人EBI3蛋白及其突變體的表達(dá)及定位研究

邢雪梅，耿慧武，潘林鑫，劉澤宇，姚 亮，鄧歡歡，劉曉穎，范禮斌

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人EBI3蛋白及其突變體的表達(dá)及定位研究

邢雪梅1，耿慧武1，潘林鑫1，劉澤宇1，姚 亮2，鄧歡歡2，劉曉穎1，范禮斌1

目的 研究人EB病毒誘導(dǎo)的基因3(EBI3)及其突變體在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)及定位差異及其原因。方法 基于NCBI數(shù)據(jù)庫中人EBI3氨基酸的序列分析，利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建人EBI3真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-EBI3-FLAG、單獨(dú)包含氨基端或羧基端Ⅲ型纖連蛋白(FN3)結(jié)構(gòu)域的缺失突變體的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG和pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG以及第210位天冬氨酸(Asp)點(diǎn)突變體Asp210的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG；Western blot方法檢測EBI3及其突變體在HEK 293T細(xì)胞中的表達(dá)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察人EBI3及各突變體在COS7細(xì)胞中的定位。結(jié)果 成功構(gòu)建了下游攜帶FLAG標(biāo)簽的人EBI3及其突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒；Western blot結(jié)果顯示重組蛋白均能在HEK 293T細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)；經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察，EBI3及其缺失突變體在COS7細(xì)胞的表達(dá)位置發(fā)生明顯變化。結(jié)論 人EBI3及其突變體真核表達(dá)質(zhì)粒均能在HEK 293T、COS7細(xì)胞中成功表達(dá)；人EBI3缺失突變體在COS7細(xì)胞中的定位發(fā)生明顯變化，氨基端結(jié)構(gòu)域可能在EBI3蛋白的正確定位中發(fā)揮重要作用；EBI3蛋白的第210位Asp的突變影響了其在細(xì)胞內(nèi)的定位。

EBI3；質(zhì)粒構(gòu)建；Western blot；免疫熒光

EB病毒誘導(dǎo)的基因3 (Epstein-Barr virus-induced gene 3，EBI3)是從EB病毒感染的B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并命名，定位于染色體的19p13.2/3區(qū)域，全長1 161 bp，編碼的成熟EBI3蛋白是一種34 ku 的可溶分泌性糖蛋白[1]。人體內(nèi)，EBI3主要表達(dá)于淋巴器官如扁桃體、脾，提示EBI3是重要的免疫因子，參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。EBI3蛋白也在胎盤中大量表達(dá)，且隨著妊娠時(shí)間的延續(xù)而增加。EBI3與p19、p28、p35及p40同屬于IL-12家族，與p40在結(jié)構(gòu)上有27%的同源性[2]。EBI3可分別與p28、p35結(jié)合，形成細(xì)胞因子IL-27(p28/EBI3)和IL-35(p35/EBI3)[3-4]。氨基酸序列分析顯示，EBI3蛋白包括兩個(gè)串聯(lián)的經(jīng)過修飾的Ⅲ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域FN3，該結(jié)構(gòu)域通常包含兩對半胱氨酸殘基形成的二硫鍵，以及一個(gè)典型的Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS)的基序[5-6]。該研究通過運(yùn)用分子克隆技術(shù)，結(jié)合蛋白數(shù)據(jù)庫中已知人EBI3蛋白的信息，構(gòu)建了單獨(dú)包含氨基端或羧基端FN3結(jié)構(gòu)域的EBI3的缺失突變體，分別轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞HEK 293T和COS7細(xì)胞，對突變體的表達(dá)及定位進(jìn)行比較。針對IL-27結(jié)構(gòu)的研究[6]表明，EBI3蛋白的第210位的天冬氨酸Asp參與形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)表面結(jié)構(gòu)，是影響EBI3與IL-27p28的對應(yīng)正電荷區(qū)域結(jié)合的關(guān)鍵殘基。設(shè)想Asp210可能也參與EBI3與其他蛋白的結(jié)合，因此構(gòu)建了EBI3Asp210點(diǎn)突變體的真核重組質(zhì)粒，了解其表達(dá)和定位的改變。該研究旨在通過探討結(jié)構(gòu)域及關(guān)鍵氨基酸殘基的改變對EBI3蛋白在真核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)及細(xì)胞定位的影響，進(jìn)一步揭示EBI3蛋白在人類免疫系統(tǒng)中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞株、質(zhì)粒和引物 真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌、COS7及HEK 293T細(xì)胞株、含人EBI3全長cDNA序列的質(zhì)粒均為本生物實(shí)驗(yàn)室保存；實(shí)驗(yàn)使用引物由上海生工生物有限公司合成。

