ApoE基因敲除小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)和微管相關(guān)蛋白2表達(dá)變化

季 丹，黃大可，桂 麗，賈雪梅

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ApoE基因敲除小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)和微管相關(guān)蛋白2表達(dá)變化

季 丹1,2，黃大可3，桂 麗3，賈雪梅1

目的 觀察載脂蛋白E基因敲除(ApoE KO)對(duì)小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)改變以及微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)表達(dá)的影響。方法 10只野生型C57BL/6J小鼠為對(duì)照組，10只ApoE基因敲除小鼠為KO組，普通飼料喂養(yǎng)3個(gè)月。采用分光光度計(jì)檢測(cè)血脂變化；取兩組小鼠腦組織，HE染色和電鏡技術(shù)觀察海馬CA3區(qū)結(jié)構(gòu)改變，免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察兩組小鼠海馬CA3區(qū)MAP-2表達(dá)變化, 采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)其平均光密度(MOD)值。結(jié)果 與對(duì)照組比較，KO組小鼠血漿總膽固醇、血漿三酰甘油、低密度脂蛋白含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)。光鏡下，KO組小鼠海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞較小，排列稀疏松散。電鏡下，KO組海馬神經(jīng)元內(nèi)線粒體腫脹變性，嵴消失；神經(jīng)纖維髓鞘松懈；突觸小泡數(shù)量減少，突觸間隙模糊等。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)MAP-2高表達(dá)， KO組含量明顯減少；圖像分析顯示KO組CA3區(qū)MAP-2 MOD值明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 ApoE KO小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理改變，MAP-2表達(dá)下降，提示ApoE KO與神經(jīng)退行性病變有一定聯(lián)系。

載脂蛋白E基因敲除；微管相關(guān)蛋白2；超微結(jié)構(gòu)；海馬CA3區(qū)；小鼠

載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是一種轉(zhuǎn)運(yùn)血脂的血漿蛋白，參與調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝和膽固醇平衡[1]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，ApoE參與膽固醇及磷脂的動(dòng)員和再分布，可調(diào)節(jié)突觸可塑性和修復(fù)神經(jīng)元損傷，是目前已知的唯一與神經(jīng)系統(tǒng)密切關(guān)聯(lián)的載脂蛋白，也是第一個(gè)被確認(rèn)的散發(fā)型和遲發(fā)家族型阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的重要易感基因[2]。近年來，膽固醇代謝異常、ApoE 對(duì)膽固醇代謝的調(diào)節(jié)等已越來越多地被證實(shí)與AD的發(fā)生和發(fā)展密不可分。本課題組前期研究[3]表明， ApoE基因敲除(ApoE gene knockout，ApoE KO)小鼠會(huì)引起海馬神經(jīng)元中β淀粉樣蛋白(amyloid protein β，Aβ)的沉積，可能會(huì)引起AD等神經(jīng)退行性疾病的認(rèn)知功能障礙。研究[4]顯示，作為一種新型動(dòng)物模型——ApoE基因敲除小鼠，已應(yīng)用于認(rèn)知障礙和記憶關(guān)系的研究。AD確切發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，有研究者認(rèn)為，細(xì)胞骨架的異常裝配和信號(hào)傳遞的障礙可引發(fā)AD等神經(jīng)退行性疾病[5]。微管相關(guān)蛋白-2(microtubule-associated proteins-2，MAP-2)是構(gòu)建細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)性微管相關(guān)蛋白家族，可促進(jìn)微管形成、維持微管穩(wěn)定、誘導(dǎo)微管成束，參與神經(jīng)元發(fā)育、突起的形成和生長(zhǎng)以及信息傳導(dǎo)等過程[6]。海馬CA3區(qū)是與記憶相關(guān)情報(bào)儲(chǔ)存的關(guān)鍵部位，該研究通過外購(gòu)ApoE基因敲除小鼠，對(duì)海馬神經(jīng)元CA3區(qū)進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)及MAP-2表達(dá)觀察，旨在為進(jìn)一步探討 ApoE異常引發(fā)AD等神經(jīng)退行性疾病的可能機(jī)制提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備 20只清潔級(jí)野生型C57BL/6J小鼠購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，其中10只作為對(duì)照組，另10只為ApoE基因敲除小鼠作為KO組，單籠飼養(yǎng)12周，此期間各組動(dòng)物均不限制飲食和飲水。普通飲食喂養(yǎng)3個(gè)月，禁食12 h后，將兩組小鼠水合氯醛麻醉下行下腔靜脈采血，離心后取血清，-20 ℃保存，待測(cè)血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)水平。取腦組織，用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片(厚4 μm，矢狀面切片)，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 兔抗鼠MAP-2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，SP免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。常用生化試劑：LDL試劑盒、TC試劑盒、TG試劑盒等均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按照試劑盒說明書，采用分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.3 HE染色 石蠟切片脫蠟至水，入蘇木精染色10 min，再進(jìn)行鹽酸乙醇分色、藍(lán)化，入伊紅染色1 min，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察并攝片。

