安徽省漢族人氨基糖苷類抗生素致耳聾患者基因突變的研究

徐 彬，余元勛，王迎新，李建平，劉 萍，張 立

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安徽省漢族人氨基糖苷類抗生素致耳聾患者基因突變的研究

徐 彬，余元勛，王迎新，李建平，劉 萍，張 立

目的 研究安徽省漢族人氨基糖苷類抗生素致耳聾(AAID)患者基因突變與其非綜合征性耳聾(NSHL)的關系，建立口腔黏膜細胞基因組DNA新一代基因測序法(NGS)。方法 由122例NSHL患兒及120 例健康兒童，取得口腔黏膜基因組DNA，應用NGS對GJB2、12S rRNA 基因測序。結(jié)果 口腔黏膜細胞的基因組DNA質(zhì)量較好，能滿足NGS 研究需要；在122例NSHL患者中，28例GJB2 基因突變，占耳聾患者的22.95%；10例12S rRNA基因突變，占耳聾患者的8.20%。120例健康兒童中，未發(fā)現(xiàn)基因突變(P<0.01)。結(jié)論 口腔黏膜細胞基因組DNA 的NGS檢測法能用于檢出安徽省漢族人AAID基因突變；在安徽NSHL患者中GJB2、12S rRNA基因突變有其一定的特點，能對安徽省漢族人AAID基因突變研究提供幫助。

口腔黏膜細胞；耳聾；突變；GJB2；12S rRNA

我國每年約有3萬例先天性耳聾發(fā)病患者[1]。50%耳聾與遺傳因素相關，為遺傳性耳聾，由遺傳因素、環(huán)境因素的共同作用而引發(fā)，包括非綜合征型耳聾[(non-syndromic hearing loss,NSHL)，約占70%]、綜合征型耳聾[(syndromic hearing loss,SHL)，約占30%]；已發(fā)現(xiàn)與NSHL相關的致病基因及其突變有一定異質(zhì)性，與人群的種族、地區(qū)不同相關[2]。氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides antibiotic,AmAn)使用中出現(xiàn)的聽覺和前庭的損害常是不可逆的，可誘發(fā)氨基糖苷類抗生素致聾(aminoglycosides antibiotic induced deafness,AAID)[3-4]，與AAID相關的12S rRNA 基因突變，以C1494T、

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A1555G、nt961insC、nt961delT、Tnt1095C等突變較常見[5]；研究[6]表明，GJB2基因上至少有110余種突變，可能與NSHL相關，GJB2基因突變的攜帶率為3%。目前遺傳性耳聾較常用的基因診斷方法包括基因芯片法、NGS法。該研究主要應用口腔黏膜細胞的DNA，經(jīng)NGS法檢測耳聾致病基因突變, 以便為進一步開展AAID相關研究提供技術(shù)支持，為臨床合理治療提供指導。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 對象 安徽殘聯(lián)康復研究中心、安徽省優(yōu)生優(yōu)育遺傳醫(yī)學中心門診NSHL患者共122例，其中男童75例，女童47例；120例健康兒童作為對照，其中男童71例，女童49例。

1.1.2 病史采集 采用問卷調(diào)查的方式, 由患者家屬等填寫。

1.1.3 純音聽閾測定 應用的全部儀器按國家標準校準。① 耳科檢查：應用耳鏡檢查外耳道、鼓膜；② 純音聽閾測定：按照常規(guī)于靜室內(nèi)，采用丹麥Madsen502便攜式聽力計，根據(jù)WHO預防聾和聽力損失項目方法(1997年), 應用上升法進行氣導聽閾測定，計算0.5、1、2、4kHz4個頻率聽閾平均值為純音聽閾；聽力障礙者聽力損失的具體分級如下：輕度聽力損失：26～40dBHL；中度聽力損失：41～60dBHL；重度聽力損失：61～80dBHL；極重度聽力損失：>81dBHL。

1.1.4 調(diào)查結(jié)果 122例患者均無親緣關系，經(jīng)體檢排除遺傳性SHL，否認有中耳炎、接觸強噪音、外傷的病史, 耳科檢查鼓膜正常, 無穿孔、充血、內(nèi)陷；NSHL患者中，9例在3歲內(nèi)用過慶大霉素(7例)、鏈霉素(2例)，29例孕期或生后用藥情況不詳，84例無耳毒性藥物用藥史；77例為先天性聾(生后3個月內(nèi)確診)，41 例為生后6個月內(nèi)確診, 4例為1歲以后聽力下降；耳聾程度分布情況見表1。

表1 不同發(fā)病時期耳聾程度分布情況(n)

