人體生物性物質(zhì)來源鑒定及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展

鄒凱南，桂　程，曹　禹，楊　帆，周懷谷（.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 00083；.上海市公安局長(zhǎng)寧分局 刑事科學(xué)技術(shù)研究所，上海 00336）

?

人體生物性物質(zhì)來源鑒定及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展

鄒凱南1，桂程2，曹禹1，楊帆1，周懷谷1
（1.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083；2.上海市公安局長(zhǎng)寧分局 刑事科學(xué)技術(shù)研究所，上海 200336）

摘要：犯罪現(xiàn)場(chǎng)中人體生物性物質(zhì)來源鑒定在重現(xiàn)犯罪過程方面發(fā)揮了重要作用，尋找特異性遺傳標(biāo)記鑒定人體不同生物性物質(zhì)來源是近年來法醫(yī)學(xué)工作者研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。本文就目前研究較多的用于人體生物性物質(zhì)來源鑒定的遺傳標(biāo)記進(jìn)行綜述，包括DNA甲基化、mRNA、microRNA、微生物菌群、蛋白質(zhì)等。通過比較不同種類遺傳標(biāo)記鑒定人體生物性物質(zhì)來源的原理和方法，發(fā)現(xiàn)人體不同生物性物質(zhì)來源的鑒定都有其最適合的遺傳標(biāo)記種類，并且可以采用單一遺傳標(biāo)記或聯(lián)合多種遺傳標(biāo)記進(jìn)行檢驗(yàn)。盡管目前各法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方法鑒定人體生物性物質(zhì)來源，但研究開發(fā)一系列成熟可靠的方法區(qū)分人體不同生物性物質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮其法庭證據(jù)作用，將是未來的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學(xué)；遺傳標(biāo)記；綜述［文獻(xiàn)類型］；來源

人體生物性物質(zhì)來源鑒定對(duì)于犯罪過程的重建具有重要意義，在犯罪現(xiàn)場(chǎng)中常見的人體生物性物質(zhì)一般包括血液（外周血、靜脈血、月經(jīng)血）、唾液、精液、陰道分泌液、汗液、淚液、鼻腔分泌液、尿液、皮膚、大腦組織等。鑒定某些人體生物性物質(zhì)來源可以通過肉眼直接識(shí)別，如血液、皮膚等；對(duì)肉眼不能識(shí)別的人體生物性物質(zhì)需要借助針對(duì)性的檢驗(yàn)方法來認(rèn)定，如顯微鏡鏡檢技術(shù)檢測(cè)精子、PSA試紙條檢測(cè)男性前列腺液等。鑒定人體生物性物質(zhì)來源的主要方法是尋找特異性遺傳標(biāo)記，即通過檢測(cè)特異性存在于某種人體生物性物質(zhì)中的遺傳標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)人體不同生物性物質(zhì)的來源鑒定。目前已有一些商品化檢驗(yàn)試劑盒可以實(shí)現(xiàn)此目的，如RSID?-series（美國(guó)IL公司）鑒定人體血液、唾液和精液；Sperm HY-LITERTM（美國(guó)IL公司）鑒定精子；SERATEC?PSA Semiquant（德國(guó)SERATEC公司）鑒定人體精液等。用于人體生物性物質(zhì)來源鑒定的遺傳標(biāo)記主要包括DNA甲基化、信使RNA（messenger RNA，mRNA）、microRNA（miRNA）、微生物菌群、蛋白質(zhì)等。本文就各類遺傳標(biāo)記鑒定人體生物性物質(zhì)來源的基本原理、檢驗(yàn)方法、常見應(yīng)用以及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述。

1　鑒定人體不同生物性物質(zhì)來源的遺傳標(biāo)記

1.1DNA甲基化

1.1.1基本原理

DNA甲基化是指一個(gè)甲基添加到基因組CpG二核苷酸胞嘧啶中5’-碳原子上，形成5’-甲基胞嘧啶，可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和關(guān)閉，與多種生理、病理性疾病相關(guān)［1］。DNA甲基化程度影響各組織的分化表達(dá)，因此DNA甲基化具有組織特異性，組織特異性差異甲基化區(qū)域（tissue specific differentially methylated regions，TDMR）廣泛分布在基因內(nèi)和基因間，利用TDMR的上述特征可以將其應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域判定生物性物質(zhì)來源。

1.1.2應(yīng)用

DNA甲基化遺傳標(biāo)記因其高度組織特異性可用于鑒定精液中的精子細(xì)胞［2-5］、血液［2，5］、唾液［2，5］、陰道分泌液［3，5］、皮膚［2］等。Lee等［3］以同卵雙生子為研究對(duì)象，對(duì)其DNA甲基化進(jìn)行研究，結(jié)果顯示DACT1和USP49均是低甲基化的遺傳標(biāo)記，并具有精液特異性，可有效識(shí)別精液。Wasserstrom等［4］以包括精液、唾液、靜脈血、月經(jīng)血、陰道分泌液在內(nèi)的共135個(gè)樣本和來自以色列警方法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的33個(gè)案件檢材為研究對(duì)象，通過Matrix Laboratory軟件篩選出5個(gè)DNA甲基化遺傳標(biāo)記，分別是Chr11（72085678～72085798）、Chr4 （25287119～25287254）、Chr11（57171095～57171236）、Chr11（1493401～1493538）、Chr19（47395505～47395651），并自行設(shè)計(jì)MSRE識(shí)別的HhaⅠ序列特異性引物，結(jié)果顯示這5個(gè)遺傳標(biāo)記具有精液特異性，可用作精液鑒定。Park等［5］研究選擇了8個(gè)DNA甲基化遺傳標(biāo)記（cg06379435和cg08792630鑒定血液，cg26107890和cg20691722鑒定唾液，cg23521140和cg17610929鑒定精液，cg01774894和cg14991487鑒定陰道分泌液），經(jīng)焦磷酸測(cè)序檢驗(yàn)方法證明這8個(gè)DNA甲基化遺傳標(biāo)記具有高靈敏度和特異性，可以作為鑒定人體生物性物質(zhì)來源的候選遺傳標(biāo)記。Gomes等［6］選擇了 L91762、L68346、L76138、L26688共 4個(gè)DNA甲基化位點(diǎn)，并以甲基化比值（即共同擴(kuò)增的兩個(gè)位點(diǎn)的峰高比值）作為鑒定生物性物質(zhì)來源的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，L91762/L68346和L76138/L26688并不具有組織特異性，在唾液和皮膚中比值相似。而Dan等［2］報(bào)道了L76138與L26688的甲基化比值在精液和皮膚中比在血液和唾液中高，L76138與L26688和L91762與L68346較高的甲基化比值可進(jìn)行皮膚鑒定。因此能否應(yīng)用L76138與L26688和L91762與L68346的甲基化比值鑒定皮膚目前存在爭(zhēng)議。