1.1.2 主要工具酶和試劑 Pfu PCR MasterMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；PrimeSTAR Max DNA Polymerase(日本TaKaRa公司)；T4 DNA Ligase、DNA限制性內(nèi)切酶(加拿大Fermentas公司)；DNA膠回收試劑盒(美國Axygen公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(美國OMEGA公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國CLARK公司)； LipofectamineTM2000、Opti-MEM Reduced Serum Medium(美國Invitrogen公司)；Western blot相關(guān)試劑(上海碧云天生物技術(shù)研究所)； Monoclonal anti-FLAG M2(美國Sigma公司)；TRITC/FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；熒光封片膠(丹麥DAKO公司)；PVDF膜(加拿大BioBasic公司)；SuperSignal West Pico顯色試劑盒(美國Pierce公司)。

1.1.3 主要儀器 紫外-可見分光光度計(jì)(美國Nano-Drop公司)；Leica TCS SP5共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；超聲破碎儀(VC750型，美國Sonic公司)；電泳儀(BIO RAD 041BR型，美國Bio-Rad公司)；垂直電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳槽(北京六一儀器廠)；Bioshine ChemiQ化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 EBI3突變體設(shè)計(jì) 分析美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中人EBI3序列的結(jié)構(gòu)域信息，EBI3蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)串聯(lián)的保守性區(qū)域，即經(jīng)過修飾的纖連蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域FN3，分別包含第47～115、129～224位氨基酸。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)構(gòu)建了EBI3野生型以及分別包含氨基端、羧基端FN3結(jié)構(gòu)域的三種突變體,同時(shí)構(gòu)建了將EBI3第210位天冬氨酸突變?yōu)楸彼岬腁sp210點(diǎn)突變體，見圖1。

圖1 EBI3蛋白結(jié)構(gòu)及突變體質(zhì)粒構(gòu)建示意圖(紅線為210位天冬氨酸突變?yōu)楸彼?

1.2.2 野生型人EBI3及缺失突變體構(gòu)建 運(yùn)用軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)出下游帶FLAG標(biāo)簽的EBI3全長及其突變體的引物(表1，下劃線部分為FLAG標(biāo)簽序列)，設(shè)計(jì)的特定基因目的片段均構(gòu)建于真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，特異性引物均由上海生工生物工程有限公司合成。以含人EBI3全長cDNA序列的質(zhì)粒為模板，采用25 μl PCR體系，使用廠商推薦的PCR反應(yīng)程序，分別用Pfu MasterMix擴(kuò)增出EBI3-FLAG、用PrimeSTAR Max 擴(kuò)增出EBI3(1～135)-FLAG和EBI3(125～230)-FLAG目的片段，DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。分別將真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和回收的PCR產(chǎn)物雙酶切后進(jìn)行凝膠電泳，并用DNA膠回收試劑盒再次回收,將回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶于16 ℃連接16 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)約16 h，挑取單克隆在含有氨芐青抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)約12 h；堿裂解法提取質(zhì)粒后做雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 點(diǎn)突變體構(gòu)建 構(gòu)建了點(diǎn)突變體Asp210的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAGEBI3，引物設(shè)計(jì)見表1。配制突變PCR反應(yīng)液體系，在1.5 ml離心管中加PrimeSTAR Max Premix(2×)12.5 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，測序正確的pcDNA3.1-EBI3-FLAG質(zhì)粒模板30 ng，加雙蒸水至25 μl。反應(yīng)條件：98 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 6 min，共32個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，PCR反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物4 ℃保存，先取5 μl PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小正確后，再將裝有余下PCR產(chǎn)物的離心管迅速放入冰浴5 min，之后加入2 μl DpnⅠ酶，37 ℃水浴2 h消化模板，隨后將離心管內(nèi)溶液全部轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確的克隆送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將HEK 293T細(xì)胞和COS7細(xì)胞以適當(dāng)濃度分別接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含青霉素和鏈霉素各100 U/ml)中，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