1.4 電鏡觀察 將兩組小鼠新鮮海馬組織預(yù)固定于4%戊二醛，1%鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)Epon-812 包埋、定位，60 nm超薄切片，醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色，置日產(chǎn)JEO L-1230透射電鏡下觀察并攝片。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)SP法染色，按照試劑盒說明書進(jìn)行。3%過氧化氫溶液處理，微波中火抗原修復(fù)，山羊血清封閉，滴加兔抗鼠MAP-2抗體(稀釋度為1 ∶100)，37 ℃孵育30 min后，置4 ℃過夜；二抗為生物素化羊抗兔IgG血清，37 ℃孵育30 min；辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液37 ℃孵育30 min。DAB顯色，脫水、透明、封片。用PBS替代一抗作陰性對(duì)照。

1.6 計(jì)算機(jī)圖像分析 采用南京大學(xué)捷達(dá)公司801計(jì)算機(jī)病理圖象分析系統(tǒng)，應(yīng)用日本Nikon Eclipse-800i顯微鏡，隨機(jī)選取20倍物鏡下6個(gè)視野，計(jì)算海馬CA3區(qū)神經(jīng)元內(nèi)MAP-2陽(yáng)性染色平均光密度(mean optical density，MOD)值。

2 結(jié)果

2.1 血清血脂生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組比較，KO組血清TC、TG、LDL水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 兩組小鼠血清脂質(zhì)生化指標(biāo)比較±s)

2.2 HE染色檢查結(jié)果 HE染色后在光鏡下顯示，海馬由CA1～CA4區(qū)域組成，可分為分子層、錐體細(xì)胞層和多形細(xì)胞層。對(duì)照組海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞層的神經(jīng)元排列緊密，胞體呈錐體形，神經(jīng)元的細(xì)胞核大而圓，著色淺。KO組小鼠海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂、松散，胞體較小，見圖1。

2.3 電鏡觀察結(jié)果 電鏡下顯示，對(duì)照組海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞胞質(zhì)豐富，內(nèi)含較多游離核糖體、線粒體成分； KO組海馬神經(jīng)元內(nèi)線粒體腫脹變性，嵴斷裂，粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，見圖2。對(duì)照組神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)完整，密度均勻一致；KO組神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)不完整、松懈，密度較對(duì)照組降低，見圖3。對(duì)照組突觸結(jié)構(gòu)完整，突觸前成分中有大量突觸小泡，突觸間隙清晰，突觸后膜特化增厚；KO組神經(jīng)末梢可見突觸結(jié)構(gòu)小泡明顯減少，突觸間隙模糊，見圖4。