1.2mRNA

1.2.1基本原理

mRNA是由DNA的一條鏈作為模板轉(zhuǎn)錄而來，所攜帶的遺傳信息能夠指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)。人體不同組織的生物性物質(zhì)中具有特異性基因，找到特異性目的基因，通過RT-PCR檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，以ΔCt值，即ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，作為目的基因在不同生物性物質(zhì)中表達(dá)程度的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。若ΔCt值較低，說明目的基因在此生物性物質(zhì)中高度表達(dá)；若ΔCt值高，說明目的基因在此生物性物質(zhì)中低度表達(dá)，以此篩選出用于人體生物性物質(zhì)來源鑒定的候選基因，進(jìn)而區(qū)分人體不同生物性物質(zhì)來源。

1.2.2應(yīng)用

利用mRNA鑒定人體生物性物質(zhì)來源被國(guó)際上來自不同國(guó)家的法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室所重視，歐洲D(zhuǎn)NA分型工作組（the European DNA Profiling Group，EDNAP）到2015年為止開展了6次國(guó)際間實(shí)驗(yàn)室的聯(lián)合測(cè)試，旨在探究mRNA遺傳標(biāo)記用于人體生物性物質(zhì)來源鑒定的效力和可靠性［7-11］。下面對(duì)用于鑒定血液（外周血和月經(jīng)血）、唾液、精液、陰道分泌液、汗液、皮膚、尿液、鼻腔分泌液等人體生物性物質(zhì)的特異性mRNA遺傳標(biāo)記分別進(jìn)行闡述。

血液的生物性來源鑒定包括外周血和月經(jīng)血的鑒定，EDNAP集合了16個(gè)法醫(yī)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，對(duì)外周血特異性遺傳標(biāo)記PBGD、SPTB和HBB的靈敏度和特異性進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示HBB表達(dá)程度最高，靈敏度為在0.001 μL血液中就可檢測(cè)到該遺傳標(biāo)記，表達(dá)程度最低的是PBGD［7］。月經(jīng)血的特異性mRNA遺傳標(biāo)記是MMP7［12］和MMP11［13］。

唾液的mRNA特異性遺傳標(biāo)記包括FDCSP［14］和HTN3［13］。STATH是否具有特異性目前存在爭(zhēng)議，因其在唾液和鼻腔分泌液中都有表達(dá)［13］。此外，Zubakov等［15］選擇了5個(gè)用于鑒定唾液的mRNA遺傳標(biāo)記（SPRR3、SPRR1A、KRT4、KRT6A和KRT13），結(jié)果顯示在唾液-陰道分泌液混合樣本中出現(xiàn)mRNA遺傳標(biāo)記的交叉反應(yīng)，分析原因可能是由于口腔和陰道黏膜上皮細(xì)胞的生物化學(xué)和組織學(xué)高度相似性導(dǎo)致基因表達(dá)方式高度相似。

精液的mRNA特異性遺傳標(biāo)記包括MSMB、PRM1、PRM2和TGM4。但Richard等［13］發(fā)現(xiàn)PRM2和TGM4也存在于陰道分泌液中，因此PRM2和TGM4能否用于鑒定精液目前存在爭(zhēng)議。

HBD1和MUC4是陰道分泌液鑒定中研究報(bào)道最多的mRNA特異性遺傳標(biāo)記［13］。Cossu等［16］報(bào)道HBD1 和MUC4在48個(gè)婦女的陰道分泌液樣本中均有表達(dá)，且表達(dá)水平與婦女的年齡、身體狀況（如懷孕、采取避孕措施）等無關(guān)，MUC4比HBD1表達(dá)水平更高。但是MUC4和HBD1在唾液中也有表達(dá)，有的樣本同時(shí)表達(dá)，有的只表達(dá)一種mRNA遺傳標(biāo)記，因此通過MUC4和HBD1兩個(gè)mRNA遺傳標(biāo)記中的一種或者兩種不能準(zhǔn)確鑒定陰道分泌液，需要加做其他特異性遺傳標(biāo)記。與HBD1和MUC4不同，MSLN是陰道分泌液特異性更強(qiáng)的mRNA遺傳標(biāo)記，可被用于鑒定陰道分泌液［14］。Hanson等［17］通過RNA測(cè)序方法尋找候選基因，以SFTA2、FUT6、DKK4、IL19、MYOZ1和CYP2B7P1為研究對(duì)象，最終確定MYOZ1和CYP2B7P1在陰道分泌液中具有高靈敏度和特異性，能夠?qū)㈥幍婪置谝号c其他生物性物質(zhì)區(qū)分開，尤其是含上皮細(xì)胞較多的口腔分泌液和皮膚。CYP2B7P1的特異性尤為明顯，且與人體其他生物性物質(zhì)沒有交叉反應(yīng)。

