CXCR4抑制劑AMD3100對非小細胞肺癌細胞侵襲轉移的影響

樊冀閩 鄭正榮

（福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，福建 泉州 362000）

CXCR4抑制劑AMD3100對非小細胞肺癌細胞侵襲轉移的影響

樊冀閩 鄭正榮

（福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，福建 泉州 362000）

目的 探討CXCR4抑制劑AMD3100對非小細胞肺癌95D細胞侵襲轉移能力的影響。方法 分別采用不同濃度（0、10、25、50、100 nmol/L）AMD3100處理高表達CXCR4的非小細胞肺癌95D細胞24、48、72和96 h后用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測增殖抑制率變化，并用Transwell小室內(nèi)法檢測不同濃度AMD3100處理48、96 h后的95D細胞侵襲及遷移能力變化。結果 AMD3100可不同程度抑制非小細胞肺癌95D細胞增殖，且抑制效應呈濃度依賴性；AMD3100可縮短95D細胞遷移距離和減少穿膜細胞數(shù)（P＜0.05），其效應亦呈濃度依賴性。結論 CXCR4抑制劑AMD3100可抑制非小細胞肺癌95D細胞的侵襲、轉移能力。

CXCR4抑制劑;非小細胞肺癌;侵襲轉移;

趨化因子受體（chemokine receptor）在正常的生理狀態(tài)和和非正常生理狀況下都有著重要的作用，它們是一類含有七個跨膜區(qū)的G蛋白藕聯(lián)受體，表達于不同類型細胞上，通過與趨化因子結合的而表達其功能[1]。趨化因子及趨化因子受體廣泛表達于多種腫瘤細胞，并受趨化因子及其受體網(wǎng)絡的調(diào)控[2]。趨化因子受體CXCR4與腫瘤的侵襲生長及轉移關系的研究正成為一個新的熱點。趨化因子CXC亞家族的受體有一位成員——CXCR4，它與其特異性配體相作用可觸發(fā)細胞內(nèi)多種信號傳導，從而介導細胞發(fā)揮各種功能行為，包括有造血干細胞的歸巢、炎性細胞的移動等諸多各種生理和病理過程[3]。國內(nèi)外的前期研究發(fā)現(xiàn)趨化因子受體CXCR4及其配體SDF-1α（CXCL12）在多種腫瘤細胞上有所表達，并有著差異性，且對腫瘤生物學行為有著重要調(diào)節(jié)的作用。

有研究證實CXCR4在肺癌組織存在差異性表達，是肺癌細胞表面重要的功能分子。CXCR4在侵襲和轉移能力較強的腫瘤細胞中呈現(xiàn)出高表達，且與腫瘤分期、是否淋巴結轉移呈現(xiàn)相關性[4]。AMD3100是CXCR4的特異性抑制劑，是與CXCR4結合最有效的小分子非肽類抑制劑，它通過與CXCR4第二膜外環(huán)的負電荷區(qū)域結合，阻斷趨化因子受體CXCR4與其配體相結合，從而起到抑制SDF-1/CXCR4軸發(fā)揮作用。本研究應用CXCR4特異性抑制劑AMD3100抑制SDF-1/CXCR4軸，探討其對非小細胞肺癌細胞侵襲轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器：小牛血清、培養(yǎng)基胰蛋白酶1640購自美國Gibco公司；AMD3100購自Sigma公司；非小細胞肺癌95D細胞購自中國科學院上海細胞所；四甲基偶氮唑鹽（MTT）二甲基亞砜（DMSO）購自美國Fluka公司。儀器設備：ELX800型全自動酶標儀（Bio-tek公司美國）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Forma公司美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)95D細胞株行常規(guī)培養(yǎng)：含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基的25 mL培養(yǎng)瓶中，每3～5 d傳代1次，置于37 ℃CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)成功順利傳代后，取對數(shù)生長期細胞進行下一步實驗步驟。

