L-精氨酸對全血血小板膜GP2b/3a表達(dá)影響與臨床檢驗(yàn)學(xué)研究

尚曉東劉曉華宋明慧崔乃凡楊 琨

（1 遼寧省遼陽市康復(fù)醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 遼陽 111000；2 遼寧省遼陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 遼陽 111000；3 遼寧省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016）

L-精氨酸對全血血小板膜GP2b/3a表達(dá)影響與臨床檢驗(yàn)學(xué)研究

尚曉東1劉曉華2宋明慧2崔乃凡2楊 琨3

（1 遼寧省遼陽市康復(fù)醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 遼陽 111000；2 遼寧省遼陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 遼陽 111000；3 遼寧省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016）

目的 研究分析L-精氨酸對正常人血小板膜GP2b/3a表達(dá)的影響與臨床意義。方法 建立全血血小板膜GP2b/3a表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)（FCM）測定方法，觀察L-精氨酸在靜息和活化狀態(tài)下對正常人血小板膜GP2b/3a表達(dá)的影響。結(jié)果 L-精氨酸對靜息血小板膜GP2b/3a表達(dá)無明顯影響；而顯著抑制凝血酶、膠原活化的血小板膜GP2b/3a的上調(diào)表達(dá)，且該效應(yīng)呈劑量和時間依賴性。結(jié)論 L-精氨酸可抑制血小板膜GP2b/3a的表達(dá)。

L-精氨酸；GP2b/3a；流式細(xì)胞術(shù)；檢驗(yàn)分析

近來年研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮（NO）具有多種生物學(xué)活性，如舒張血管、抑制血小板活性[1-2]等。目前有關(guān)一氧化氮對血小板膜糖蛋白表達(dá)的影響報道甚少，而L-精氨酸（一氧化氮的供體）體外作用于全血血小板的研究尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測全血血小板膜糖蛋白GP2b/3a。表達(dá)的方法，觀察體外L-精氨酸在不同因素作用下對血小板膜GP2b/3a表達(dá)的影響及作用機(jī)制，為尋找防治心血管疾病方法提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：40例健康青年人[男女各20例，18～32歲，平均年齡（26.2±1.8）歲]，2周內(nèi)未服用任何藥物。

1.2 主要試劑：L-精氨酸（100毫克/瓶，干粉，Sinma公司）：兔抗人纖維蛋白原抗體（1∶5，F(xiàn)g-Ab，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院），純化小鼠ⅠgG（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院），異硫氰酸熒光素（FⅠTC）標(biāo)記的羊抗兔ⅠgG（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；HEPES（Sigma公司）HEPES緩沖液（單位mmol/L：NaCl145，KCl 5，MgSO4，1，HEPES10，pH7.4）；凝血酶（Sigma公司）；膠原（蘇州醫(yī)學(xué)院血栓與止血室）；2%福爾馬林鹽液（37%福爾馬林鹽濃2 mL與1000 mL生理鹽水混勻）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法：參照J(rèn)anes和武藝[3-4]等方法，使用兔抗人纖維蛋白原抗體，建立全血血小板膜GP2b/3a表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)（FCM）測定方法。

采用真空采血器（WZK-9NC型，含3.8%枸椽酸鈉）由專人經(jīng)肘正中靜脈取清晨空腹血液（不扎止血帶，l次采血成功），棄去首2 mL，采集l mL脈血（血液∶抗凝劑＝9∶l）。靜置2～3 min，取5 μL全血

分別加至3支含50 μL HEPES緩沖液的1.5 mL離心管中。其中，1號管不含激動劑，2號管含0.5 U/mL凝血酶10 μL，3號管含100 μg/mL膠原10 μL，室溫下孵育20 min后，于各管中分別加入飽和濃度的Fg-Ab（l∶5）10 μL和FⅠTC-ⅠgG（l∶5）10 μL，各孵育20 min，之后用2%福爾馬林鹽液1 mL固定20 min，取l mL樣品入FCM專用測試管內(nèi)測定靜息相、活化相全血血小板膜GP2b/3a表達(dá)，作自身對照。用同樣方法檢測L-精氨酸（1.0 mmol/L）對靜息相、活化相全血血小板膜GP2b/ 3a表達(dá)和L-精氨酸在0、0、1、1.0、10 mmol/L濃度下對0.5 U/mL凝血酶誘導(dǎo)的血小板膜GP2b/3a表達(dá)的量效關(guān)系以及L-精氨酸孵育0、10、20、30 min后對0.5 U/mL凝血酶誘導(dǎo)的血小板膜GP2b/3a表達(dá)的時效關(guān)系?？瞻讓φ战M用緩沖液代替GP2b/3a，陰性對照組用純化小鼠ⅠgG代替GP2b/3a。