早在幾年前就有學(xué)者研究汗液中的特異性多肽，Schittek等［18］報(bào)道了皮離蛋白（dermcidin，DCD）具有汗液特異性，Sagawa等［19］成功合成了汗液特異性蛋白質(zhì)的單克隆抗體G-81。2005年Nakanishi［20］報(bào)道乳酸可用于汗液鑒定。2008年Hino等［21］報(bào)道了一種新方法，即通過色譜分析法檢測(cè)E-尿刊酸和L-酪氨酸來鑒定汗液。2010年Sakurada等［22］報(bào)道了DCD可以作為汗液的特異性遺傳標(biāo)記鑒定汗液。

皮膚的生物性來源鑒定主要是將接觸性DNA證據(jù)應(yīng)用于法庭中，接觸性DNA證據(jù)主要來源于人體物理性接觸過并留在實(shí)物表面的蛻皮細(xì)胞。LCE1C、LCE1D、LCE2D、CCL27、IL1F7具有皮膚高度特異性和靈敏性，可以用于皮膚鑒定，并且5～25 pg的皮膚RNA就可以實(shí)現(xiàn)鑒定，其中LCE1C尤為靈敏和特異，在大部分皮膚接觸實(shí)物樣本中檢出率最高［23］。Visser等［24］報(bào)道LOR也可作為特異性遺傳標(biāo)記實(shí)現(xiàn)皮膚鑒定，而CDSN、CST6和DSC1在皮膚和陰道分泌液中有交叉反應(yīng)，且CDSN在月經(jīng)血和唾液中也存在。KRT9因其靈敏度低，在某些皮膚檢材中無法檢測(cè)到，因此能否被應(yīng)用于法醫(yī)實(shí)踐目前還不確定。

尿液中的mRNA特異性遺傳標(biāo)記包括THP和UMOD，Akutsu［25］報(bào)道稱THP只在尿液中檢測(cè)到，在血液、唾液、精液、陰道分泌液和汗液中均無表達(dá)。

鼻腔分泌液特異性遺傳標(biāo)記的研究報(bào)道相對(duì)較少，早期在蛋白質(zhì)水平鑒定鼻腔分泌液常被用于諸如鼻竇炎的疾病診斷［26］，在mRNA水平方面STATH被證明特異性存在于鼻腔分泌液中，但如上唾液部分所述，STATH在唾液中也有表達(dá)［13］。

1.3miRNA

1.3.1基本原理

miRNA是一類內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼的小分子RNA，長(zhǎng)度約18～25nt，廣泛存在于各種真核細(xì)胞中，通過作用于mRNA片段在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞增殖分化、凋亡、衰老等重要生命活動(dòng)。2009年，Hanson［27］首次將miRNA應(yīng)用于人體生物性物質(zhì)來源鑒定，鑒定原理包括從不同組織體液中提取RNA，以miRNA為研究對(duì)象反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)cDNA和內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物定量分析，并最終以表達(dá)豐度（即通過二維或三維的散點(diǎn)圖描繪出候選miRNA在特定體液中的ΔCt值分布）作為選擇miRNA遺傳標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2應(yīng)用

miRNA在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可以鑒定人體多種生物性物質(zhì)來源，如血液、精液、唾液、陰道分泌液、皮膚、大腦等。miRNA遺傳標(biāo)記在精液中的特異性最好，在陰道分泌液和唾液中最差［27-30］。

2009年，Hanson［27］利用SYBR?Green qPCR技術(shù)從452個(gè)人類miRNA中檢測(cè)出9個(gè)具有人體不同生物性物質(zhì)差異表達(dá)的miRNA，其中miR451和miR16用于鑒定血液，miR135b和miR10b用于鑒定精液，miR658和miR205用于鑒定唾液，miR124a和miR372用于鑒定陰道分泌液，miR412和miR451用于鑒定月經(jīng)血，檢測(cè)靈敏度為50pg。同時(shí)檢測(cè)出miRNA遺傳標(biāo)記在人類21種組織中的表達(dá)水平，驗(yàn)證了miRNA在不同生物性物質(zhì)中的特異性，從而將miRNA引入生物性物質(zhì)來源鑒定的法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中。2010年，Zubakov等［29］應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)人類5種生物性物質(zhì)718個(gè)miRNA進(jìn)行篩選，并應(yīng)用TaqMan的RT-PCR技術(shù)和Northern印記技術(shù)對(duì)候選9個(gè)miRNA遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果僅能重復(fù)出Hanson報(bào)道的血液和精液的特異性miRNA遺傳標(biāo)記（靜脈血是miR-20a、miR-106a、miR-185、miR-144，精液是miR-135a、miR-10a、miR-507、miR-943、miR-891a），檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.1pg總RNA量，并發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室條件下放置1年的血痕和精斑，其表達(dá)豐度無大變化，比應(yīng)用mRNA鑒定生物性物質(zhì)來源靈敏得多。但是該研究不能確證陰道分泌液、月經(jīng)血和唾液中的miRNA遺傳標(biāo)記。2011年Courts等［31］利用Geniom?Biochips檢測(cè)出miRNA遺傳標(biāo)記在人類血液和唾液中的表達(dá)水平，通過SYBR?Green qPCR確認(rèn)了6個(gè)miRNA遺傳標(biāo)記（血液是miR-126、miR-150、miR-451，唾液是miR-200c、miR-203、miR-205）。

