良種肉羊體外胚胎高效生產(chǎn)技術(shù)的研究

佟桂芝,宋 斌,李信濤,董正德,王偉霞,海 龍,郭立宏,王嘉厚

(1. 黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，吉林 長春 130000)

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良種肉羊體外胚胎高效生產(chǎn)技術(shù)的研究

佟桂芝1,宋 斌1,李信濤2,董正德1,王偉霞2,海 龍1,郭立宏1,王嘉厚1

(1. 黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，吉林 長春 130000)

本研究旨在比較小尾寒羊6周齡、13周齡羔羊、成母羊激素處理后卵巢卵泡發(fā)育及體外胚胎發(fā)育的影響。通過促卵泡激素(FSH)和孕馬血清促性腺激素(PMSG)處理，比較卵巢上2～8 mm卵泡的數(shù)量及體外胚胎的發(fā)育情況。結(jié)果表明：6周齡羔羊卵巢發(fā)育的卵泡數(shù)和采集到的卵母細(xì)胞數(shù)(58.3±1.7、41.6±3.2)都高于13周齡羔羊及成母羊的卵泡數(shù)和卵母細(xì)胞數(shù)(16.7±2.6、10.5±2.1；19.6±4.5、11.8±1.6)，且差異顯著(P<0.05)。6周齡、13周齡羔羊卵母細(xì)胞受精后的卵裂率(64.1%±1.5%、63.8%±3.4%)及囊胚率(31.2%±1.9%、30.4%±3.7%)略低于成母羊組(67.4%±3.7%、34.4%±1.2%)，但沒有顯著差異(P>0.05)。

寒羊；羔羊；激素處理；月齡；卵泡發(fā)育；成母羊；取卵方式；體外胚胎

通過外源激素誘導(dǎo)，從羔羊獲得大量卵母細(xì)胞，受精后進(jìn)行胚胎移植，能顯著提高良種母羊的繁殖潛力、縮短世代間隔，加速遺傳改良進(jìn)程。本研究旨在比較小尾寒羊6周齡、13周齡羔羊、成母羊激素處理后卵巢卵泡發(fā)育及對體外胚胎發(fā)育的影響。通過促卵泡激素和孕馬血清促性腺激素處理，比較卵巢上2～8 mm卵泡的數(shù)量及體外胚胎的發(fā)育情況。

1 材料與方法

1.1 母羊選擇

分別于2016年4、5、6月份，選擇體況良好、年齡分別為成母羊、6周齡、13周齡羔羊各9只，共有27只，品種為小尾寒羊。

1.2 母羊激素處理方案

成母羊組及羔羊組(6周齡組、13周齡組)，分別在第一、二、三天的早6：00、晚18：00時肌肉注射2.5mL、1.5mL、1.0mL FSH(20IU/mL)，并在最后一次注射FSH同時每只羔羊加注0.4 mL PMSG(500 IU/mL)。

1.3 卵母細(xì)胞的采集

母羊在注射FSH 48h后空腹、術(shù)部剪毛，在母羊腹下切一個切口，引出卵巢，用吸有約2 mL抽卵液 TCM199(5%發(fā)情羊血清、100IU/mL肝素、100g/mL鏈霉素、100IU/mL青霉素)的10mL注射器(接12號針頭)吸一個卵巢表面2～8mm的卵泡。在實體顯微鏡下檢出A、B級卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，記錄所采集的COCs數(shù)，分別比較成母羊、6周齡、13周齡羔羊卵巢上發(fā)育的卵泡數(shù)及采集的卵母細(xì)胞數(shù)。

1.4 卵母細(xì)胞的體外成熟

將采集到的卵母細(xì)胞在38.5℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱進(jìn)行24 h的成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)方式為微滴培養(yǎng)法，滴上覆蓋石蠟油。在直徑為35 mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿作6～8個滴(100μL/滴)，在培養(yǎng)箱預(yù)平衡2 h。成熟培養(yǎng)液為TCM-199(10%胎牛血清、10 μg/mL促卵泡激素、1 μg/mL促黃體激素、1 μg/mL雌二醇)。