1.4 觀察和測量：應(yīng)用流式細(xì)胞儀（美國EPⅠCS ELⅠTE型）對全血血小板膜GP2b/3a進(jìn)行熒光定量，設(shè)置空白對照組用緩沖液取代GP2b/3a，陰性對照組用ⅠaG代替GP2b/3a，以消除本底熒光的影響。每例樣本測定10000個血小板，測量每例樣本血小板平均熒光強(qiáng)度（MFⅠ），單位為陽性熒光道數(shù)，以此作為血小板膜GP2b/3a的表達(dá)量，凡大于正常人血小板膜表面熒光強(qiáng)度的99%的血小板定為陽性血小板，即為活化血小板，陽性血小板百分率（FC%）＝陽性血小板數(shù)/10000。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中配對t檢驗(yàn)、多個樣本均數(shù)比較方差分析、兩兩比較SNK方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.Ⅰ L-精氨酸對正常人全血血小板膜GP2b/3a表達(dá)（FC%）的影響：表1結(jié)果顯示：靜息血小板膜GP2b/3a表達(dá)含量（FC%）很低，凝血酶、膠原活化后GP2b/3a表達(dá)顯著增加（P＜0.05。L-精氨酸（lmmol/L）對靜息血小板膜表達(dá)無明顯影響（P＞0.05）。但顯著抑制凝血酶、膠原活化誘導(dǎo)的血小板膜GP2b/3a（P＜0.05）。

表1 L-精氨酸對血小板膜GP2b/3a表達(dá)（FC%）的影響（）

表1 L-精氨酸對血小板膜GP2b/3a表達(dá)（FC%）的影響（）

注：#P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.05

Group resting thrombin collagen Control 11.21±1.35 77.23±1.90** 73.35±1.20** L-arg 11.60±1.31# 41.52±1.66* 38.80±1.78*

2.2 L-精氨酸對凝血配誘導(dǎo)的血小板膜GP2b/3a表達(dá)的量效、時效關(guān)系：表2結(jié)果顯示，L-精氨酸在0-10mmol/L范圍內(nèi)對凝血酶誘導(dǎo)的GP2b/3a表達(dá)具有抑制作用，且效應(yīng)該呈劑量依賴性，線性關(guān)系良好（R2=0.9635），方差分析表明，各組之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。SNK法顯示各級間兩兩比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。表3結(jié)果表明，1 mmol/L的L-精氨酸與全血血小板孵育0～30 min范圍內(nèi)對凝血誘導(dǎo)的GP2b/3a表達(dá)具有抑制作用，且效應(yīng)呈時間依賴性，線性關(guān)系良好（R2=0.8935），方差分析表明，各組之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表2 L-精氨酸對凝血酶誘導(dǎo)的GP2b/3a表達(dá)的量-效關(guān)系（）

表2 L-精氨酸對凝血酶誘導(dǎo)的GP2b/3a表達(dá)的量-效關(guān)系（）

注：n=10，#P＜0.05vs group1，*P＜0.05vs group2，△P＜0.05vs group3

GROUPS GPⅡb/Ⅲa Group1(0mmol/L) 58.40±1.20 Group2(0.1mmol/L) 47.10±1.50#Group3(1mmol/L) 32.42±1.14#* Group4(10mmol/L) 28.02±1.27#*△

表3 L-精氨酸對凝血酶誘導(dǎo)的GP2b/3a表達(dá)的時-效關(guān)系（）

表3 L-精氨酸對凝血酶誘導(dǎo)的GP2b/3a表達(dá)的時-效關(guān)系（）

注：n=10，#P＜0.05vs group1， P＜0.05vs group2，△P＜0.05vs group3

GROUPS GPⅡb/Ⅲa Group1(0 min) 58.40±1.20 Group2(10 min) 54.90±3.18#Group3(20 min) 32.42±1.14#* Group4(30 min) 29.08±1.10#*△

3 討 論

L-精氨酸為合成NO的前體，可通過NO途徑抑制血小板活性，研究表明，血小板表面具有L-arg運(yùn)輸系統(tǒng)，給予L-精氨酸后血小板合成NO增加77%。本研究首次在體外證明，L-精氨酸對正常青年人經(jīng)血小板激動劑凝血酶和膠原活化的全血血小板GP2b/3a的表達(dá)具有抑制作用，并呈時間和劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)為全血中研究NO對血小板的作用機(jī)制提供了一條新途徑，同時也為飲食中補(bǔ)充適量精氨酸防治心血管病提供了理論依據(jù)。

[1] 慕容洋洋,邊彤,蘇寧. L-精氨酸對全血血小板膜GP2b/3a表達(dá)影響與檢驗(yàn)學(xué)研究[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,2015,38(3):166-168.

[2] 白繼文,王長印.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)問答[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2008: 161-169.

[3] 陳杰,孫靜,李華麗.L-精氨酸對血小板膜GP2b/3a表達(dá)影響的臨床檢驗(yàn)學(xué)研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2015,38(3):31-33.

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1671-8194（2016）32-0092-02