目前報(bào)道的用于人體生物性物質(zhì)來源鑒定的miRNA數(shù)量有限，且采用不同的技術(shù)平臺(tái)和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)方法，檢測(cè)結(jié)果不一致、重復(fù)性差。2012年，Zheng等［32］應(yīng)用mirVanaTMmiRNA分離試劑盒、高特異性莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)靜脈血、陰道分泌液、月經(jīng)血、精液、唾液進(jìn)行研究，目的是開發(fā)一套準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)miRNA基因表達(dá)水平的數(shù)據(jù)分析模型。結(jié)果顯示，miR16在靜脈血中的相對(duì)表達(dá)率與其他生物性物質(zhì)相比完全不同，miR658的表達(dá)不夠穩(wěn)定，miR205的表達(dá)在不同生物性物質(zhì)中不具有特異性。

2013年，Hanson等［30］運(yùn)用二元邏輯回歸模型將用于生物性物質(zhì)來源鑒定的miRNA遺傳標(biāo)記擴(kuò)大到18個(gè)，包括5個(gè)已有的遺傳標(biāo)記和13個(gè)新遺傳標(biāo)記（血液是miR451、miR16，精液是miR892a、miR891b；唾液是 miR658、miR205、miR124*，陰道分泌液是miR124a、miR1280、miR4286，月經(jīng)血是miR142-3p、miR144、miR144*、miR185，皮膚是 miR455-3p、miR3169、miR139、miR494）。二元邏輯回歸模型使人體生物性物質(zhì)來源鑒定更加準(zhǔn)確，優(yōu)于二維散點(diǎn)圖（即兩個(gè)候選miRNA）識(shí)別體液的方法。同年Wang等［28］通過qPCR-array芯片TaqMan?Array Human MicroRNA Cards從754個(gè)成熟miRNA分子中篩選出7個(gè)具有法醫(yī)來源鑒定潛在應(yīng)用價(jià)值的miRNA，并通過水解探針TaqMan qPCR確定了miR486、miR888、miR214、miR16和miR891a 5個(gè)可以進(jìn)行人體生物性物質(zhì)來源鑒定的miRNA遺傳標(biāo)記，其中miR16和miR486用于鑒定靜脈血，miR888和miR891a用于鑒定精液，miR214用于鑒定月經(jīng)血。

1.4微生物菌群

1.4.1基本原理

人體中含有大概40萬億個(gè)細(xì)胞和更多的微生物菌群，微生物菌群包括細(xì)菌、真菌、藻類、寄生蟲、病毒等微小生物。利用微生物菌群鑒定人體生物性物質(zhì)來源的基本原理為通過檢測(cè)微生物菌群的16S rRNA基因、16S-23S rRNA的基因間隔區(qū)或與其相鄰的23S rRNA基因確定存在于目標(biāo)生物性物質(zhì)中的特異微生物菌群種類，從而間接鑒定人體生物性物質(zhì)來源。

1.4.2應(yīng)用

利用微生物菌群鑒定人體生物性物質(zhì)來源的重點(diǎn)是在目標(biāo)生物性物質(zhì)中找到特異微生物菌群。以下對(duì)陰道分泌液、唾液、糞便及皮膚表面的微生物菌群分別作闡述。

陰道分泌液是由前庭大腺、子宮頸腺體、子宮內(nèi)膜的分泌物和陰道黏膜的滲出液、脫落的陰道上皮細(xì)胞混合而成，同時(shí)也含有微生物菌群用以保持健康，包括乳酸桿菌屬、陰道加德菌、陰道阿托波氏菌等，其中主要微生物菌群為乳酸桿菌屬，包括惰性乳桿菌、卷曲乳桿菌、詹氏乳桿菌和加氏乳桿菌。乳酸桿菌屬中卷曲乳桿菌特異性存在于女性陰道分泌液中，加氏乳桿菌、詹氏乳桿菌和陰道阿托波氏菌在陰道分泌液中的特異性目前存在爭(zhēng)議，惰性乳桿菌和陰道加德菌在陰道分泌液中不具有特異性，在精液中也存在［33］。因此，目前鑒定陰道分泌液主要是卷曲乳桿菌。對(duì)于一些患有細(xì)菌性陰道病的婦女，服用抗生素會(huì)對(duì)陰道微生物菌群的種類和數(shù)量有影響［34-35］，從而影響鑒定。同時(shí)由于女性生理結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，尿道與陰道距離較近，常在尿液中檢測(cè)到陰道分泌液中的特異性微生物菌群，這也是利用微生物菌群鑒定陰道分泌液的局限性。

唾液中含有數(shù)量最多的微生物菌群，50%為鏈球菌，此類菌群在體外極易失活［36］，其中唾液鏈球菌和變異鏈球菌特異性存在于唾液中，可用于唾液鑒定［37］?？谇绘溓蚓泻卸喾N表面蛋白，其中一種為葡糖基轉(zhuǎn)移酶，可以水解蔗糖合成細(xì)胞外多糖，這些多糖在保持牙菌斑的結(jié)構(gòu)完整性及將細(xì)菌黏附在牙齒表面［38］等方面發(fā)揮重要作用。葡糖基轉(zhuǎn)移酶擁有四個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中一個(gè)為非保守區(qū)域，具有種屬特異性，可作為口腔鏈球菌屬的識(shí)別分析［39］。因此，除了測(cè)定鏈球菌屬16S rRNA基因進(jìn)行唾液鑒定［40］以外，通過測(cè)定鏈球菌屬中葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的非保守區(qū)域也可以檢測(cè)鏈球菌DNA的有無，實(shí)現(xiàn)唾液鑒定。