1.2 基因組DNA抽提

1.2.1 口腔黏膜細胞 取122例遺傳性NSHL耳聾患者和120例健康人口腔黏膜細胞，制備細胞懸液，4 ℃保存；DNA抽提方法，按照本研究組已發(fā)表的文獻[7]制備基因組DNA溶液。

1.2.2 PCR引物設計 設計時參考人類GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) 遺傳性耳聾的序列, 并利用Premier 5.0軟件設計，由上海生工公司合成，引物信息見表2。

表2 引物序列

1.3 PCR反應體系和條件 反應體系：Total 10 μl：polymerase 1 U；Primer forward (2 μmol/L)1 μl；Primer reverse (2 μmol/L)1 μl;DNA溶液1 μl; 10×buffer 1 μl;MgCl2(50 mmol/L)0.3 μl;dNTPs(10 mmol/L)0.2 μl；水補齊至10 μl。反應條件：Preheat，95 ℃ 5 min；PCR 40 cycles(95 ℃ 15 s；60 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s)；72 ℃ 15 min，4 ℃ 保存。

1.4 PCR產(chǎn)物測序 測序 PCR的反應產(chǎn)物由華大生物科技公司檢驗中心進行熒光全自動基因DNA正/反向測序，分析相關基因DNA突變。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，耳聾組與健康對照組的基因DNA突變結(jié)果采用t檢驗進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。兩種DNA標本來源的 DNA 基因檢測結(jié)果一致性分析用Kappa檢驗，Kappa>0.75則兩者一致性較好。

1.6 突變分析 122例耳聾患者和120例健康人基因DNA的測序結(jié)果，與由GenBank中獲得的正常人相關基因DNA相應序列進行比對，分析突變情況。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 NSHL患者122例，其中男童75例(61.48%)，女童47例(38.52%)；男女之比為1.596 ∶1；均自愿參加，簽署知情通知書。患者就診年齡在出生后2～8(3.21±4.22)歲，男童平均年齡(4.26±5.12)歲，女童平均年齡為(3.61±3.96)歲；不同發(fā)病年齡耳聾程度分布不同。見表1。120例健康兒童作為對照，其中男童71例，女童49例；年齡在出生后2～8(3.39±4.37)歲，男童平均年齡(4.38±5.05)歲，女童平均年齡為(3.23±3.57) 歲。

2.2 提取DNA 取口腔頰黏膜細胞，制備基因組DNA溶液，凝膠電泳均為一條帶，達到檢驗DNA溶液的純度；基因組DNA溶液，經(jīng)紫外分光光度計檢測，OD260/OD280均為1.8，純度合格；基因組DNA溶液濃度為1 μg/μl。

2.3 新一代基因測序分析結(jié)果 122例遺傳性耳聾患者及120 例健康對照人群口腔黏膜細胞的DNA的PCR擴增、新一代基因測序分析后結(jié)果如下：在122例NSHL患者中，GJB2基因發(fā)現(xiàn)14例nt 235 del C雜合或純合突變，2例nt 235 del C+nt 299～300 del AT復合突變，1例nt 235 del C+nt 176 del 16復合突變，4例nt 299～300 del AT移碼突變，3例nt 176 del 16雜合突變, 2例nt 538 C→T純合突變, 2例nt 547 G→A純合突變，28例GJB2 基因突變患者占耳聾組的22.95%。

在122例NSHL患者中，線粒體12S rRNA基因發(fā)現(xiàn)3例nt 961 insC(如第12例)、3例nt 961 del T(如第23例)、1例nt 961 del T+T nt1095 C(如第28例)、2例A nt1555 G(如第63例)、1例C nt1494 T(如第86例)，10例線粒體12S rRNA基因突變患者占耳聾組的8.20%,結(jié)果顯示5種基因突變的相應測序部分截圖見圖1～5。120 例健康對照者未發(fā)現(xiàn)基因突變, 與耳聾組基因突變率差異有統(tǒng)計學意義(t=3.719,P<0.01)。

圖1 患者第12例基因突變測序部分截圖

男，4歲半，聽力閾值90 dB,12S rRNA基因的961位點出現(xiàn)nt 961 insC的缺失，箭頭指示突變位置

圖2 患者第23例基因突變測序部分截圖

男，3歲10個月，聽力閾值95 dB, 12S rRNA基因的961位點出現(xiàn)nt 961 delTC的插入，箭頭指示突變位置

圖3 患者第28例基因突變測序部分截圖

男，5歲，左耳聽力閾值90 dB，右耳聽力閾值95 dB, 12S rRNA基因的961位點出現(xiàn)nt 961 delT+T nt1095 C的復合突變，箭頭指示突變位置