表1 質(zhì)粒名稱及引物序列

1.2.5 Western blot檢測EBI3野生型和突變體的蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染前約24 h，傳代HEK 293T細(xì)胞，以1×105～2×105/cm2的密度均勻接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長至80%～90%匯合度時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，重組質(zhì)粒與LipofectamineTM2000的比例為1 μg ∶2 μl。轉(zhuǎn)染后48 h分別收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗2次，加入含有蛋白酶抑制劑PMSF的細(xì)胞裂解液，4 ℃混旋裂解1 h，14 000 r/min離心20 min收集上清液，經(jīng)蛋白定量后制成樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳；100 V電轉(zhuǎn)膜1 h；用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉PVDF膜2 h，F(xiàn)LAG-M2抗體(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗；二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST漂洗后顯影。

1.2.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染前約24 h，將滅菌過的蓋玻片置于35 mm的培養(yǎng)皿，用多聚賴氨酸溶液包被后自然晾干。傳代COS7細(xì)胞，以1×105～2×105/cm2的密度將細(xì)胞均勻接種于預(yù)置蓋玻片的培養(yǎng)皿，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至50%～60%匯合度時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。分別轉(zhuǎn)染EBI3野生型及其突變體質(zhì)粒，重組質(zhì)粒與LipofectamineTM2000的比例為1 μg ∶1 μl。培養(yǎng)6 h后換含有10%血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)約24 h。取出蓋玻片，預(yù)冷的PBS清洗后依次用預(yù)冷的甲醇(-20 ℃冷藏)和乙醇(室溫)固定細(xì)胞，預(yù)冷的PBS清洗后用含1%脫脂奶粉的TBST室溫封閉0.5 h,PBS清洗后Monoclonal anti-FLAG M2(1 ∶200)室溫孵育2 h，TRITC/FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1 ∶200)室溫孵育1 h，PBS清洗后0.5 μg/ml 的DAPI溶液染核，PBS清洗后封片，4 ℃儲存。

2 結(jié)果

2.1 EBI3缺失突變體的構(gòu)建與鑒定 應(yīng)用堿裂解法抽提重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EBI3-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG，經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后置紫外凝膠分析儀下觀察，在相應(yīng)位置出現(xiàn)目的條帶，酶切正確的克隆送測序，結(jié)果證實(shí)目的片段正確插入到pcDNA3.1(+)載體中。見圖2。

2.2 EBI3點(diǎn)突變體的鑒定 點(diǎn)突變PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl經(jīng)凝膠電泳鑒定，確認(rèn)PCR產(chǎn)物片段符合pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG的大小，結(jié)果見圖3A。同樣使用堿裂解法抽提EBI3點(diǎn)突變體質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定正確，見圖3B。送重組質(zhì)粒至上海生工生物工程有限公司測序，結(jié)果運(yùn)用BLAST 軟件比對點(diǎn)突變測序序列，確認(rèn)點(diǎn)突變重組質(zhì)粒序列正確，見圖3C。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定圖