Honda等［41］利用氣相色譜法測(cè)定類固醇檢測(cè)糞便，因其需要大量樣本且操作繁瑣，很難普遍應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中。近年來越來越多的法醫(yī)學(xué)工作者發(fā)現(xiàn)微生物菌群鑒定糞便可以取代上述鑒定方法。擬桿菌是糞便中的主要微生物菌群，占糞便總微生物菌群的30%，而單型擬桿菌、普通擬桿菌和多型擬桿菌又是擬桿菌的主要菌群。通過擴(kuò)增單型擬桿菌和普通擬桿菌中的RNA聚合酶β-亞型基因、多型擬桿菌中的α-1-6甘露聚糖酶基因發(fā)現(xiàn)上述三種菌群在糞便中具有極高特異性，而且檢出率尤以單型擬桿菌、普通擬桿菌兩者較高，因此可以用于糞便鑒定［42］。需要注意的是，乳酸桿菌屬大量存在于糞便中，利用乳酸桿菌鑒別陰道分泌液和糞便是無法實(shí)現(xiàn)的。

人體皮膚表面的微生物菌群數(shù)量巨大、種類繁多，如鼻孔和腋窩的主要微生物菌群為葡萄球菌和棒狀桿菌，頭部、腿部和手臂部上主要微生物菌群為葡萄球菌、棒狀桿菌、球菌和桿菌。其中金黃色釀膿葡萄球菌、表皮葡萄球菌是鼻孔中的主要葡萄球菌群，表皮葡萄球菌、人葡萄球菌是腋窩、頭部、腿部、手臂部的主要葡萄球菌群，頭狀葡萄球菌常在頭部、手臂部檢出，溶血性葡萄球菌常在頭部、腿部、手臂部檢出等。不同季節(jié)、不同溫度影響著微生物菌群的種類和數(shù)量，即便是同一部位也有所不同［43-44］。Noah等［45］以16S rRNA基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過一種高通量的焦磷酸測(cè)序方法在數(shù)量和種類上比較人體皮膚和人碰觸過的實(shí)物上的微生物菌群，可以實(shí)現(xiàn)個(gè)體識(shí)別，且結(jié)果準(zhǔn)確。

1.5綜合遺傳標(biāo)記鑒定人體生物性物質(zhì)來源

不同人體生物性物質(zhì)的來源鑒定都有其最適合的遺傳標(biāo)記種類，且某些生物性物質(zhì)用同一種類遺傳標(biāo)記往往不能準(zhǔn)確鑒定其來源，因此聯(lián)合不同種類遺傳標(biāo)記既可以準(zhǔn)確鑒定單一生物性物質(zhì)來源也可以對(duì)多種生物性物質(zhì)來源同時(shí)鑒定。各類遺傳標(biāo)記的鑒定原理和檢驗(yàn)方法均有不同，將不同種類遺傳標(biāo)記整合到同一復(fù)合體系進(jìn)行生物性物質(zhì)來源鑒定需要考慮諸多因素，如法醫(yī)樣本DNA或RNA的提取是否順利、實(shí)驗(yàn)條件能否兼容、結(jié)果是否出現(xiàn)交叉反應(yīng)等，下面簡(jiǎn)單介紹三種聯(lián)合不同種類遺傳標(biāo)記鑒定生物性物質(zhì)來源的組合方式：（1）微生物菌群遺傳標(biāo)記與mRNA遺傳標(biāo)記的組合體系，包括 HBD1、MUC4、MMP11在內(nèi)的mRNA遺傳標(biāo)記和卷曲乳酸桿菌、加氏乳桿菌和約氏乳酸桿菌在內(nèi)的微生物菌群遺傳標(biāo)記用于鑒定陰道分泌液［46］；（2）miRNA遺傳標(biāo)記與STR遺傳標(biāo)記的組合體系，除了常規(guī)STR分型外，完整的分型圖譜還包括血液和唾液的miRNA遺傳標(biāo)記miR-451和miR-205［47］，或月經(jīng)血、靜脈血、精液的miRNA遺傳標(biāo)記miR214、miR451a、miR888和miR891a［48］；（3）DNA甲基化遺傳標(biāo)記與微生物菌群遺傳標(biāo)記的組合體系，鑒定陰道分泌液和月經(jīng)血選擇的是PFN3和陰道分泌液特異性微生物菌群卷曲乳酸桿菌、加氏乳桿菌［49］。

2　各類遺傳標(biāo)記鑒定人體生物性物質(zhì)來源的結(jié)果分析及評(píng)判

目前人體生物性物質(zhì)來源鑒定方法主要從DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平開展。DNA水平鑒定包括DNA甲基化檢驗(yàn)、微生物菌群檢驗(yàn)，RNA水平鑒定包括mRNA檢驗(yàn)、miRNA檢驗(yàn)，蛋白質(zhì)水平鑒定包括檢驗(yàn)特異性抗原等商品化試劑盒——如用于檢測(cè)血紅蛋白的Bluestar?Forensic試劑盒（摩納哥藍(lán)星公司）、用于檢測(cè)淀粉酶的Phadebas?Amylase test（美國(guó)Phadebas公司）、用于檢測(cè)p30抗原的ABAcard?試劑盒（美國(guó)Abacus Diagnostics公司）等。用于人體生物性物質(zhì)來源鑒定的每種遺傳標(biāo)記都有其優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用局限性。微生物菌群檢驗(yàn)從微生物基因水平檢測(cè)人體不同生物性物質(zhì)的微生物種類而實(shí)現(xiàn)來源鑒定?；虻谋Ｊ匦院头€(wěn)定性使得檢驗(yàn)過程不易受到外界因素的干擾，但是不同生物性物質(zhì)存在交叉反應(yīng)，即同一微生物菌群同時(shí)出現(xiàn)在不同生物性物質(zhì)中［33］。而且對(duì)于疾病患者，抗生素的使用也可影響人體微生物菌群的種類和數(shù)量［34-35］。mRNA極易降解，因此在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有局限性。在實(shí)驗(yàn)室室溫干燥條件下保存兩年的血樣中已經(jīng)檢測(cè)不到mRNA，對(duì)于更惡劣的環(huán)境，mRNA在幾周之內(nèi)就已降解，除了極易降解，mRNA在人體某些生物性物質(zhì)中不具有特異性。相比之下，miRNA除具有組織特異性外，其長(zhǎng)度短且具有不易降解、穩(wěn)定性好、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，可作為人體生物性物質(zhì)來源鑒定的一項(xiàng)新技術(shù)方法。但miRNA在不同的生理和病理學(xué)過程中表達(dá)有差異，其異常表達(dá)與癌癥、神經(jīng)紊亂、心臟病等疾病有關(guān)，故可能會(huì)影響其在法醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用。而且目前研究報(bào)道的miRNA遺傳標(biāo)記數(shù)量有限，無法涵蓋法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域人體常見的所有生物性物質(zhì)。蛋白質(zhì)水平的來源鑒定簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，一直是法醫(yī)學(xué)工作者推崇的一種技術(shù)。但是蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性使其在不同實(shí)驗(yàn)室之間重復(fù)性差，且一些檢測(cè)試劑盒檢測(cè)靈敏度低，對(duì)于微量蛋白質(zhì)無法檢測(cè)到。