3 討論

我國7歲以下的耳聾兒童約有80萬例，常在應用氨基糖苷類抗生素后出現(xiàn)聽力損失，大部分為重度耳聾，少部分為輕中度耳聾，造成了嚴重的社會問題；利用準確、低成本、高效率的耳聾基因診斷方法，早期發(fā)現(xiàn)、診斷耳聾發(fā)生的原因, 根據(jù)不同病因采取不同的干預措施，對耳聾兒童的生存質(zhì)量意義重大。

圖4 患者第63例基因突變測序部分截圖

女，4歲，聽力閾值90 dB, 12S rRNA基因1555位點的A突變?yōu)镚，箭頭指示突變位置

圖5 患者第86例基因突變測序部分截圖

女，6歲，聽力閾值95 dB,12S rRNA基因1494位點的C突變?yōu)門，箭頭指示突變位置

研究[8]顯示，由口腔黏膜細胞提取基因組DNA，可應用于基因診斷。本研究結(jié)果表明，收集口腔黏膜細胞，抽取基因組DNA，可用于耳聾基因診斷，方法簡易、方便。

GJB2基因常是非綜合征型耳聾的致病基因, 其中約50%為常染色體隱性遺傳性(DFNB)，約20%為常染色體顯性遺傳性(DFNA)；該基因位于DFNA3A基因座, 編碼縫隙連接蛋白Cx26，表達于內(nèi)耳上皮毛細胞等。GJB2基因突變后，突變Cx26可引發(fā)內(nèi)淋巴液鉀離子循環(huán)紊亂，能導致感音神經(jīng)性耳聾，常表現(xiàn)為先天性、雙側(cè)對稱的、非進行性重度耳聾；一般可見于新生兒聽力篩查未通過的患兒，可被新生兒聽力檢查 + 基因診斷聯(lián)合篩查發(fā)現(xiàn)。對中國2 063例耳聾患者進行研究[9]表明GJB2基因突變在NSHL患者的陽性率為14.9%，本研究結(jié)果陽性率為22.95%，包括nt 235del C、235 del C+nt 299～300 del AT 、nt 235 del C+nt 176 del 16、nt 299～300 delAT、nt 176 del 16、nt 538 C→T、nt 547 G→A, 分別占122例患者的11.48%、1.64%、0.82%、3.28%、2.46%、1.64%、1.64%； 其陽性率、分型情況與國內(nèi)報道一致；nt 235del C、nt 299～300 delAT、nt 176 del 16 可能是安徽省NSHL患者中的GJB2 基因突變熱點。

線粒體mtDNA 12S rRNA基因突變有母系遺傳的特點，與耳毒性藥物相關。研究[10]顯示mtDNA 無組蛋白而裸露，在12S rRNA發(fā)生Ant1555G、Cnt1494T突變后，能使12S rRNA 在空間結(jié)構(gòu)上與細菌16S rRNA 相似，易結(jié)合AmAn，能引發(fā)氧化磷酸化紊亂，減少產(chǎn)生 ATP，可毒性損傷內(nèi)耳毛細胞，導致 AAID；后者對 AmAn 敏感，有時可一針致聾。研究[11]證實mtDNA Ant1555G 點突變是 AAID 遺傳易感性的分子基礎，其在中國漢族人NSHL患者中的攜帶率存在地域、種族的差異, 其在南京、福州、武漢[12-14]的NSHL患者的檢出率分別為1.50%、0.67%、2.27%。本研究的檢出率為1.64%，其差異可能與各地區(qū)使用AmAn的頻率、基因突變檢測方法等相關。研究[12]提示mtDNA Cnt1494T點突變的致病機制與Ant1555G 類似。本研究對安徽省122例耳聾患者篩查，檢出1例Cnt1494T突變，檢出率為0.82%。

線粒體nt 961 del T/insC是12S rRNA的nt 961位T的缺失和(或)C插入；可能是AmAn致聾的又一重要原因[3]；該突變位于12S rRNA 基因的第21、22 環(huán)之間，可改變12S rRNA空間結(jié)構(gòu)，易與AmAn結(jié)合而引發(fā)中毒性耳聾。本研究在安徽省的122 例耳聾患者中檢出3例nt 961 insC、3例nt 961 del T、1 例復合突變nt 961 del T+Tnt 1095 C，總檢出率為5.74%，3種突變分別占122例耳聾患者的2.46%、2.46%、0.82%。T nt1095 C位于12S rRNA的第25螺旋，能導致線粒體mtDNA 空間結(jié)構(gòu)改變，促進與AmAn的結(jié)合，引發(fā)氧化磷酸化紊亂，減少產(chǎn)生ATP，可毒性損傷內(nèi)耳毛細胞，導致產(chǎn)生 AAID[15]。本研究顯示1例復合突變nt 961 del T+Tnt1095C，可能與耳聾發(fā)病相關；復合突變導致的耳聾癥狀可能較重，但需進一步研究。本研究122例耳聾患者中，12S rRNA 基因的 Ant3243G、Ant7445G、Ant827G、Gnt7444A 等突變未檢出。