1.5 卵母細(xì)胞的體外受精

卵母細(xì)胞體外成熟24h后，挑選顆粒細(xì)胞擴(kuò)散效果較好的進(jìn)行受精。受精液為合成輸卵管液(synthetic oviduct fluid，SOF)并添加20%發(fā)情羊血清、10μg/mL肝素、3%牛脫脂血清白蛋白(BSA)。羊冷凍精液在37℃水浴中解凍15s，然后將解凍后的精液緩慢加入5mL精子洗滌液SOF(10%發(fā)情羊血清、10μg/mL肝素)混勻后進(jìn)行離心(1500r/min，5min)，離心沉淀后的精子團(tuán)再用5mL HSOF離心洗滌(1000r/min，5min)1次。去上清液后，用受精液將精子密度稀釋至5×106個/mL用于體外受精。體外成熟的卵母細(xì)胞在受精液中洗1～2次，每20個卵母細(xì)胞移入50μL受精液滴中。

1.6 早期胚胎的體外培養(yǎng)

精子與卵子受精培養(yǎng)24 h后在SOF液中洗滌2次后，移入預(yù)先在培養(yǎng)箱內(nèi)平衡2 h培養(yǎng)滴內(nèi)。將20～25枚受精卵分別移入100μL的發(fā)育培養(yǎng)液SOF(2%的必需氨基酸、1%的非必需氨基酸、2 mmol/L的谷氨酰胺、3 mg/mL BSA、10 ng/mL 上皮生長因子)中，在38.5℃ 、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7～8天。48 h統(tǒng)計卵裂率，每隔48 h半量更換培養(yǎng)液。第8天，統(tǒng)計囊胚率。統(tǒng)計分析采用SPSS統(tǒng)計軟件@Independent-samples t檢驗和One-way ANOVA進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 成母羊、6周齡、13周齡羔羊卵泡數(shù)和卵母細(xì)胞數(shù)比較

由表1可知，6周齡羔羊卵巢發(fā)育的卵泡數(shù)和采集到的卵母細(xì)胞數(shù)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于13周齡羔羊及成母羊的卵泡數(shù)和卵母細(xì)胞數(shù)，且差異顯著(P<0.05)。摘取卵巢組卵母細(xì)胞獲得率(80%)顯著高于活體采卵組(65%)。

表1 各試驗組母羊在外源激素誘導(dǎo)后發(fā)育的卵泡數(shù)和卵母細(xì)胞數(shù)

注：同列內(nèi)不同上標(biāo)字母間差異顯著(P<0.05)，同列內(nèi)有相同上標(biāo)字母間差異不顯著(P>0.05)

2.2 羔羊個體差異對激素誘導(dǎo)效果的影響

在本試驗中，通過激素誘導(dǎo)羔羊卵泡發(fā)育，羔羊之間差異較大。在獲卵總數(shù)方面，獲卵數(shù)量小于25枚的有4只，大于45枚的有8只，5只獲卵數(shù)量在25～45枚之間，1只羔羊沒有反應(yīng)(見表2)。

表2 羔羊個體差異對激素誘導(dǎo)效果的影響

注：同列內(nèi)不同上標(biāo)字母間差異顯著(P<0.05)，同列內(nèi)有相同上標(biāo)字母間差異不顯著(P>0.05)

2.3 成母羊、6周齡、13周齡羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力及不同取卵方式對體外胚胎發(fā)育能力的比較

由表3可見，6周齡、13周齡羔羊卵母細(xì)胞受精后的卵裂率及囊胚率與成母羊組沒有顯著差異(P>0.05)。其中成母羊組卵裂率及囊胚率略好于羔羊組。不同的取卵方式對體外胚胎的發(fā)育能力影響差異不顯著。

表3 各試驗組母羊年齡及不同取卵方式對體外胚胎發(fā)育能力的影響

注：同列內(nèi)不同上標(biāo)字母間差異顯著(P<0.05)，同列內(nèi)有相同上標(biāo)字母間差異不顯著(P>0.05)

3 討論

3.1 母羊年齡對卵泡數(shù)及卵母細(xì)胞數(shù)的影響

不同月齡的母羊經(jīng)外源激素處理后卵巢上發(fā)育的卵泡數(shù)及卵母細(xì)胞數(shù)差異很大。6周齡羔羊卵巢上發(fā)育的卵泡數(shù)及卵母細(xì)胞數(shù)最多，顯著地多于13周齡羔羊及成母羊(P<0.05)。于勇等[1]試驗證明：1月齡、3月齡羔羊超排處理效果上的差異與血液中FSH水平有關(guān)，較高的FSH水平會促進(jìn)卵巢上卵泡發(fā)育。本研究結(jié)果也證明了這一結(jié)論。

