全基因組預(yù)測枯草芽孢桿菌BEST195的分泌蛋白

任文來 韓長志 劉 通 夏秀芹

(1. 廊坊市文安縣農(nóng)業(yè)局，河北 廊坊 065800；2. 西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224)

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全基因組預(yù)測枯草芽孢桿菌BEST195的分泌蛋白

任文來1韓長志2劉 通1夏秀芹1

(1. 廊坊市文安縣農(nóng)業(yè)局，河北 廊坊 065800；2. 西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224)

枯草芽孢桿菌BEST195作為納豆菌的一種，是納豆生產(chǎn)的重要菌株之一。利用SignalP、ProtComp、TMHMM、Phobius、LipoP、TatP等預(yù)測程序?qū)υ摼? 456條蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分泌蛋白找尋，同時，對上述分泌蛋白的氨基酸分布、信號肽長度大小、信號肽切割位點等性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：枯草芽孢桿菌含有分泌蛋白102個，其氨基酸長度、信號肽長度與植物病原菌不同；信號肽切割位點屬于A-X-A類型，與其他已經(jīng)報道的植物病原真菌、細(xì)菌以及卵菌中分泌蛋白信號肽切割位點一致。通過上述生物信息學(xué)分析方法有效地實現(xiàn)了枯草芽孢桿菌BEST195分泌蛋白的預(yù)測，分泌蛋白的信號肽切割位點具有物種保守型特點。

枯草芽孢桿菌；分泌蛋白；信號肽；預(yù)測

枯草芽孢桿菌BEST195 (Bacillussubtilissubsp.nattoBEST195) 為納豆菌的一種，是日本三菱化學(xué)生命研究所從納豆中分離到的重要工業(yè)菌株[1]。納豆菌屬于枯草芽孢桿菌屬，與該屬中其他枯草芽孢桿菌不同，其具有將大豆發(fā)酵為納豆的作用，可以產(chǎn)生較多的多聚γ-谷氨酸(γPGA)，這是形成粘性聚合物的主要組成成分[2]。國內(nèi)外學(xué)者對納豆菌的研究主要集中在代謝產(chǎn)物納豆激酶[3]、抗菌作用[4]、微生態(tài)制劑[5]等方面。

目前，學(xué)術(shù)界關(guān)于稻瘟菌[6]、大麗輪枝菌[7]、致病疫霉[8]等植物病原菌的分泌蛋白已經(jīng)明確，并逐漸成為植物病理學(xué)研究的熱點之一。然而，國內(nèi)對于細(xì)菌分泌蛋白的預(yù)測研究尚不夠深入，涉及諸多革蘭氏陰性菌：香蕉細(xì)菌性軟腐病菌[9]、茄青枯病菌[10]以及丁香假單胞桿菌番茄致病變種[11]等。同時，隨著枯草芽孢桿菌BEST195全基因組序列的公布[12-13]，對其開展了全基因組與其他納豆菌的比較基因組學(xué)分析，明確納豆菌中鞭毛蛋白FliF與yPGA的產(chǎn)生有直接關(guān)系，但yPGA的產(chǎn)生與否并不能作為枯草芽孢桿菌是否具有發(fā)酵功能的預(yù)測指標(biāo)[2]。作為影響枯草芽孢桿菌yPGA產(chǎn)量的重要功能蛋白，納豆菌中分泌蛋白具有十分重要的作用，然而，尚未見到對重要工業(yè)生產(chǎn)菌株——枯草芽孢桿菌BEST195分泌蛋白的預(yù)測報道，因此，開展該菌分泌蛋白的預(yù)測具有重要的理論意義。

基于細(xì)菌分泌蛋白所具有的主要特征，本研究利用SignalP、ProtComp、TMHMM、Phobius、LipoP、TatP等在線生物信息學(xué)分析程序?qū)莶菅挎邨U菌BEST195進(jìn)行分泌蛋白預(yù)測，以期為深入解析分泌蛋白在發(fā)揮發(fā)酵作用的功能解析提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 枯草芽孢桿菌BEST-195數(shù)據(jù)來源

B.subtilissubsp.nattoBEST195序列均來源于美國國立衛(wèi)生院 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)[13]，其BioProject ID分別為PRJNA183001。

1.2 分泌蛋白確定方法

1.2.1 N-端信號肽預(yù)測

利用SignalP v4.1在線分析實現(xiàn)[14]。

1.2.2 亞細(xì)胞定位預(yù)測

對含有N-端含有信號肽的蛋白質(zhì)序列，利用ProtCompB亞細(xì)胞定位預(yù)測實現(xiàn) (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=pcompb&group=programs&subgroup=proloc)。

1.2.3 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用TMHMM v2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 和Phobius[15]。

1.2.4 信號肽酶識別位點及脂蛋白預(yù)測

利用LipoP v1.0[16]和TatP v1.0[17]分別對蛋白進(jìn)行信號肽酶識別位點、脂蛋白的預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌BEST195中典型分泌蛋白的數(shù)量特征