1.3 MTT檢測：以1×10/mL細胞濃度，取對數(shù)生長期細胞，每孔加入

100 μL，接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃ 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，時間期限為24 h，細胞貼壁之后，加入（0、10、25、50、100 nmol/L）不同濃度的AMD3100，在培養(yǎng)24、48、72和96 h后的時間里，每孔逐次加入（20 μL/孔）MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，靜置10 min后，在酶標儀上檢測各孔的吸光數(shù)值（A）。按以下公式計算細胞增殖抑制率（%）=（1－A10～100 nmol/L/A0 nmol/L）×100%。（每個濃度均設平行重復6孔，并重復實驗3次。）

1.4 人工劃痕實驗：取經(jīng)過不同濃度梯度CXCR4抑制劑AMD3100處理后48、96 h的細胞，分別接種于6孔板中（以5×105/孔的密度），每組設置2個復孔，常規(guī)培養(yǎng)至形成細胞單層，接著用移液器吸頭在培養(yǎng)板底部劃痕，以倒置顯微鏡觀察、拍攝劃痕邊緣區(qū)域的情況并測量、記錄其相對距離。

1.5 Transwell小室內(nèi)法測定腫瘤細胞的侵襲能力：分別取不同濃度梯度CXCR4抑制劑AMD3100處理后48、96 h的95D細胞，用DMEM清洗3遍，以含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細胞至5×105個/mL，在Transwell小室的上室加入200 μL細胞懸液，在下室中加入600 μL含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵24 h，用棉簽輕輕擦拭，去除Transwell小室上室的細胞，移去聚碳酸酯膜，倒置，風干。24孔板中加入500 μL含0.1%結晶紫染色，將Transwell小室放置其中，30 min后取出，大量PBS清洗，高倍顯微鏡下取4個視野，拍照記錄，并計算穿膜細胞數(shù)值。

1.6 統(tǒng)計學分析：采用SPSS18.0版軟件對數(shù)據(jù)進行處理。以P＜0.05為有顯著性差異。組間比較采用配對t檢驗，計量資料采用均數(shù)±標準差計算，多組之間的比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 AMD3100對95D細胞增殖的影響：95D細胞經(jīng)梯度濃度（0、10、2、50、100 nmol/L）AMD3100處理后，分別于不同時間點（處理后24、48、72、96 h）行MTT檢測，結果顯示，AMD3100可抑制95D細胞的增殖，并且顯示在10～100 nmol/L的濃度范圍內(nèi)，細胞增殖率隨作用時間延長而有所升高；而在24～96 h內(nèi)的不同時間時限上，增殖抑制率也伴隨著藥物濃度的逐步增加而逐步升高；總體上AMD3100對肺癌95D細胞的增殖抑制呈現(xiàn)出濃度依賴性和時間依賴性的方式，見圖1。

圖1 不同濃度AMD3100處理95D細胞后的增殖抑制曲線

2.2 AMD3100對95D細胞遷移能力的影響：95D細胞經(jīng)梯度濃度（0、10、2、50、100 nmol/L）AMD3100處理后，分別于處理后48、96 h行劃痕實驗進行檢測，以0 nmol/L抑制劑AMD3100為參考，在10～100 nmol/L濃度梯度范圍內(nèi)，隨著AMD3100濃度的升高，95D細胞的遷移距離逐步縮短，這種效應初步顯示出濃度依賴的方，各種濃度間處理結果差異均具有顯著性（P＜0.05）見表1。

2.3 AMD3100對95D細胞侵襲能力的影響：95D細胞經(jīng)梯度濃度（0、10、2、50、100 nmol/L）AMD3100干預后，分別于處理48、96 h行Transwell檢測，以0 nmol/L AMD3100干預為基線，在濃度為10～100 nmol/L范圍內(nèi)，穿膜細胞數(shù)隨著干預濃度的逐步升高而呈現(xiàn)出細胞數(shù)減少的現(xiàn)象，顯示出濃度依賴性，以上結果均具有顯著性差異（P＜0.05），見表1。