3.2 個體差異對激素誘導(dǎo)效果的影響

在本試驗中，通過激素誘導(dǎo)母羊卵泡發(fā)育，羔羊之間差異較大。在獲卵總數(shù)方面，獲卵數(shù)量小于25枚的有4只，大于45枚的有7只，3只獲卵數(shù)量在25～45枚之間，1只羔羊沒有反應(yīng)。可見，激素誘導(dǎo)羔羊卵泡發(fā)育存在較大的個體差異。這個結(jié)果與成年母羊的激素誘導(dǎo)效果相似。

3.3 母羊年齡及不同取卵方式對卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的影響

本試驗表明，6周齡、13周齡的羔羊所獲卵母細(xì)胞在體外成熟、體外受精后的桑葚胚和囊胚率接近于成母羊(P>0.05)。趙宏遠(yuǎn)[2]試驗證明，30～50日齡組與51～70日齡組所獲得卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力差異不大。Morton[3]試驗證明，6～7周齡羔羊比3～4周齡羊卵母細(xì)胞體外受精后囊胚率高(21.4%VS17.4%)。陳曉勇等[4]報道，羔羊卵母細(xì)胞與成年羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力是否有差異尚存在爭議。Jorio等[5]研究表明，隨著年齡增長卵母細(xì)胞在體外的發(fā)育能力增強(qiáng)，成年羊的卵母細(xì)胞發(fā)育能力強(qiáng)于羔羊，本試驗結(jié)果證明羔羊卵母細(xì)胞的發(fā)育能力略次于成年母羊的。造成此現(xiàn)象的原因除了年齡因素外，也與體外培養(yǎng)體系、個體體況差異等因素有關(guān)，但其內(nèi)在的機(jī)理還不是很清楚，需要擴(kuò)大群體數(shù)量進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗通過對成母羊及6周齡、13周齡羔羊進(jìn)行FSH+PMSG外源激素處理，發(fā)現(xiàn)6周齡羔羊在激素誘導(dǎo)后卵巢上卵泡數(shù)顯著高于成母羊及13周齡羔羊，獲得的卵母細(xì)胞數(shù)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成母羊及13周齡羔羊；獲得的卵母細(xì)胞經(jīng)過體外成熟、體外受精、早期胚胎體外培養(yǎng)試驗后，6周齡羔羊卵母細(xì)胞體外成熟、受精后發(fā)育的囊胚率與成母羊及13周齡羔羊結(jié)果相近。羊是多胎動物，一個卵巢上可以同時排多個成熟卵子，為了提高卵母細(xì)胞獲得率，摘除一個卵巢并不會影響母羊以后的繁殖性能。

[1] 于勇，鐘旭，王芬露，等.不同月齡綿羔羊卵泡發(fā)育的比較研究[J].中國畜牧雜志，2012，48(9).

[2] 趙宏遠(yuǎn)．影響山羊幼羔卵泡發(fā)育與體外受精效果主要因素研究[D]．保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009．

[3] Morton K M，Catt S L，Maxwell W M，et al．Effects of lamb age，horm one stimulation and response to hormone stimulation on the yield and in vitro developmental competence of prepubertal lamb ooeytes[J]．Reprod Fertil Dev，2005，17：593-601．

[4] 陳曉勇，敦偉濤，田樹軍，等．幼羔超早期繁殖技術(shù)研究[J]．中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26(2)：21-25．

[5] Jorio A，Mariana J C，Lahlou-Kassic A，et al．Patten of FSH secretion from birth to 4 months of age in two Moroccan ewe breeds varying in prolificacy[J] ．Small Rumin Res ，1999，33(2)：135-140．

2015-08-23

佟桂芝(1967-)，女，研究生，研究方向：反芻動物飼養(yǎng)與繁殖。Email：178269821@qq.com

黑龍江省財政廳項目(2016-10)和齊齊哈爾市農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(NYGG-201425)

10.19369/j.cnki.2095-9737.2016.10.002

S826.3+5

A

2095-9737(2016)10-0004-02