信號肽預(yù)測結(jié)果表明，僅有205個序列在N端含有典型的信號肽序列。進(jìn)一步開展細(xì)胞定位情況分析發(fā)現(xiàn)，87個蛋白質(zhì)分泌至胞外，30個蛋白尚未預(yù)測出定位情況，88個蛋白分泌到胞內(nèi)，其中，轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)的蛋白數(shù)量分別為77、11個。通過對103個蛋白 (包括87個轉(zhuǎn)運到胞外的蛋白和30個尚未預(yù)測出定位情況的蛋白) 進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示，56個蛋白質(zhì)不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，另外56個蛋白含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，還有2個蛋白含有2個跨膜結(jié)構(gòu)域。由于TMHMM v2.0程序并不能完全對信號肽序列和所屬跨膜域區(qū)序列進(jìn)行區(qū)分，故選擇112個蛋白質(zhì)序列 (包括不含有任何跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白以及含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白) 進(jìn)行后續(xù)分析。通過Phobius預(yù)測，結(jié)果顯示gi 674710112、gi 674709268、gi 674708909共3個蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中，獲得109個分泌蛋白。通過對上述蛋白質(zhì)序列進(jìn)行LipoP分析，明確gi 674709563、gi 674709457為脂蛋白，通過排除及TatP分析，明確gi 674709457、674709254、428281022、gi 674709219、gi 428279469、gi 428280358共6個蛋白具有典型的tat信號肽，并獲得102個分泌蛋白；因此，通過上述生物信息學(xué)在線程序?qū).subtilissubsp.nattoBEST195中4456條蛋白質(zhì)序列進(jìn)行預(yù)測分析，最終獲得了102個具有典型特征的分泌蛋白。

對上述分泌蛋白氨基酸大小進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，這些分泌蛋白集中于101～500 aa之間，所占比例為84.31%，尤以201～300 aa分泌蛋白最多，所占比例為32.35% (圖1)。

2.2 枯草芽孢桿菌BEST195典型分泌蛋白的信號肽特征

對上述分泌蛋白所含的信號肽長度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)分泌蛋白中信號肽長度以27個aa的蛋白居多，所占比例為12.75%；分泌蛋白中的信號肽長度多集中于23～32個aa，上述蛋白質(zhì)數(shù)量最多，所占比例為72.55% (圖2)。

圖1 枯草芽孢桿菌BEST195分泌蛋白氨基酸長度分析

Fig.1 Analysis of protein sequences with different length of amino acid inB.subtilissubsp.nattoBEST195

圖2 枯草芽孢桿菌BEST195分泌蛋白信號肽長度分析

Fig.2 Analysis of protein sequences with different length of signal peptide inB.subtilissubsp.nattoBEST195

此外，對分泌蛋白信號肽的切割位點-3位到+3位進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)位于-3位、-2位、-1位、1位、2位、3位最多的氨基酸分別為A、S、A、A、E、K，所占比例分別為50.98%、26.47%、83.33%、32.35%、16.67%、13.73% (表1)。位于信號肽切割位點之前的-3位、-2位、-1位的氨基酸組成為A-S-A，屬于SPⅠ型信號肽識別位點[18]，與前人通過對致病疫霉 (Phytophthorainfestans)[8]、禾谷炭疽菌 (Colletotrichumgraminicola)[19]、粗糙脈孢菌 (Neurosporacrassa)[20]等分泌蛋白具有的信號肽酶切位點類型相同。上述分析結(jié)果表明，真菌、細(xì)菌、卵菌分泌蛋白進(jìn)行信號肽序列識別、切割的信號肽酶類型多為Ⅰ型，具有物種保守性特點。

同時，對組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在信號肽中的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，A所占比例最大，為14.72%；其次為L，所占比例為14.44%；再次為K、S、M、V、F、I、G、T、C、R、N、P、Q、E、Y、W、H、D，所占比例分別為9.03%、9.03%、7.36%、7.22%、6.42%、6.35%、5.96%、5.76%、2.27%、1.95%、1.81%、1.78%、1.46%、1.26%、0.98%、0.80%、0.73%、0.66% (圖3)。

表1 枯草芽孢桿菌BEST195分泌蛋白信號肽切割位點-3～+3氨基酸分布情況

圖3 20種氨基酸在枯草芽孢桿菌BEST195分泌蛋白信號肽中所占比例情況

Fig.3 The frequency of 20 amino acid residues of signal peptides in secreted proteins inB.subtilissubsp.nattoBEST195

3 結(jié)論與討論

近些年，學(xué)術(shù)界對植物病原真菌[6,7,19-21]、卵菌[8,22]等真核生物分泌蛋白的預(yù)測較多，同時，對屬于革蘭氏陰性細(xì)菌的植物病原細(xì)菌研究也較多[9-11]，前期本研究小組也對一株生防菌——枯草芽孢桿菌XF-1的分泌蛋白進(jìn)行了預(yù)測 (未發(fā)表數(shù)據(jù))。