表1 不同濃度AMD3100干預48、96 h后的細胞穿膜能力和遷移能力的改變

3 討 論

趨化因子受體（chemokine receptor）是一類含有七個跨膜區(qū)的G蛋白耦聯(lián)受體，表達于不同類型細胞上，能與其配體趨化因子相結合而發(fā)揮功能作用?？蓞⑴c多種生理和病理過程[1]。過去的研究認為，在G蛋白耦聯(lián)受體的激活、白細胞的歸巢和定向遷移等生理活動中，趨化因子及其受體起重要作用。近年的研究顯示，趨化因受體及配體在血管形成、腫瘤細胞的侵襲轉移過程中也扮演著及其重要的角色。

基礎研究表明腫瘤細胞的侵襲和轉移是導致臨床肺癌患者治療失敗和直接導致死亡的主要原因，也是肺癌細胞重要的惡性生物學行為之一[5]。Nature雜志發(fā)表Muller等[6]的研究，發(fā)現(xiàn)有趨化因子受體家族的CXCR4在人乳腺癌原發(fā)灶及其細胞系均有高表達，而在諸如淋巴結、肺、肝臟和骨髓等乳腺癌最常見的轉移部位，則發(fā)現(xiàn)其配體CXC12呈現(xiàn)高水平地表達，CXCR4可與其特異性配體以鎖鑰方式相結合，進行信號傳導，調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合和偽足形成，從而引起腫瘤細胞的趨化和侵襲，而通過不同方法進行功能性阻斷這一受體則可以抑制腫瘤的轉移。國內(nèi)學者蘇麗萍等人[7]通過鈣離子內(nèi)流實驗發(fā)現(xiàn)趨化因子受體CXCR4的特異性配體趨化因子SDF-1α可以刺激肺癌細胞內(nèi)短暫而迅速的鈣離子釋放，并能引起CXCR4+95D細胞的趨化性運動，而通過AMD3100這CXCR4特異性拮抗劑干預后，細胞的侵襲能力較未藥物干預組有明顯下降。從而推斷抑制劑AMD3100可能競爭性阻斷了趨化因子受體CXCR4與其特異性配體CXCL12的結合，起到了阻斷/CXCR4生物學軸的生理作用，并最終使得細胞內(nèi)外Ca2+動員及其他進一步相關的下游效應受阻，導致細胞的趨化運動能力和侵襲轉移能力的下降[8]。

CXCR4/CXCL12生物學軸在非小細胞肺癌的器官特異性轉移中也發(fā)揮重要作用，已經(jīng)在Phillips等[9]的研究中得到證實，在他的研究中外科手術切除的非小細胞肺癌組織標本及培養(yǎng)的細胞系均不同程度的表達有趨化因子受體CXCR4，在其特異性配體SDF-1α的誘導下，CXCR4陽性的非小細胞肺癌細胞系發(fā)生了趨化反應，而在肝臟、骨髓、腎上腺等肺癌腫瘤易轉移的靶靶器官中，CXCL12的表達比原發(fā)腫瘤、血清中均較高，從而在這些器官中形成了差異濃度梯度，這可能是促進腫瘤細胞的遷徙、轉移的重要因素。我們的研究結果表明AMD3100可抑制95D細胞增殖，且抑制效應呈濃度依賴方式；AMD3100可縮短細胞遷移距離和減少穿膜細胞數(shù)（P＜0.05），其效應呈濃度依賴性。顯示經(jīng)抑制劑AMD3100干預后的95D細胞的遷移距離有所縮短和穿膜細胞數(shù)目有所減少，此結果表明AMD3100可通過封閉細胞表面上表達的趨化因子受體CXCR4，從而抑制細胞的侵襲轉移能力。

總之，本實驗通過對趨化因子受體CXCR4抑制劑AMD3100，封

閉、抑制細胞表面CXCR4表達并可降低細胞惡性生物學活性可為臨床阻斷癌細胞侵襲、轉移提供新的治療靶點，提示趨化因子受體CXCR4抑制劑AMD3100有望作為抗腫瘤侵襲與轉移藥物予以開發(fā)利用，值得進一步深入研究。將會對肺癌癌的侵襲轉移機制有新的認知，從而開辟治療的新思路。

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1671-8194（2016）32-0028-03

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