大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及CM-DiI標(biāo)記后的傳代示蹤

周 虹，郭 杏，李 丹，高小春，熊愛(ài)兵，譚美云

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大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及CM-DiI標(biāo)記后的傳代示蹤

周 虹1，郭 杏1，李 丹1，高小春1，熊愛(ài)兵1，譚美云2

目的 建立大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)體外分離培養(yǎng)和細(xì)胞標(biāo)記的方法，探討CM-DiI標(biāo)記ADSCs在體外傳代示蹤的可行性。方法 無(wú)菌切取SD大鼠腹股溝脂肪組織，運(yùn)用酶原消化并差速貼壁的方法獲取原代細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)，對(duì)第3代ADSCs進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定和成骨成脂分化能力鑒定。采用CM-DiI標(biāo)記第3代ADSCs并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光標(biāo)記情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記率。結(jié)果 ADSCs呈長(zhǎng)梭形、漩渦樣生長(zhǎng)，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度加快。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CD29、CD90陽(yáng)性表達(dá)，CD34、CD45、CD31陰性表達(dá)。茜素紅和油紅O染色顯示ADSCs具有成骨成脂分化潛能。CM-DiI標(biāo)記的紅色熒光存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，不存在于細(xì)胞核，傳代培養(yǎng)后熒光有所衰減，第3、6、9代的熒光標(biāo)記率分別為97.09%、66.21%和37.86%。結(jié)論 大鼠ADSCs的生長(zhǎng)增殖能力強(qiáng)，具有多向分化潛能，采用CM-DiI標(biāo)記ADSCs簡(jiǎn)單易行且示蹤效果良好，可為后期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；CM-DiI；細(xì)胞標(biāo)記

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)在2001年首先由Zuk et al[1]從人脂肪組織中發(fā)現(xiàn)，其類似于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠穩(wěn)定增殖及自我更新，具有多向分化潛能。與其他干細(xì)胞相比，ADSCs具有來(lái)源廣泛、取材容易且獲取率高、體外擴(kuò)增快、細(xì)胞老化率低、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)[2]，其本身也具有血管原性和抗炎活性，能促進(jìn)組織新生血管形成[3]，這些優(yōu)點(diǎn)使得ADSCs成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞而備受關(guān)注。CM-DiI是一種親脂性熒光染料，不溶于水，容易嵌進(jìn)生物質(zhì)膜內(nèi)并作定向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)標(biāo)記整個(gè)胞膜，也能通過(guò)活體細(xì)胞胞飲作用進(jìn)入胞質(zhì)從而標(biāo)記整個(gè)胞質(zhì)[4]，并且其無(wú)細(xì)胞毒性，不影響細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，標(biāo)記時(shí)間長(zhǎng)，易于操作，適合標(biāo)記和示蹤細(xì)胞[5]。該研究以CM-DiI標(biāo)記ADSCs并傳代示蹤，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)傳代后的熒光標(biāo)記率，為后期進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)HyClone 公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Ⅰ型膠原酶(美國(guó)Sigma公司)；成脂成骨誘導(dǎo)液(廣州賽業(yè)公司)；CD29、CD90、CD34、CD45、CD31抗體及大鼠相應(yīng)的同型對(duì)照抗體、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；CM-DiI(美國(guó) Molecular Probe 公司，編號(hào)c7000)；生物安全柜(西班牙Telstar公司，Telstar Bio ⅡA)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo 公司)；倒置相差顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雄性SPF 級(jí) SD 大鼠 2只，150～180 g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ADSCs分離、培養(yǎng)、傳代 用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后將其脫頸處死，在75%酒精中浸泡消毒10 min，無(wú)菌切取兩側(cè)腹股溝處皮下脂肪組織，放于PBS中反復(fù)沖洗3次，盡可能完全剔除血管和筋膜，再用眼科剪將其剪碎至糊狀，裝入無(wú)菌的50 ml離心管中，加入2～3倍體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，置于37 ℃恒溫水浴中震蕩消化60 min(期間反復(fù)震蕩混勻至少3次)，直至脂肪組織呈乳糜狀，加入等量完全培養(yǎng)基終止消化，70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾后再加入完全培養(yǎng)基1 500 r/min離心10 min,棄上清液和上層脂肪液，加入PBS吹打混勻后1 000 r/min離心5 min,棄上清液，最后加入完全培養(yǎng)基重懸吹打混勻，以5×105/ml細(xì)胞數(shù)接種，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，全量換液。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，2～3 d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 流式細(xì)胞儀鑒定ADSCs 將第3代細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后分裝入10個(gè)EP管中，制備100 μl，細(xì)胞密度為1×106/ml的單細(xì)胞懸液。前5管為陰性對(duì)照，加入等量相應(yīng)的同型對(duì)照抗體。其余5管分別加入CD29-APC、CD90-PE-Cy7、CD34-PE、CD45-PerCP、CD31-PE各1 μl，室溫避光孵育15～20 min，400 μl PBS重懸后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.3 ADSCs的成骨成脂分化潛能 以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度將第3代ADSCs接種到6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)分別更換成骨和成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，更換等量的完全培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。成骨誘導(dǎo)3周后采用茜素紅染色觀察細(xì)胞的成骨分化效果。成脂分化誘導(dǎo)2周后采用油紅O染色觀察細(xì)胞的成脂分化效果。陰性對(duì)照組也進(jìn)行相應(yīng)染色。

