實驗室前期測定黃粉甲蛹cDNA文庫獲得的部分硫氧還蛋白基因片段序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計5′ RACE和3′ RACE特異性引物 (5′-AGAAGTCGATCACGACGAGCTGATC-3′和5′-GAGTGCGAGGACATCGCCATGGA-3′)，以合成的cDNA作為模板，參照RACE試劑盒說明書克隆該基因的5′端和3′端序列。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，39個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，然后用凝膠回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物純化，再用TA克隆法，將目的片段與載體pGEM?-T-easy (Promega) 連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，進行藍白斑篩選，挑取陽性克隆，再通過雙酶切進行重組質(zhì)粒的驗證后送至上海杰李生物技術(shù)有限公司進行測序。將獲得的5′端和3′端序列用Lasergene 7.1軟件拼接成全序列，并將基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中。

1.5 序列分析

序列同源比對和搜索采用Blastx，信號肽預(yù)測采用SignalP 4.1，多序列比對分析用ClustalX 1.83[11]，理化性質(zhì)的分析用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) 軟件，結(jié)構(gòu)域的預(yù)測用Motif Scan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)。

1.6 熒光定量PCR

根據(jù)克隆獲得的黃粉甲硫氧還蛋白基因序列，設(shè)計特異性引物 (5′-GGTCACCCACATCAACGA-3′和5′-GATCATCTTGCAGGGGC-3′) 用于熒光定量PCR分析。以18S RNA基因作為內(nèi)參 (5′-TTTCA-AATGTCTGCCTTATC-3′和5′-TGTGGTAGCCGTTT-CTC A-3′)，以上述提取的總RNA合成的cDNA為模板，采用TakaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑進行PCR，每個樣品3個重復。PCR條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，39個循環(huán)。熒光定量PCR結(jié)果采用2-ΔΔCT方法進行計算[12]，數(shù)據(jù)用DPS軟件進行統(tǒng)計分析，顯著水平選擇P< 0.05[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及序列分析

克隆得到黃粉甲硫氧還蛋白基因的cDNA序列為531 bp，ORF為318 bp，3′和5′端非編碼序列分別為95 bp和119 bp，起始密碼子位于119～121 bp，終止密碼子位于434～436 bp (GenBank登錄號為KU524899) (圖1)。該基因編碼106 aa，預(yù)測理論分子量為11.97 kDa，等電點為4.22，其N-末端發(fā)現(xiàn)了非常保守的氧化還原活性位點CGPC。SignalP分析結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)氨基酸序列中不存在信號肽序列。黃粉甲硫氧還蛋白基因編碼的蛋白序列與其他昆蟲的硫氧還蛋白具有較高的相似性，其中與赤擬谷盜 (Triboliumcastaneum)、亞洲玉米螟 (Ostriniafurnacalis)、家蠶 (Bombyxmori)、果蠅 (Drosophilagrimshawi) 的硫氧還蛋白一致性分別為95%、64%、63%和61% (圖2)。

*表示終止子。

圖1 黃粉甲硫氧還蛋白基因核酸序列及其推導的氨基酸序列

Fig.1 The nucleotide and deduced amino acid sequences of thioredoxin gene fromTenebriomolitor

家蠶Bombyxmori(ABJ97191)；果蠅Drosophilagrimshawi(EDW03102)；亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(KJ7440390)；赤擬谷盜Triboliumcastaneum(EFA05230)；黃粉甲Tenebriomolite(KU524899)。

圖2 黃粉甲硫氧還蛋白和其它昆蟲硫氧還蛋白序列比對

Fig.2 Multiple alignments of thioredoxin sequences ofTenebriomolitorand other insects

2.2 熒光定量PCR分析

黃粉甲硫氧還蛋白基因在蛹的脂肪體中高度表達 (P< 0.05)，但是在表皮和血細胞中表達水平極低或幾乎不表達 (圖3)。在不同發(fā)育階段中，該基因在蛹中的表達水平最高，在成蟲中的表達水平最低，蛹中的表達量為成蟲中的3.64倍 (P< 0.05) (圖4)。被管氏腫腿蜂寄生6 h后，黃粉甲硫氧還蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯受到上調(diào)誘導。與對照相比，寄生6 h時，其表達量為對照的3.20倍 (P< 0.05)；寄生48 h時，其表達量為對照的7.75倍 (P< 0.05) (圖5)。

圖3 黃粉甲硫氧還蛋白基因在蛹期不同組織中的表達量

Fig.3 Relative expression level of thioredoxin gene ofTenebriomolitorin different tissues of pupa

L1, 1齡幼蟲first-instar larvae; L2, 2齡幼蟲mid-instar larvae; L3, 3齡幼蟲late-instar larvae; P, 蛹pupae; A, 成蟲adult

圖4 黃粉甲硫氧還蛋白基因在不同發(fā)育階段的表達量

Fig.4 Relative expression level of thioredoxin gene ofTenebriomolitorat different developmental stages