M1：λDNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ Marker；M2：TaKaRa DL2000 Marker；1：pcDNA3.1-EBI3-FLAG酶切鑒定結(jié)果；2：pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG酶切鑒定結(jié)果；3：pcDNA3.1- EBI3(125～230)-FLAG酶切鑒定結(jié)果

圖3 pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG重組質(zhì)粒的鑒定

A: pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖，M：λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ Marker；1：pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG PCR產(chǎn)物；B：pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG酶切鑒定圖，M：λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ Marker；2：pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG 酶切鑒定結(jié)果；C：pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG與野生型的EBI3序列比對圖

圖4 Western blot檢測EBI3及缺失突變體在HEK 293T細(xì)胞中的表達(dá)

1：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EBI3-FLAG的細(xì)胞裂解液；2：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG的細(xì)胞裂解液；3：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG的細(xì)胞裂解液；4：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EBI3(125～230) -FLAG的細(xì)胞裂解液

2.3 EBI3及其突變體在HEK 293T細(xì)胞中的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，Western blot檢測到HEK 293T細(xì)胞裂解液中野生型和突變體蛋白，其分子量與預(yù)期分子量一致，即EBI3-FLAG、EBI3-D210A-FLAG的分子量均為33 ku，EBI3(1～135)-FLAG、EBI3(125～230)-FLAG的分子量分別為15 ku 和12 ku。見圖4。

2.4 EBI3及其突變體在COS7細(xì)胞中的定位 轉(zhuǎn)染24 h后經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察：野生型EBI3在胞質(zhì)中大量表達(dá)且存在斑塊狀分布，細(xì)胞核中有極少量表達(dá)；缺失突變體EBI3(1～135)-FLAG在胞質(zhì)中表達(dá)大幅減少，在核膜處和細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)增多；EBI3(125～230) -FLAG表達(dá)主要集中于核膜和核內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)中少量表達(dá)；Asp210點(diǎn)突變體的表達(dá)蛋白EBI3-D210A-FLAG在胞質(zhì)、核膜與核內(nèi)均有表達(dá)。見圖5。

3 討論

固有免疫系統(tǒng)是機(jī)體防止外來病原體侵襲的天然防線，EBI3蛋白通過構(gòu)成不同的細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著免疫防御和免疫調(diào)節(jié)的作用。一方面可以誘導(dǎo)產(chǎn)生IFNγ，促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和增殖；另一方面通過抑制T細(xì)胞增殖等防止過度的炎癥反應(yīng)的發(fā)生[7-8]。機(jī)體中的EBI3蛋白與IL-12、IL-23共同由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及B細(xì)胞等合成，通過病原體特異性抗體識別模式被激活而快速發(fā)揮非特異性抗感染等作用[9-11]，另外作為IL-35的重要亞基，EBI3也可以由Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌，亦發(fā)現(xiàn)在外周γδT細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中，EBI3可與p35共同表達(dá)[8,12]。在機(jī)體中，EBI3的分泌量遠(yuǎn)大于其參與構(gòu)成IL-27、IL-35的需要量，因而Collison et al[7]認(rèn)為多分泌的EBI3可能以單體或者同二聚體的形式拮抗IL-27或IL-35的作用。機(jī)體中EBI3表達(dá)的異常與多種疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，如炎癥性腸炎克羅恩病、嚴(yán)重的腫瘤性疾病霍奇金病、鼻咽癌等, 在宮頸癌組織中亦發(fā)現(xiàn)EBI3表達(dá)量顯著提高[13-14]。