此外，前期研究發(fā)現(xiàn)，植物病原真菌、卵菌、細(xì)菌所含分泌蛋白的數(shù)量不等[19]，所占比例也不同，其中，植物病原真菌分泌蛋白在全蛋白中的比例為3.65%～9.58%[19,23-24]，卵菌所含分泌蛋白所占比例為2.96%～4.01%[8,22]，細(xì)菌所含分泌蛋白所占比例為5.05%～12.09%[9-11,25]。除劉雅婷等[11]、陳建森等[25]對細(xì)菌分泌蛋白的預(yù)測較為寬泛，有待于進(jìn)一步進(jìn)行驗證外，細(xì)菌分泌蛋白所占全蛋白的比例為5.05%～5.41%。與植物病原真菌、細(xì)菌、卵菌分泌蛋白所占比例不同，本研究發(fā)現(xiàn)的102個分泌蛋白，僅占全蛋白數(shù)量的2.29%，明顯低于植物病原菌。同時，本研究小組明確褐環(huán)乳牛肝菌中的分泌蛋白所占比例也僅為1.79% (未發(fā)表數(shù)據(jù))，以及莖瘤固氮根瘤菌分泌蛋白所占比例為1.21%[26]，結(jié)合本研究結(jié)果，推測與益生菌、植物外生菌根菌不同，植物病原菌在與植物長期的互作過程中，進(jìn)化出較多的分泌蛋白，共同操控植物。

本研究利用諸多生物信息學(xué)預(yù)測程序總共獲得102個分泌蛋白，明顯低于植物病原真菌、細(xì)菌和卵菌中分泌蛋白的數(shù)量和比例，值得一提的是，上述研究所獲得的分泌蛋白均為典型分泌蛋白，利用SecretomeP 2.0[27]對于4 251個不具有信號肽序列的蛋白進(jìn)行非典型分泌蛋白預(yù)測，明確非典型分泌蛋白序列有1 342個 (未發(fā)表數(shù)據(jù))；同時，本研究所獲得的典型分泌蛋白在氨基酸長度、信號肽長度方面也與前期所研究的植物病原菌報道不相同，而無論是植物病原真菌，還是植物病原細(xì)菌、卵菌，抑或是本研究的工業(yè)化納豆生產(chǎn)菌，其信號肽酶切位點類型均為AXA，表明信號肽的酶切位點類型具有物種保守性特點。該研究為深入開展枯草芽孢桿菌發(fā)酵機制的解析提供了理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 張 坤)

Prediction for Secreted Proteins fromBacillussubtilissubsp.nattoBEST195 Genome

Ren Wenlai1, Han Changzhi2, Liu Tong1, Xia Xiuqin1

(1. Agriculture Bureau of Wen′an County, Langfang Hebei 065800, China; 2. The Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province, College of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming Yunnan 650224, China)

Bacillussubtilissubsp.nattoBEST195 is one of the important strains produced natto. To identify the secreted protein fromB.subtilisand clearly it′s characteristic. 4 456 protein sequences inB.subtiliswas analyzed to find the secreted protein using the program including SignalP, ProtComp, TMHMM, Phobius, LipoP and TatP. Meanwhile, the distribution of amino acids, the length of signal peptide as well as the signal peptide cleavage site of secreted protein was analyzed. 102 secrete proteins were found inB.subtilis. And the length of amino acids and the signal peptide were different the plant pathogens. The signal peptide cleavage site belongs to AXA type, which was same as other plant pathogenic fungi, bacteria and oomycete. Through the above bioinformatics analysis, the predicted secreted proteins can effectively achieve inB.subtilis, and the type of signal peptide cleavage site have consistent with other secreted proteins from different species.

Bacillussubtilissubsp.natto, secreted protein, signal peptide, prediction

10. 11929/j. issn. 2095-1914. 2016. 06. 017

2016-01-09

國家自然科學(xué)基金項目 (31560211) 資助；云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室開放基金項目 (ZK150004) 資助；云南省優(yōu)勢特色重點學(xué)科生物學(xué)一級學(xué)科建設(shè)項目 (50097505) 資助；云南省高校林下生物資源保護及利用科技創(chuàng)新團隊 (2014015) 資助；云南省教育廳科學(xué)研究基金項目 (2014Y330) 資助。

韓長志 (1981—)，男，博士，副教授。研究方向：經(jīng)濟林木病害生物防治與真菌分子生物學(xué)。Email: hanchangzhi2010@163.com。

S759.81

A

2095-1914(2016)06-0106-06

第1作者：任文來 (1979—)，男，學(xué)士。研究方向：農(nóng)作物病蟲害防治與新品種推廣。Email: lfwazfd@126.com。