1.3.4 CM-DiI熒光標(biāo)記ADSCs 取出一支CM-DiI，室溫避光溶解后向管中加入50 μl DMSO混勻，以4 μl CM-DiI與1 ml PBS配成濃度為4 g/L的工作液。將1×106個(gè)細(xì)胞重懸于1 ml CM-DiI工作液中，先將其置于37 ℃避光孵育20 min，再置于4 ℃避光孵育15 min。1 000 r/min離心5 min,將細(xì)胞分為3部分，一部分用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)CM-DiI的標(biāo)記率，另一部分用于熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡照相，最后一部分用于傳代培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的形態(tài)學(xué)觀察 在倒置相差顯微鏡下觀察，剛接種到培養(yǎng)瓶的原代細(xì)胞比較雜，有大量呈圓形的細(xì)胞和少數(shù)脂滴漂浮，見(jiàn)圖1A。約4 h時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始貼壁，24 h換液時(shí)見(jiàn)部分細(xì)胞呈梭形、三角形，但仍有少量脂滴，見(jiàn)圖1B。此后的2～4 d，細(xì)胞大部分伸展、體積變大，在4 d再次換液時(shí)已可見(jiàn)細(xì)胞呈集落或團(tuán)簇樣生長(zhǎng)，呈魚(yú)群和旋渦狀，見(jiàn)圖1C。細(xì)胞在7～8 d已有80%～90%融合，隨即消化傳代。消化傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度明顯較原代細(xì)胞快，細(xì)胞逐漸變純，已無(wú)脂滴漂浮，見(jiàn)圖1D。到第3代后的細(xì)胞越發(fā)純化，約不到1 h時(shí)即貼壁，生長(zhǎng)增殖迅速，形態(tài)均一，呈現(xiàn)明顯的魚(yú)群和旋渦狀生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1E。連續(xù)傳至11代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖1F。

圖1 倒置相差顯微鏡下大鼠ADSCs形態(tài)觀察

A：剛接種的原代細(xì)胞形態(tài) ×40；B：接種24 h時(shí)的細(xì)胞形態(tài) ×100；C：接種4 d時(shí)的細(xì)胞形態(tài) ×40；D：第1代細(xì)胞形態(tài) ×40；E：第3代細(xì)胞形態(tài) ×40；F：第11代細(xì)胞形態(tài) ×40

2.2 流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型 第3代ADSCs的表面標(biāo)志物 CD29、CD90陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率分別為95.04%、99.65%；而 CD34、CD45、CD31陰性表達(dá)，表達(dá)率分別為0.17%、0.20%、0.14%。見(jiàn)圖2。