3　展望

人體生物性物質(zhì)來源鑒定是將生物學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等學(xué)科應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)的一種新嘗試，其近年來的發(fā)展大大提高了法醫(yī)學(xué)證據(jù)的含金量，使法庭審判、定罪量刑不僅僅拘泥于犯罪嫌疑人的口供，還能從多個(gè)角度審視證據(jù)，證據(jù)的作用也由證明犯罪事實(shí)的存在進(jìn)一步延展至刻畫犯罪行為過程，這不僅是對(duì)STR、SNP等傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記檢驗(yàn)方法的有效補(bǔ)充，也為實(shí)現(xiàn)案件的公正裁決提供了有力保障。法醫(yī)學(xué)工作者從DNA甲基化、mRNA、miRNA、微生物菌群、蛋白質(zhì)等層面探究人體不同生物性物質(zhì)的組成成分和特征，旨在發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體、不同生物性物質(zhì)之間的差異，并最終實(shí)現(xiàn)法醫(yī)現(xiàn)場(chǎng)人體生物性物質(zhì)的來源鑒定，以重現(xiàn)復(fù)雜的犯罪行為過程。盡管現(xiàn)有技術(shù)使得人體生物性物質(zhì)來源鑒定取得了一定進(jìn)展，但能夠像DNA檢驗(yàn)技術(shù)一樣將其作為有力證據(jù)應(yīng)用于法庭審判仍然有很多值得未來大力發(fā)展和探索的空間，如目前研究的遺傳標(biāo)記還無法覆蓋人體所有的生物性物質(zhì)類型；對(duì)已經(jīng)研究到的人體生物性物質(zhì)來源的鑒定，目前國(guó)際上并無統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)的鑒定方法和認(rèn)定準(zhǔn)則；當(dāng)前的鑒定方法和技術(shù)繁瑣、耗時(shí)，與偵查破案追求的時(shí)效性沖突，因此需要研究準(zhǔn)確、快速、甚至無須特殊儀器的檢測(cè)方法；當(dāng)前所選的遺傳標(biāo)記較為單一分散，需要開發(fā)復(fù)合檢測(cè)體系，提高鑒定能力。

綜上所述，不斷完善人體生物性物質(zhì)來源鑒定技術(shù)，進(jìn)一步發(fā)揮證據(jù)在法庭中的作用，將是相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展方向。法制化建設(shè)的深入推進(jìn)，對(duì)法醫(yī)學(xué)工作者提出了越來越高的要求，從最初要求提供線索抓獲犯罪嫌疑人，到當(dāng)下要求找到定罪量刑的證據(jù)，探索人體生物性物質(zhì)來源等更多證據(jù)附加信息將是推動(dòng)法醫(yī)學(xué)發(fā)展的強(qiáng)大動(dòng)力。

參考文獻(xiàn)：

［1］Hashimshony T，Zhang J，Keshet I，et al.The role of DNA methylation in setting up chromatin structure during development［J］.Nat Genet，2003，34（2）：187-192.

［2］Dan F，Wasserstrom A，Budowle B，et al.DNA methylation-basedforensictissueidentification［J］. Forensic Sci IntGenet，2011，5（5）：517-524.

［3］Lee HY，Park MJ，Choi A，et al.Potential forensic application of DNA methylation profiling to body fluid identification［J］.Int J Legal Med，2012，126（1）：55-62.

［4］Wasserstrom A，F(xiàn)rumkin D.Demonstration of DSI-semen--A novel DNA methylation-based forensic semen identification assay［J］.Forensic Sci Int Genet，2013，7（1）：136-142.

［5］Park JL，Kwon OH，Kim JH，et al.Identification of body fluid-specific DNA methylation markers for use inforensic science［J］.Forensic Sci Int Genet，2014，13（8）：147-153.

［6］Gomes I，Kohlmeier F，Schneider PM.Genetic markers for body fluid and tissue identification in forensics［J］.Forensic Sci Int：Genet Suppl Ser，2011，（1）：e469-e470.

［7］Haas C，Hanson E，B?r W，et al.mRNA profiling for the identification of blood--results of a collaborative EDNAP exercise［J］.Forensic Sci Int Genet，2011，5（1）：21-26.

［8］Haas C，Hanson E，Anjos MJ，et al.RNA/DNA coanalysis from blood stains--results of a second collaborative EDNAP exercise［J］.Forensic Sci Int Genet，2012，6（1）：70-80.

［9］Haas C，Hanson E，Anjos MJ，et al.RNA/DNA coanalysis from human saliva and semen stains--results of a third collaborative EDNAP exercise［J］.Forensic Sci Int Genet，2013，7（2）：230-239.

［10］Haas C，Hanson E，Anjos MJ，et al.RNA/DNA co-analysis from human menstrual blood and vaginal secretion stains：Results of a fourth and fifth collaborative EDNAP exercise［J］.Forensic Sci Int Genet，2014，8（1）：203-212.