圖5 EBI3及其突變體在COS7細(xì)胞中的表達(dá)及定位 ×1 500

本研究成功構(gòu)建了野生型EBI3及分別包含氨基端、羧基端結(jié)構(gòu)域的缺失突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒，并且構(gòu)建了將210位天冬氨酸突變?yōu)楸彼岬亩c(diǎn)突變真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞HEK 293T、COS7細(xì)胞系中均能成功表達(dá)。免疫熒光定位顯示野生型EBI3主要在COS7細(xì)胞胞質(zhì)中呈斑塊狀分布，且位于胞核的一側(cè)，疑似分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，Devergne et al[1]也認(rèn)為EBI3蛋白分子傾向于以非成熟的形式與分子伴侶calnexin結(jié)合積聚于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，但仍需進(jìn)一步通過對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行熒光標(biāo)記加以確認(rèn)。EBI3(1～135)-FLAG融合蛋白中包含了氨基端及一個(gè)FN3結(jié)構(gòu)域，與野生型相比，EBI3(1～135)-FLAG在細(xì)胞質(zhì)中的分布減少，但在胞質(zhì)內(nèi)仍可見斑塊狀集中分布，EBI3(125～230)-FLAG融合蛋白中包含了另一個(gè)位于羧基端的FN3結(jié)構(gòu)域，該突變體蛋白分子較集中分布在核膜，在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)量極低。比較免疫熒光的定位差異，可以推測EBI3蛋白分子中的氨基端存在重要的結(jié)構(gòu)幫助其定位于細(xì)胞質(zhì)，該結(jié)構(gòu)對于EBI3蛋白的分泌亦發(fā)揮重要作用；EBI3蛋白分子中的兩個(gè)FN3結(jié)構(gòu)域則可能參與了EBI3蛋白與其他蛋白分子的結(jié)合過程。Asp210突變體的表達(dá)蛋白EBI3-D210A-FLAG在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成的斑塊較為均勻，其在核膜處的分布也較集中,推測EBI3蛋白的第210位的Asp既是影響該蛋白分子與p28結(jié)合的關(guān)鍵殘基，也可能影響其在細(xì)胞內(nèi)定位。

本課題組在前期的酵母雙雜交文庫篩選工作中發(fā)現(xiàn)EBI3蛋白可與多個(gè)蛋白相互作用，但是作用的具體結(jié)構(gòu)位置尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過研究含有EBI3不同結(jié)構(gòu)域突變體及Asp210點(diǎn)突變體的蛋白表達(dá)和定位差異，為后續(xù)進(jìn)一步揭示EBI3蛋白的功能提供重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

[1] Devergne O, Hummel M, Koeppen H,et al.A novel interleukin-12 p40 related protein induced by latent Epstein-Barr virus infection in B lymphocytes[J].J Virol,1996,70(2):1143-53.

[2] Devergne O, Coulomb-L′Hermine A,Capel F,et al. Expression of Epstein-Barr virus-induced gene 3, an interleukin-12 p40-related molecule, through-out human pregnancy:involvement of syncytiotrophoblasts and extravillous trophoblasts[J].Am J Pathol,2001,159(5):1763-76.

[3] Kastelein, R A, Hunter C A, Cua D J. Discovery and biology of IL-23 and IL-27:related but functionally distinct regulators of inflammation[J].Annu Rev Immunol,2007,25:221-42.

[4] Goriely S,Neurath M F. Goldman M. How microorganisms tip the balancebetween interleukin-12 family members[J].Nat Rev Immunol, 2008, 8(1):81-6.

[5] Bazan J F. Structural design and molecular evolution of a cytokine recep-tor superfamily[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87(18):6934-8.

[6] Rousseau F,Basset L,Froger J,et al. IL-27 structural analysis demonstrates similarities with ciliary neurotrophic factor(CNTF) and leads to the identi-fication of antagonistic variants[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2010,107(45):19420-5.

[7] Collison L W,Vignali D A.Interleukin-35:odd one out or part of the family?[J]. Immunol Rev, 2008, 226:248-62.

[8] Collison L W,Workman C J, Kuo T T,et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function[J]. Nature, 2007, 450(7169):566-9.

[9] Ma X, Chow J M, Gri G,et al. The interleukin 12 p40 gene promoter is primed by interferon gamma in monocytic cells[J]. J Exp Med,1996, 183(1):147-57.