圖1 小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元 HE×200

圖2 小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu) 電鏡×15 000

圖3 小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu) 電鏡×25 000

2.4 MAP-2免疫組化染色結(jié)果 本研究陽(yáng)性染色結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒。在對(duì)照組中，MAP-2黃褐色陽(yáng)性產(chǎn)物主要表達(dá)在海馬神經(jīng)元胞質(zhì)和樹突內(nèi)，且陽(yáng)性染色顯示的黃色顆粒樣物質(zhì)表達(dá)較高，神經(jīng)元突起較為光滑，呈連續(xù)而纖細(xì)的條索狀。KO組含量較少，MAP-2 免疫陽(yáng)性產(chǎn)物在胞體和樹突中較對(duì)照組明顯減少，條索狀陽(yáng)性產(chǎn)物連續(xù)性不完整。陰性對(duì)照結(jié)果呈陰性，見圖5。

圖4 小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)突觸超微結(jié)構(gòu) 電鏡×50 000

圖5 小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元MAP-2表達(dá) SP法×400

2.5 計(jì)算機(jī)圖像分析海馬CA3區(qū)MAP-2表達(dá) 與對(duì)照組比較，KO組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元內(nèi)MAP-2 MOD值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.489±0.065vs0.339±0.029，t=2.659，P<0.05)。

3 討論

ApoE主要分布于乳糜微粒(chylomieron，CM)、LDL中，是機(jī)體LDL受體的配體，在脂蛋白代謝中作用顯著[1]?；蚯贸鼳poE的小鼠因清除脂質(zhì)障礙，易在短期內(nèi)形成高脂血癥[2]。本研究結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組比較，ApoE基因敲除3個(gè)月后，KO組小鼠血清中TC、TG、LDL水平顯著升高，說明KO組小鼠已存在嚴(yán)重脂蛋白代謝障礙，模型建立成功。血漿蛋白ApoE與血脂轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，在神經(jīng)損傷的再生、神經(jīng)元軸突的延伸中起一定的作用[1]。本課題組前期研究[3]表明，ApoE可調(diào)控大腦中Aβ的沉積和降解，Aβ與機(jī)體的學(xué)習(xí)、記憶、信息存儲(chǔ)等功能關(guān)系密切，海馬區(qū)Aβ的沉積受累，是引起AD的重要原因。文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，ApoE基因敲除可致Aβ沉積，可能與AD認(rèn)知功能障礙有關(guān)。MAP-2是正常腦組織的神經(jīng)元胞質(zhì)中含量最豐富的細(xì)胞骨架蛋白，具有調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性作用，作為神經(jīng)元突起的可塑性的調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮作用。研究[5]表明，細(xì)胞骨架的異常裝配和信號(hào)傳遞的障礙亦可引發(fā)AD等神經(jīng)退行性疾病。