2.3 ADSCs的體外誘導(dǎo)成骨成脂分化 成骨誘導(dǎo)3周時(shí)，見(jiàn)部分細(xì)胞形態(tài)較模糊，部分呈橢圓形、多形性，細(xì)胞間形成鈣質(zhì)沉積，茜素紅染色呈陽(yáng)性，見(jiàn)圖3A；成脂誘導(dǎo)4 d時(shí)，可見(jiàn)部分細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)榉蚀笤鰧挼亩嘈涡约?xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)小脂滴，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，脂滴開(kāi)始增多、變大，2周時(shí)可見(jiàn)大多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不一的脂滴，油紅O染色呈陽(yáng)性,見(jiàn)圖3B；對(duì)照組染色呈陰性結(jié)果，見(jiàn)圖3C、3D。

2.4 ADSCs的CM-DiI體外標(biāo)記結(jié)果 第3代ADSCs標(biāo)記好后熒光顯微鏡觀察，幾乎全部細(xì)胞標(biāo)記為紅色熒光，見(jiàn)圖4A，貼壁后激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示CM-DiI標(biāo)記細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，不標(biāo)記細(xì)胞核，見(jiàn)圖4B。傳代培養(yǎng)后，熒光有所衰減。傳第6代時(shí)，紅色熒光仍較強(qiáng)，但較前減弱，見(jiàn)圖4C；傳第9代時(shí)熒光強(qiáng)度明顯減弱，但未消失，見(jiàn)圖4D。

圖2 流式細(xì)胞儀鑒定大鼠ADSCs

A:CD29-APC;B:CD90-PE-Cy7;C:CD34-PE;D:CD45-PerCP;E:CD31-PE

圖3 大鼠ADSCs成骨成脂分化

A：成骨實(shí)驗(yàn)組茜素紅染色 ×100；B：成脂實(shí)驗(yàn)組油紅O染色 ×200；C：成骨對(duì)照組茜素紅染色 ×100；D：成脂對(duì)照組油紅O染色 ×100

第3、6、9代ADSCs的CM-DiI熒光標(biāo)記率分別為97.09%、66.21%和37.86%，見(jiàn)圖5。

3 討論

研究[6]顯示，ADSCs與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有著相似的生物學(xué)性狀、細(xì)胞表型和分化潛能，但其有來(lái)源豐富、增殖率高、自體移植不產(chǎn)生排異反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)藥和組織工程領(lǐng)域中。本實(shí)驗(yàn)采用酶原消化并差速貼壁的方法分離培養(yǎng)ADSCs，酶的濃度和消化時(shí)間是原代細(xì)胞提取成功的關(guān)鍵因素，實(shí)驗(yàn)中采用0.1%的Ⅰ型膠原酶消化60 min，多次預(yù)實(shí)驗(yàn)證明這是一個(gè)比較好的濃度和時(shí)間。對(duì)于取材部位，近年來(lái)先后有文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道取材于背部、頸部、附睪、腸系膜、腹腔的ADSCs。但在之前的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)附睪、腹腔等處的脂肪組織都較少，難以滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞量的需求，所以本實(shí)驗(yàn)在取材時(shí)選取SD大鼠腹股溝處皮下脂肪組織，此處脂肪組織最為豐富，便于盡可能多的分離ADSCs，只要盡可能剔除其中的血管和筋膜，避免過(guò)多的雜細(xì)胞混入就能提取出較純的ADSCs。在消化脂肪組織的過(guò)程中未使用任何裂解液來(lái)裂解混雜的紅細(xì)胞，因紅細(xì)胞有不貼壁的特性，待ADSCs貼壁后便可以通過(guò)換液去除，這樣也可以避免裂解液對(duì)ADSCs的損傷和影響作用[9]。同時(shí)通過(guò)換液和消化傳代可以去除漂浮的脂滴和雜細(xì)胞，使細(xì)胞得以純化。在培養(yǎng)過(guò)程中，見(jiàn)ADSCs呈長(zhǎng)梭形、多角形、魚(yú)群樣、漩渦樣生長(zhǎng)，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度快，連續(xù)傳至11代細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，證明其生長(zhǎng)增殖能力強(qiáng)。