［11］Haas C，Hanson E，Banemann R，et al.RNA/DNA co-analysis from human skin and contact traces--results of a sixth collaborative EDNAP exercise［J］. Forensic Sci Int Genet，2015，16：139-147.

［12］Zubakov D，Kokshoorn M，Kloosterman A，et al. New markers for old stains：stable mRNA markers for blood and saliva identification from up to 16-yearoldstains［J］.Int J Legal Med，2009，（123）：71-74.

［13］Richard MLL，Harper KA，Craig RL.Evaluation of mRNA marker specificity for the identification of five human body fluids by capillary electrophoresis［J］. Forensic Sci Int Genet，2011，6（4）：452-460.

［14］Park SM，Park SY，Kim JH，et al.Genome-wide mRNA profiling and multiplex quantitative RT-PCR for forensic body fluid identification［J］.Forensic Sci Int Genet，2013，7（1）：143-150.

［15］Zubakov D，Hanekamp E，Kokshoorn M，et al. Stable RNA markers for identification of blood and saliva stains revealed from whole genome expression analysis of time-wise degraded samples［J］.Int J Legal Med，2008，122（2）：135-142.

［16］Cossu C，Germann U，Kratzer A，et al.How specific are the vaginal secretion mRNA-markers HBD1 and MUC4？［J］.Forensic Sci Int：Genet Suppl Ser，2009，2（1）：536-537.

［17］Hanson EK，Ballantyne J.Highly specific mRNA biomarkers for the identification of vaginal secretions in sexual assault investigations［J］.Science&Justice，2013，53（1）：14-22.

［18］Schittek B，Hipfel R，Sauer B，et al.Dermcidin：a novelhumanantibioticpeptidesecretedby sweat glands［J］.Nat Immunol，2001，2（12）：1133-1137.

［19］Sagawa K，Kimura A，Saito Y，et al.Production and characterization of a monoclonal antibody for sweatspecific protein and its application for sweat identification［J］.Int J Legal Med，2003，117（2）：90-95.

［20］Nakanishi H.Preliminary test for demonstration of sweat stains by lactic acid［J］.Jap J Forensic Sci& Tech，2005，10：45-48.

［21］Hino D，Miyoshi M，Nakayama H.Identification of sweat stain using E-urocanic acid and L-turosine［J］. Forensic Sci Tech，2008，13：17-23.

［22］Sakurada K，Akutsu T，F(xiàn)ukushima H，et al.Detection of dermcidin for sweat identification by realtime RT-PCR and ELISA［J］.Forensic Sci Int，2010，194（1-3）：80-84.

［23］Hanson E，Haas C，Jucker R，et al.Specific and sensitive mRNA biomarkers for the identification of skin in‘touch DNA’evidence［J］.Forensic Sci Int Genet，2012，6（5）：548-558.

［24］Visser M，Zubakov D，Ballantyne KN.et al.mRNA-based skin identification for forensic applications［J］. Int J Legal Med，2011，125：253-263.

［25］Akutsu T.Evaluation of Tamm-Horsfall Protein and UroplakinⅢ for Forensic Identification of Urine［J］. J Forensic Sci，2010，55（3）：742-746.

［26］Casado B，Pannell LK，Iadarola P，et al.Identificationofhumannasalmucousproteinsusingproteomics［J］.Proteomics，2005，5（11）：2949-2959.

［27］HansonEK.Identificationofforensically relevant body fluids using a panel of differentially expressed microRNAs［J］.Anal Biochem，2009，387（2）：303-314.

［28］Wang Z，Zhang J，Luo HB，et al.Screening and confirmation of microRNA markers for forensic body fluid identification［J］.Forensic Sci Int Genet，2013，7（1）：116-123.

［29］Zubakov D，Boersma AWM，Ying C，et al.Micro-RNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation［J］.Deutsche Zeitschrift Für Die Gesamte Gerichtliche Medizin，2010，124（3）：217-226.

［30］Hanson EK，Rekab K，Ballantyne J.Binary logistic regression models enable miRNA profiling to provide accurate identification of forensically relevant body fluids and tissues［J］.Forensic Sci Int：Genet Suppl Ser，2013，4（1）：e127-e128.

［31］Courts C，Madea B.Specific Micro-RNA Signatures for the Detection of Saliva and Blood in Forensic Body-fluid Identification［J］.J Forensic Sci，2011，56（6）：1464-1470.

［32］Zheng W，Luo H，Pan X，et al.A model for data analysis of microRNA expression in forensic body fluid identification［J］.Forensic Sci Int Genet，2012，6（3）：419-423.

［33］Fleming RI.The use of bacteria for the identification of vaginal secretions［J］.Forensic Sci Int Genet，2010，4（5）：311-315.

［34］Verhelst R，Verstraelen H，Claeys G，et al.Cloning of 16S rRNA genes amplified from normal and disturbed vaginal microflora suggests a strong association between Atopobiurn vaginae，Gardnerellavaginalis and bacterial vaginosis［J］.Bmc Microbiol，2004，4（1）：1-11.

［35］Menard JP，F(xiàn)enollar F，Henry M，et al.Molecular quantification of Gardnerella vaginalis and Atopobium vaginae loads to predict bacterial vaginosis［J］.Clin Infect Dis，2008，47（1）：33-43.

［36］Tagg JR，Ragland NL.Applications of BLIS typing to studies of the survival on surfaces of salivary streptococci and staphylococci［J］.J Appl Bacteriol，1991， 71（4）：339-342.

［37］Nakanishi H，Kido A，Ohmori T.A novel method for the identification of saliva by detecting oral streptococci using PCR［J］.Forensic Sci Int，2009，183（1）：20-23.