大腦海馬區(qū)興奮閾值低，海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量多，功能重要，探討海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)育對(duì)闡明AD發(fā)病機(jī)制具有非常重要的意義[9]。本實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)結(jié)果證實(shí)，KO組較對(duì)照組CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂、松散。電鏡下，KO組海馬神經(jīng)元內(nèi)線粒體腫脹變性，嵴斷裂，粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)松懈，密度下降；突觸小泡數(shù)量顯著減少，突觸間隙模糊。電鏡結(jié)果提示，KO組小鼠學(xué)習(xí)記憶的海馬CA3區(qū)神經(jīng)元、神經(jīng)纖維、突觸均發(fā)生變化，這些可能是ApoE基因敲除小鼠產(chǎn)生學(xué)習(xí)記憶功能障礙的原因之一。MAP-2屬于熱穩(wěn)定的磷蛋白，在神經(jīng)元的胞體及樹突內(nèi)分布廣泛，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、軸突和樹突的形成以及突觸可塑性[5,9]。本研究中免疫組化結(jié)果顯示KO組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元中MAP-2的表達(dá)明顯下降。 分析其下降的可能機(jī)制有[8-10]：① ApoE基因敲除后，小鼠海馬CA3區(qū)結(jié)構(gòu)改變，錐體細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)不可逆性損傷，致使細(xì)胞能量代謝障礙；② 錐體細(xì)胞粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成能力削弱；③ ApoE 基因敲除后，引起第二信使系統(tǒng)、谷氨酸受體亞單位和蛋白激酶受損，使得MAP-2表達(dá)下降，神經(jīng)纖維修復(fù)障礙，并進(jìn)一步引發(fā)加重AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展。在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程中，MAP-2可以調(diào)節(jié)微管聚合和穩(wěn)定性，對(duì)神經(jīng)元突起的發(fā)生、延長(zhǎng)和穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用，微管結(jié)構(gòu)蛋白MAP-2的下降，減弱了神經(jīng)纖維軸突和樹突的產(chǎn)生和突觸的重建；MAP-2表達(dá)下降，加重了微管的不穩(wěn)定性，其聚合作用下降，影響細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞骨架的正常裝配，這些變化有可能導(dǎo)致AD病變的發(fā)生[10]。但是，MAP-2 表達(dá)在ApoE 基因敲除小鼠海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元的分子機(jī)制，以及其與神經(jīng)元損傷恢復(fù)與行為能力的改變有何內(nèi)在聯(lián)系，有無(wú)AD特征性的病理改變?nèi)缟窠?jīng)纖維纏結(jié)等尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過ApoE基因敲除小鼠，證實(shí)其存在脂蛋白代謝障礙。ApoE 基因敲除小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)明顯變化，這種改變可能與MAP-2 表達(dá)下降有關(guān)。

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Neuronal morphology and microtubule associated protein 2 expression changes in ApoE knockout mice hippocampal CA3 area

Ji Dan1,2，Huang Dake3，Gui Li3，et al

(1DeptofHistologyandEmbryology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032；2CollegeofBasicMedicine,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230061；3ComprehensiveLaboratory,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)

ObjectiveTo observe the effect of apolipoprotein E knockout (ApoE KO) on structural changes in neuronal morphology of hippocampal CA3 area of mice and microtubule-associated protein 2 (MAP-2) expression.Methods10 normally-fed C57BL/6J wild mice were chosen as the control group, and 10 gene knockout mice were selected as ApoE KO group fed with a common diet for 3 months. Blood lipid changes were detected by spectrophotometer testing. Brain tissues of the two groups of mice were taken out to observe structural changes in hippocampal CA3 area by HE staining and electron microscopy techniques. MAP-2 protein expression changes in hippocampal CA3 area were observed by immunohistochemical technique. Average optical density (MOD) expression changes were analyzed by computer image system.ResultsCompared with the control group, plasma total cholesterol, triglyceride and low density lipoprotein cholesterol levels of the KO group were significantly higher (P<0.05,P<0.01). Light microscope showed that hippocampal CA3 pyramidal cells of KO group mice were smaller, sparsely and loosely arranged. Under the electron microscope, hippocampal neurons mitochondria of KO group swelled and degenerated and ridge disappeared, myelin sheath of nerve fibers relaxed, the number of synaptic vesicles decreased and synaptic cleft obscured. Immunohistochemical results indicated that the MAP-2 in hippocampal neuron was higher in the control group, whereas that of KO group was remarkably diminishing; image analysis showed that MAP-2 OD value in CA3 area of KO group significantly decreased (P<0.05).ConclusionApoE KO may contribute to pathological changes of hippocampal neuron structure of mice and decrease MAP-2 expression, which signifies that ApoE KO is correlated with neurodegenerative disorders.

apolipoprotein E gene knockout; microtubule associated protein 2; ultra microstructure; hippocampal CA3 area; mice

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(編號(hào)：KJ2012A164)

1安徽醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，合肥 2300322安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)部，合肥 2300613安徽醫(yī)科大學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

季 丹，女，講師，碩士研究生； 賈雪梅，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者， E-mail：jiaxueme@126.com

時(shí)間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.010.html

R-332

A

1000-1492(2016)11-1600-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.010

2016-07-06接收