[10]Pflanz S,Timans J C,Cheung J,et al. IL-27, a heterodimeric cytokine com-posed of EBI3 and p28 protein, induces proliferation of naive CD4+ T cells[J]. Immunity, 2002, 16(6):779-90.

[11]Hibbert L,Pflanz S,De Waal Malefyt R,et al. IL-27 and IFN-alpha signalviaStat1 and Stat3 and induce T-Bet and IL-12Rbeta2 in naive T cells[J]. J Interferon Cytokine Res, 2003, 23(9):513-22.

[12]Devergne O,Birkenbach M,Kieff E. Epstein-Barr virus-induced gene 3 and the p35 subunit of interleukin 12 form a novel heterodimeric hematopoietin[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, 94(22):12041-6.

[13]Hou Y M,Dong J,Liu M Y,et al. Expression of Epstein-Barr virus-induced gene 3 in cervical cancer: Association with clinicopathological parameters and prognosis[J].Oncol Lett, 2016, 11(1):330-4.

[14]Schmidt C,Giese T,Ludwig B,et al. Expression of interleukin-12-related cytokine transcripts in inflammatory bowel disease: elevated interleukin-23p19 and interleukin-27p28 in Crohn′s disease but not in ulcerative colitis[J].Inflamm Bowel Dis, 2005, 11(1):16-23.

Expression and localization of human protein EBI3 and its mutants

Xing Xuemei, Geng Huiwu, Pan Linxin, et al

(DeptofBiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)

ObjectiveToanalyzeexpressionandthereasonofdifferentlocalizationamongwild-typeEBI3(epstein-barrvirus-inducedgene3)anditsmutantsinmammaliancelllines.MethodsBasedontheanalysisofaminoacidsequencefromNCBIdatabase,thehumanEBI3eukaryoticexpressionplasmidspcDNA3.1-EBI3-FLAGwasconstructed,itsmutantspcDNA3.1-EBI3(1-135)-FLAGandpcDNA3.1-EBI3(125-230)-FLAGwhichcontainedsingleFN3domaininaminoterminalorcarboxyterminalandEBI3Asp210pointmutantpcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAGwerealsoconstructed;WesternblotanalysiswasappliedtodetecttheexpressionoftherecombinanteukaryoticexpressionplasmidsinmammalianHEK293TcellsandimmunofluorescencetechniquewasusedtodetectthecellularlocalizationinCOS7celllines.ResultsTherecombinanteukaryoticexpressionplasmidswithdownstreamedFLAG-tagofhumanwild-typeEBI3anditsmutantsweresuccessfullyconstructed;WesternblotshowedthattherecombinantproteinscouldstablyexpressinHEK293Tcells;confocalfluorescencemicroscopyresultsindicatedthesignificantchangesinlocalizationofthemutantsofEBI3.ConclusionTheeukaryoticexpressionplasmidsofhumanwild-typeEBI3anditsmutantscansuccessfullyexpressinHEK293TandCOS7cells.ThelocalizationofitsdeletionmutantsinCOS7cellschangesignificantly,indicatingdomainstructureinaminoterminalmayplayanimportantroleinEBI3proteincorrectlocation;theAsp210ofEBI3alsoaffectsthelocalizationofEBI3withinthecell.

EBI3;plasmidconstruction;Westernblot;immunofluorescence

國家自然科學(xué)基金青年基金(編號: 81201368)

安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1生物學(xué)系、2生物科學(xué)，合肥 230032

邢雪梅，女，碩士研究生； 劉曉穎，女，副教授，責(zé)任作者，E-mail:liuxiaoying@ahmu.edu.cn； 范禮斌，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:lfan@ahmu.edu.cn

時(shí)間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.005.html

Q 28；R 392.6

A

1000-1492(2016)11-1573-06

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.005

2016-07-07接收