［38］Marsh P，Martin MV.Oral microbiology［M］.4th ed. Oxford：Reed Educational and Professional Publishing Ltd，1999.

［39］Tomonori H，Mamoru K，Noriko S，et al.PCR detection and identification of oral streptococci in saliva samples using gtf genes［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2004，48（3）：195-199.

［40］Power DA，Cordiner SJ，Kieser JA，et al.PCR-based detection of salivary bacteria as a marker of expirated blood［J］.Science&Justice，2010，50（2）：59-63.

［41］Honda M，Shinohara T.Discrimination of Animal Species by Analysis of Mammalian Fecal Steroids［J］. JPN J Tox Env Health，1986，32（2）：114-122.

［42］Poxton IR.Mucosa-associated bacterial flora of the human colon［J］.J Med Microbiol，1997，46（1）：85-91.

［43］Kloos WE.Distribution and persistence of Staphylococcus and Micrococcus species and other aerobic bacteria on human skin［J］.Appl Microbiol，1975，30（3）：381-395.

［44］Kai K.Outbreak Detectives Embrace the Genome Era［J］.Science，2011，333（6051）：1818-1819.

［45］Noah F，Lauber CL，Nick Z，et al.Forensic identification using skin bacterial communities［J］.Proc Nat Acad Sci US，2010，107（14）：6477-6481.

［46］Jakubowska J，Maciejewska A，Paw?owski R，et al. mRNA profiling for vaginal fluid and menstrual blood identification［J］.Forensic Sci Int Genet，2013，7（2）：272-278.

［47］Donny VDM，Uchimoto ML，Graham W.Simultaneous analysis of micro-RNA and DNA for determining the body fluid origin of DNA profiles［J］.J Forensic Sci，2013，58（4）：967-971.

［48］Li Y，Zhang J，Wei W，et al.A strategy for coanalysis of microRNAs and DNA［J］.Forensic Sci Int Genet，2014，12（9）：24-29.

［49］Choi A，Shin KJ，Yang WI，et al.Body fluid identification by integrated analysis of DNA methylation and body fluid-specific microbial DNA［J］.Deutsche Zeitschrift Für Die Gesamte Gerichtliche Medizin，2014，128（1）：33-41.

（本文編輯：李成濤）

主編按語：2016年4月18日，最高人民法院、最高人民檢察院、公安部、國(guó)家安全部、司法部發(fā)布了《人體損傷致殘程度分級(jí)》（以下簡(jiǎn)稱《新標(biāo)準(zhǔn)》），作為人體損傷致殘程度鑒定統(tǒng)一適用的標(biāo)準(zhǔn)，并將于2017年1月1日起正式實(shí)施?！缎聵?biāo)準(zhǔn)》的發(fā)布是法醫(yī)臨床學(xué)領(lǐng)域的一件盛事，其較以往多部人體傷殘鑒定標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)了較多的變化與相當(dāng)?shù)男乱?，需要廣大鑒定人認(rèn)真學(xué)習(xí)、深刻領(lǐng)會(huì)。為了保障《新標(biāo)準(zhǔn)》得以準(zhǔn)確實(shí)施，《法醫(yī)學(xué)雜志》自本期起，將集中刊登由業(yè)內(nèi)專家撰寫的針對(duì)《新標(biāo)準(zhǔn)》中頗具討論價(jià)值條款的學(xué)術(shù)論文，幫助鑒定人在未來的工作中更好地理解條款。同時(shí)，擬就下列議題向各地同行征文：（1）肢體與手功能障礙等變化較大的條款的理解與適用，以及實(shí)踐中可能遇到的問題和對(duì)策；（2）《新標(biāo)準(zhǔn)》提出的諸如“肋骨骨折畸形愈合”等新理念的把握原則，以及檢驗(yàn)方法和操作規(guī)范；（3）現(xiàn)行法醫(yī)臨床學(xué)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)規(guī)范如何更好地適應(yīng)《新標(biāo)準(zhǔn)》相關(guān)條款的執(zhí)行，以及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)規(guī)范進(jìn)一步改進(jìn)、完善的建議。

中圖分類號(hào)：DF795.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.011

文章編號(hào)：1004-5619（2016）03-0204-07

基金項(xiàng)目：上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目（14JG0500400）

作者簡(jiǎn)介：鄒凱南（1983—），女，碩士，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA分析技術(shù)的應(yīng)用和研究；E-mail：kitty_zkn@126.com

通信作者：周懷谷，男，博士，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA分析技術(shù)的應(yīng)用和研究；E-mail：hgzhou803@hotmail.com

收稿日期：（2015-07-20）

Source Identification of Human Biological Materials and Its Prospect in Forensic Science

ZOU Kai-nan1，GUI Cheng2，CAO Yu1，YANG Fan1，ZHOU Huai-gu1
（1.Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology，Ministry of Public Security，Institute of Forensic Science，Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200083，China；2.Institute of Criminal Science and Technology，Changning Branch of Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200336，China）

Abstract：Source identification of human biological materials in crime scene plays an important role in reconstructing the crime process.Searching specific genetic markers to identify the source of different human biological materials is the emphasis and difficulty of the research work of legal medical experts in recent years.This paper reviews the genetic markers which are used for identifying the source of human biological materials and studied widely，such as DNA methylation，mRNA，microRNA，microflora and protein，etc.By comparing the principles and methods of source identification of human biological materials using different kinds of genetic markers，different source of human biological material owns suitable marker types and can be identified by detecting single genetic marker or combined multiple genetic markers.Though there is no uniform standard and method for identifying the source of human biological materials in forensic laboratories at present，the research and development of a series of mature and reliable methods for distinguishing different human biological materials play the role as forensic evidence which will be the future development direction.

Key words：forensic genetics；genetic markers；review［publication type］；source