圖5 管氏腫腿蜂寄生后黃粉甲硫氧還蛋白基因的表達量

Fig.5 Relative expression level of thioredoxin gene ofTenebriomolitorafter parasitization bySclerodermaguani

3 結(jié)論與討論

硫氧還蛋白是一類分布廣泛的低分子量蛋白質(zhì)，在進化上十分保守，均含有1個外露的由2個Cys殘基組成而高度保守的活性中心 (CXXC)[14]。本研究克隆獲得的黃粉甲硫氧還蛋白氨基酸中也含有1個保守的氧化還原活性催化位點 CGPC，表明其屬于典型的硫氧還蛋白家族的成員。多序列比對結(jié)果顯示黃粉甲硫氧還蛋白與同屬于鞘翅目的赤擬谷盜氨基酸序列相似性高達95%，進一步證實了硫氧還蛋白在進化上的保守性。

在昆蟲中，脂肪體是主要的代謝器官，對外源物質(zhì)進行排毒并在抵抗氧化應(yīng)激壓力起著重要作用[15-16]。熒光定量表達分析結(jié)果表明，硫氧還蛋白在脂肪體中高度表達，家蠶硫氧還蛋白主要也是在脂肪體中表達[5]，說明硫氧還蛋白在黃粉甲和家蠶脂肪體中發(fā)揮著抗氧化防御作用。黃粉蟲發(fā)育過程中免疫活性具有明顯的發(fā)育時期相關(guān)性[17]，而熒光定量表達分析結(jié)果表明，硫氧還蛋白在黃粉甲不同發(fā)育階段的表達量不同，在蛹中表達量最高，說明硫氧還蛋白在黃粉甲不同發(fā)育階段所起的作用不一樣。有研究發(fā)現(xiàn)，逆境因子能夠?qū)е律矬w的氧化損傷[18-19]，而細胞內(nèi)過多的活性氧和氧化劑是由一系列抗氧化酶組成的初期防御體系來清除的[20]。已有研究表明，家蠶硫氧還蛋白基因的轉(zhuǎn)錄明顯受到高低溫和病原微生物等的誘導[5]，中華蜜蜂硫氧還蛋白基因的表達也受到多種逆境條件的誘導[6-8]。昆蟲在受到逆境壓力時體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，其接著作用于昆蟲體內(nèi)的一些生物大分子，硫氧還蛋白可能通過清除過量的活性氧來保護昆蟲的正常生長發(fā)育[21-22]。熒光定量表達分析結(jié)果表明，在被寄生的黃粉甲蛹內(nèi)硫氧還蛋白基因的表達量均明顯高于未被寄生的，引起這種表達量變化的機理有可能是管氏腫腿蜂在寄生黃粉甲蛹時致使其氧化損傷，而硫氧還蛋白起了消弱此現(xiàn)象的作用，推測硫氧化蛋白參與了黃粉甲體內(nèi)抗氧化防御，而具體的調(diào)控機制有待研究。

[1] Powis G, Montfort W R. Properties and biological activities of thioredoxins[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2001, 41(1): 261-295.

[2] Wahl M C, Irmler A, Hecker B, et al. Comparative structural analysis of oxidized and reduced thioredoxin fromDrosophilamelanogaster[J]. J Mol Biol, 2005, 345(5): 1119-1130.

[3] Maulik N, Das D K. Emerging potential of thioredoxin and thioredoxin interacting proteins in various disease conditions[J]. Biochim Biophys Acta, 2008, 1780(11): 1368-1382.

[4] Tsuda M, Ootaka R, Ohkura C, et al. Loss of Trx-2 enhances oxidative stress-dependent phenotypes inDrosophilamelanogaster[J]. FEBS Lett, 2010, 584(15): 3398-3401.

[5] Kim Y J, Lee K S, Kim B Y, et al. Thioredoxin from the silkworm,Bombyxmori: cDNA sequence, expression, and functional characterization[J]. Comp Biochem Physiol, 2007, 147(3): 574-581.

[6] Lu W J, Kang M J, Liu X F, et al. Identification and antioxidant characterisation of thioredoxin-like1 fromApisceranacerana[J]. Apidologie, 2012, 43(3): 737-752.

[7] Yao P, Hao L, Wang F, et al. Molecular cloning, expression and antioxidant characterisation of a typical thioredoxin gene (AccTrx2) inApisceranacerana[J]. Gene, 2013, 527(1): 33-41.

[8] Yao P, Chen X, Yan Y, et al. Glutaredoxin 1, glutaredoxin 2, thioredoxin 1, and thioredoxin peroxidase 3 play important roles in antioxidant defense inApisceranacerana[J]. Free Radic Biol Med, 2014, 68(1): 335-346.