圖4 CM-DiI標(biāo)記大鼠ADSCs

A：熒光顯微鏡下CM-DiI標(biāo)記的第3代懸浮狀態(tài)的ADSCs ×100；B：激光掃描共聚焦顯微鏡下CM-DiI標(biāo)記的貼壁狀態(tài)的ADSCs×400；C：熒光顯微鏡下CM-DiI標(biāo)記的第6代貼壁狀態(tài)的ADSCs ×100；D：熒光顯微鏡下CM-DiI標(biāo)記的第9代貼壁狀態(tài)的ADSCs ×100

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3、6、9代ADSCs的CM-DiI熒光標(biāo)記率

已有研究[5,10-11]表明，ADSCs能夠表達(dá)CD13、CD44、CD29、CD73、CD90、CD59、CD105、CD166、STRO-1等，而不表達(dá)CD3、CD4、CD31、CD34、CD45、CD56、CD106等。該研究選取CD29、CD90、CD34、CD45、CD31作為檢測(cè)的表面標(biāo)志物，結(jié)果顯示CD29、CD90陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率分別為95.04%、99.65%；CD34、CD45、CD31陰性表達(dá)，表達(dá)率分別為0.17%、0.20%、0.14%，可以初步證明本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)所得細(xì)胞為ADSCs，且細(xì)胞純度較高。要進(jìn)一步證實(shí)其為ADSCs還必須對(duì)其進(jìn)行分化誘導(dǎo)檢測(cè)，該研究對(duì)第3代實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞行成骨成脂誘導(dǎo)分化，在誘導(dǎo)3周時(shí)對(duì)其進(jìn)行茜素紅染色，可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)沉積，在誘導(dǎo)2周時(shí)對(duì)其行油紅O染色，可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大小不一的脂滴形成，而對(duì)照組細(xì)胞無(wú)上述表現(xiàn)，證明所分離培養(yǎng)細(xì)胞具有成骨成脂分化潛能，為ADSCs。

近年來(lái)，用于細(xì)胞標(biāo)記示蹤的方法主要有熒光染料標(biāo)記法(DiI、DAPI、PKH26、Hoechst33342/33258等)、GFP標(biāo)記法、核酸標(biāo)記法(同位素標(biāo)記、5-BrdU標(biāo)記等)及Y染色體標(biāo)記法等[12]，都各有其特點(diǎn)。但是上述方法或多或少有操作繁瑣、標(biāo)記時(shí)間短且標(biāo)記率不高、對(duì)細(xì)胞有一定毒性等缺點(diǎn)而限制了其應(yīng)用。而CM-DiI為一種羰花青親脂性熒光染料，其熒光激發(fā)波長(zhǎng)為553 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為570 nm，能夠與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜結(jié)合發(fā)出強(qiáng)大的紅色熒光，并且對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，適于標(biāo)記和示蹤細(xì)胞[13]。我國(guó)也有研究者用CM-DiI標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和兔外周血平滑肌祖細(xì)胞[14-15]，均證明CM-DiI標(biāo)記細(xì)胞簡(jiǎn)單易行、染色速度快、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，具有良好的應(yīng)用前景。該研究用CM-DiI標(biāo)記SD大鼠ADSCs，由于ADSCs為貼壁細(xì)胞，標(biāo)記時(shí)可采用以下兩種方法：一是將貼壁細(xì)胞消化后離心成細(xì)胞沉淀，再直接用CM-DiI工作液重懸，先將其置于37 ℃避光孵育20 min，再置于4 ℃避光孵育15 min；二是將貼壁細(xì)胞用PBS清洗2～3遍后，直接用CM-DiI工作液標(biāo)記，保證染液恰好覆蓋全層細(xì)胞即可，先將其置于37 ℃避光孵育20 min，再置于4 ℃避光孵育15 min。該研究采用第一種方法標(biāo)記第3代SD大鼠ADSCs，熒光顯微鏡下觀察幾乎全部細(xì)胞標(biāo)記為紅色熒光，流式細(xì)胞儀測(cè)標(biāo)記率為97.09%，傳代至第6代時(shí)熒光仍較強(qiáng)，標(biāo)記率為66.21%，傳代至第9代時(shí)熒光減弱較快，但仍未消失，標(biāo)記率為37.86%，證明CM-DiI標(biāo)記后的ADSCs可穩(wěn)定傳代，維持熒光存在。傳代后標(biāo)記率減低、熒光強(qiáng)度逐漸減弱的原因可能是：① 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞換液、傳代未能完全避光；② 細(xì)胞增殖分裂導(dǎo)致染料相對(duì)減少；③ CM-DiI自發(fā)出現(xiàn)熒光泯滅；④ 顯微鏡觀察拍照時(shí)間過(guò)久導(dǎo)致熒光減少。