本研究提示AmAn誘發(fā)的藥物性耳聾在各年齡段均可出現(xiàn)，不能忽視線粒體基因突變的檢測，特別是有AmAn用藥史、母系家族遺傳史的患者；12S rRNA基因突變攜帶者發(fā)現(xiàn)后，要再檢查未耳聾的母系成員，可早期發(fā)現(xiàn)相同突變攜帶者，能對其進行用藥指導，避免藥物性耳聾的發(fā)生。本研究建立的常見聾病基因分型快速檢測方法，能了解GJB2、12S rRNA等基因突變的情況，能提高基因突變檢出率, 可為本地區(qū)耳聾遺傳咨詢和聾病基因篩查提供依據(jù)。

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AbstractObjectiveTostudytherelationshipofthegenemutationsofAnhuiHanpeopleaminoglycosidesantibioticsinduceddeafness(AAID)patientsandnon-syndromichearingloss(NSHL),andsetupnext-generationsequencing(NGS)oforalmucosalcellsgenomaDNA.MethodsFrom122casesofNSHLpatientsand120casesofhealthychildren,wegottheoralmucosalcellsgenomaDNAsandusingNGSsequencedGJB2,12SrRNAgenes.ResultsThegenomaDNAsoforalmucosalcellsweregoodqualityforNGSstudy.In122casesofNSHLpatients,wefoundGJB2genemutationsof28casea(22.95%),andfound12SrRNAgenemutationsof10casea(8.20%).In120casesofhealthychildren,wedidnotfindanymutation(P<0.01).ConclusionNGSsequencingmethodoforalmucosalcellsgenomaDNAcanbeusedfordetectingthemutationsofAnhuiHanpeopleAAID.ThemutationsofGJB2,12SrRNAgenesinAnhuiNSHLpatientshavesomedifferentcharictersandcanhelptostudythegenemutationsofAnhuiHanpeopleAAID.

Keywordsoralmucosalcell；deafness；mutation；GJB2；12SrRNA

Comparative study of abdominal imaging quality between mixed energy mode and mono-energy mode reconstruction on dual-energy spectral CT

Wei Wei, Deng Kexue, Zhao Yingming, et al

(DeptofRadiology,AffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001)

ObjectiveToevaluatethedifferenceofmixedenergymodeandmono-energymodereconstructionimagesonabdomenspectralCTimaging.MethodsAbdomenpre-contrastandcontrastenhancedCTscanswereappliedwithspectralCTonsixtypatients.Imageswerereconstructedbytwo-modes:QCmodeandMonomode.Thefollowingvariableswerecompared:signal-to-noise(SNR)ofliver,spleenandpancreas,contrast-to-noise(CNR)ofliver,spleenandpancreas.Twoexperiencedradiologistsevaluatedtheartifactlevelofimagesofthetworeconstructionmodes.ResultsComparedwithmixed-energymodeimages,70keVmono-energyimagesyieldedsignificantlygreaterSNRandCNR(P<0.05).Subjectivescoreof70keVmono-energyimageswashigherthanthatofmixed-energyimage(P<0.001).ConclusionInabdominalspectralCTimaging,mono-energyreconstructioncanprovidehigherqualityofimagesthanmixed-energyreconstructionandcanreplacemixed-energyimagesinclinicaldiagnosis.

abdomen;computedtomography;X-raycomputed;spectralCT;reconstructionmode

Research of genetic mutation in Anhui Han people AAID patients

Xu Bin,Yu Yuanxun,Wang Yingxin,et al

(AnhuiMedicalGeneticsCenterinAnhuiMedicalCollege,Hefei230061)

安徽高校省級自然科學研究項目(編號：KJ2014A128)

安徽醫(yī)學高等?？茖W校省遺傳醫(yī)學中心，合肥 230061

徐 彬，男，副研究員，責任作者，E-mail：xb.1030@163.com

時間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.022.html

R 969.3

A

1000-1492(2016)11-1653-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.023

2016-06-22接收