[9] Zhu J Y, Yang P, Zhang Z, et al. Transcriptomic immune response ofTenebriomolitorpupae to parasitization bySclerodermaguani[J]. PLoS One, 2013,8(1): e54411.

[10] Zhu J Y, Wu G X, Zhang Z. Upregulation of coleoptericin transcription inTenebriomolitorparasitized bySclerodermaguani[J]. J Asia-Pac Entomol, 2014, 17(3): 339-342.

[11] Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, et al. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Res, 1997, 25(24): 4876- 4882.

[12] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.[13] Tang Q Y, Zhang C X. Data Processing System (DPS) software with experimental design, statistical analysis and data mining developed for use in entomological research[J]. Insect Science, 2013, 20(2): 254-260.

[14] 張松斗, 張博宇, 申忠健, 等. 棉鈴蟲硫氧還蛋白類似基因HaTrx-like的分子鑒定和抗逆特征[J]. 應(yīng)用昆蟲學報, 2015, 52(3): 538-548.

[15] Arrese E L, Soulages J L. Insect fat body: energy, metabolism, and regulation[J]. Annual Review of Entomology, 2009, 55(1): 207-225.

[16] Enayati A A, Ranson H, Hemingway J. Insect glutathione transferases and insecticide resistance[J]. Insect Mol Biol, 2005, 14(1): 3-8.

[17] 吳必順. 黃粉蟲發(fā)育過程中免疫活性差異研究[D]. 蘇州: 蘇州大學, 2010.

[18] Lushchak V I. Environmentally induced oxidative stress in aquatic animals[J]. Aquat Toxicol, 2011, 101(1): 13-30.

[19] Kottuparambil S, Shin W, Brown M T, et al. UV-B affects photosynthesis, ROS production and motility of the freshwater flagellate,EuglenaagilisCarter[J]. Aquat Toxicol, 2012, 122/123(122/123): 206-213.

[20] Switala J, Loewen P C. Diversity of properties among catalases[J]. Arch Biochem Biophys, 2002, 401(2): 145-154.

[21] Grant C M. Role of the glutathione/glutaredoxin and thioredoxin systems in yeast growth and response to stress conditions[J]. Mol Microbiol, 2001, 39(3): 533-541.

[22] Radyuk S N, Klichko V I, Spinola B, et al. The peroxiredoxin gene family inDrosophilamelanogaster[J]. Free Radic Biol Med, 2001, 31(9): 1090-1100.

(責任編輯 張 坤)

Transcriptional Regulation ofTenebriomolitorThioredoxin Gene bySclerodermaguaniParasitization

Huang Jingmei1, Liu Naiyong1, Zhang Zubing2, Yang Bin1, Zhu Jiaying1

(1. Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province, College of Forestry, Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650224, China; 2. Institute of Tropical Crops Science Research of Yunnan Province, Jinghong Yunnan 666100, China)

Thioredoxin proteins maintain the stability of the redox state and are involved in essential antioxidation and oxidation reduction process regulation in insects. In order to reveal the functions of the thioredoxin proteins gene and its transcription regulated bySclerodermaguaniparasitization, this study cloned the full-length cDNA sequence of thioredoxin gene fromTenebriomolitorby rapid amplification of cDNA ends strategy. The full-length cDNA sequence of thioredoxin gene was 531 bp, and contained a 318 bp open reading frame encoding 106 amino acid residues, with 3′ and 5′ untranslated regions of 95 bp and 119 bp,respectively.Its predicted molecular weight and isoelectric point were 11.97 kDa and 4.22, respectively. Its deduced amino acid sequence contained a highly conserved CGPC active site at the N-terminus. Multiple sequence alignment analysis showed that thioredoxin ofT.molitorshared over 60% amino acid identities with those of other insects. qPCR analysis showed that thioredoxin gene was expressed at different developmental stages ofT.molitorwith the highest expression in the pupa and the lowest in the adult. This gene highly expressed in fat body of pupae. After 6 h parasitization byS.guani, the relative expression of thioredoxin gene was obviously up-regulated.

Tenebriomolitor, thioredoxin, gene cloning, sequence analysis,Sclerodermaguani

10. 11929/j. issn. 2095-1914. 2016. 06. 018

2016-04-19

國家自然科學基金項目 (31260449) 資助；云南省林學一級學科博士點建設(shè)項目 (林學學位授權(quán)學科項目經(jīng)費) 資助；云南省中青年學術(shù)與技術(shù)帶頭人后備人才項目 (2013HB077) 資助；云南省高校森林有害生物科技創(chuàng)新團隊項目資助。

朱家穎 (1984—)，男，博士，教授。研究方向：昆蟲生理生化與分子生物學。Email: jyzhu001@gmail.com。

S763.43; S767.3

A

2095-1914(2016)06-0112-05

第1作者：黃鏡梅 (1992—)，女，碩士生。研究方向：昆蟲生理與分子生物學。Email: 1025682082@qq.com。