綜上所述，運(yùn)用酶原消化并差速貼壁的方法可獲取純度高、生長(zhǎng)增殖能力強(qiáng)和具有多向分化潛能的ADSCs，CM-DiI標(biāo)記細(xì)胞簡(jiǎn)單易行，標(biāo)記率高，具有標(biāo)記細(xì)胞后傳代示蹤的可行性，可作為標(biāo)記和示蹤SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的良好熒光染料。

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Isolation, culture of rat adipose-derived stem cells and passage tracing after CM-DiI labelinginvitro

Zhou Hong,Guo Xing,Li Dan,et al

(DeptofBurnsandPlasticSurgery,TheAffiliatedHospitalofSouthMedicalUniversity,Luzhou646000)

ObjectiveToestablishamethodforisolation,cultureandcelllabelingofratadipose-derivedstemcells(ADSCs)andinvestigatethepassagetracingfeasibilityofCM-DiIlabeledADSCsin vitro.MethodsAdiposetissuewasharvestedfromtheinguinalfatpadofSprague-Dawleyratsundersterileconditions.Bymeansofcombiningzymogendigestionwithdifferentialvelocityadherence,theprimarycellswereisolated.Theywereusedonserialsubcultivation.Themorphologyofcellswasobservedbyinvertedphasecontrastmicroscope.ThemolecularphenotypeanddifferentiationpotentialityofthreepassagedADSCswereidentified.ThreepassagedADSCswerelabeledbyCM-DiIandtheywereusedonserialsubcultivation.Fluorescencelabelingofcellswereobservedunderthefluorescenceinvertedmicroscopeandlaserscanningconfocalmicroscope.Thelabelingratewasdetectedbyflowcytometry.ResultsADSCsshowedlongspindleshapeandvortexlikegrowth.Afterpassages,thegrowthandproliferationrateofcellswereaccelerated.ThecellswereidentifiedpositiveforCD29andCD90makers,andtheyshowedthelackofCD34,CD45andCD31expressions.AlizarinredandoilredOstainingshowedADSCscouldbedifferentiatedtoosteoblastsandadipocytes.TheredfluorescenceofCM-DiIlabelingexistedinthecellmembraneandcytoplasm,whichdidnotexistinthecellnucleus.Afterpassages,thefluorescencewasattenuated,andthefluorescencelabelingratesofthethird,sixthandninthpassagewere97.09%, 66.21%and37.86%,respectively.ConclusionRatADSCscangrowandproliferaterapidly,andtheyhavemultipledifferentiationpotential.CM-DiIcanlabelADSCssimplyandeffectively.Thesecanprovidethebasisforthefollowingexperimentin vivo.

adipose-derivedstemcells;cellculture;CM-DiI;celllabeling

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31271049)；四川省衛(wèi)生廳科研課題(編號(hào)：090228)；瀘州市科學(xué)技術(shù)局指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目 (編號(hào)：2010-6)

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1整形燒傷科、2骨關(guān)節(jié)外科，瀘州 646000

周 虹，女，碩士研究生； 郭 杏，女，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:gx412@126.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.008.html

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1000-1492(2016)11-1590-06

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.008

2016-06-27接收