L-蘋(píng)果酸及蘋(píng)果對(duì)睡眠剝奪小鼠記憶的影響

盧超銀，沈雨莎，張燁，倪燁欽，印媛君

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院，浙江杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053

L-蘋(píng)果酸及蘋(píng)果對(duì)睡眠剝奪小鼠記憶的影響

盧超銀1，沈雨莎1，張燁1，倪燁欽1，印媛君2

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院，浙江杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053

目的探討不同濃度L-蘋(píng)果酸以及蘋(píng)果對(duì)睡眠剝奪小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。方法15只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（ICR+生理鹽水組）和實(shí)驗(yàn)組（ICR+高、中、低濃度L-蘋(píng)果酸組，ICR+蘋(píng)果組）。用Morris水迷宮測(cè)出睡眠剝奪前后小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶。結(jié)果ICR+高濃度L-蘋(píng)果酸組學(xué)習(xí)記憶并沒(méi)有明顯改善；ICR+中、低濃度L-蘋(píng)果酸組學(xué)習(xí)記憶明顯改善；ICR+蘋(píng)果汁組學(xué)習(xí)記憶得到明顯改善，且效果優(yōu)于ICR+中、低濃度L-蘋(píng)果酸組。結(jié)論適當(dāng)濃度的L-蘋(píng)果酸和蘋(píng)果都能夠起到改善學(xué)習(xí)記憶的作用，但是蘋(píng)果改善學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制是否僅同L-蘋(píng)果酸相關(guān)還需要進(jìn)一步的研究。

睡眠剝奪；L-蘋(píng)果酸；蘋(píng)果；學(xué)習(xí)記憶

睡眠是維持人類(lèi)許多生理功能穩(wěn)態(tài)所必需的，睡眠對(duì)記憶的形成、存儲(chǔ)等都具有重要的作用[1-3]。睡眠剝奪是指人因環(huán)境的需要喪失了所需睡眠量的狀態(tài)[4]。隨著現(xiàn)代社會(huì)的高速發(fā)展，生活節(jié)奏的日益加快，人們持續(xù)性工作的狀態(tài)愈來(lái)愈普遍，繼而導(dǎo)致了剝奪的睡眠量增加。睡眠剝奪或者睡眠抑制可引起學(xué)習(xí)記憶的損害，這一點(diǎn)已有廣泛的研究證實(shí)[3,5-8]。鄧龍祥等人的研究中[10]指出蘋(píng)果中的L-蘋(píng)果酸能改善睡眠剝奪的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。但是不同濃度的蘋(píng)果酸對(duì)小鼠睡眠剝奪后空間學(xué)習(xí)記憶具體影響的不同并未有進(jìn)一步的研究。且成熟的蘋(píng)果中含有一定量的L-蘋(píng)果酸，蘋(píng)果對(duì)小鼠是否也同樣能夠起到改善睡眠剝奪后學(xué)習(xí)記憶的作用也未見(jiàn)研究。該實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究L-蘋(píng)果酸以及蘋(píng)果對(duì)睡眠剝奪后大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，以對(duì)上述內(nèi)容做進(jìn)一步的探究。

1　資料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

選用健康成年ICR小鼠17只，體重(20±2)g(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。經(jīng)Morris水迷宮訓(xùn)練之后，篩選出成績(jī)相近的小鼠15只，隨機(jī)分為5組，每組3只。對(duì)照組：ICR+生理鹽水組；實(shí)驗(yàn)組：ICR+高濃度（0.7 mg/mL）L-蘋(píng)果酸組，ICR+中濃度（0.35 mg/mL）L-蘋(píng)果酸組，ICR+低濃度（0.175 mg/mL）L-蘋(píng)果酸組，ICR +蘋(píng)果汁組（蘋(píng)果汁為直接榨取蘋(píng)果而來(lái)，未添加其他物品）。

1.2藥品與儀器

Morris水迷宮(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，L-蘋(píng)果酸(藥品源自常茂生物化學(xué)工程有限公司，純度為99.86%)，灌胃針等。

1.3睡眠剝奪模型的建立

實(shí)驗(yàn)人員于Morris水迷宮訓(xùn)練后一天的8:00至次日8:00這段時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)小鼠的活動(dòng)情況，阻止小鼠入睡，以達(dá)到對(duì)小鼠進(jìn)行睡眠剝奪的目的。

1.4給藥

從睡眠剝奪期間開(kāi)始給藥，睡眠剝奪期間于下午17：00對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)按0.4mL的劑量灌胃。睡眠剝奪之后，依然按分組于每天下午17：00進(jìn)行灌胃，劑量同睡眠剝奪期間一樣，1次/d，連續(xù)進(jìn)行5 d。

1.5學(xué)習(xí)記憶的測(cè)試

用Morris水迷宮法進(jìn)行小鼠學(xué)習(xí)記憶的測(cè)試。睡眠剝奪前對(duì)小鼠進(jìn)行水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練。訓(xùn)練時(shí)，將小鼠面向池壁從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池，采集控制儀自動(dòng)記錄小鼠的路線(xiàn)。小鼠找到平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上站立10 s，然后進(jìn)行下一次的訓(xùn)練。每只小鼠從四個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池為一輪訓(xùn)練，訓(xùn)練4輪，共訓(xùn)練16次。訓(xùn)練成功的標(biāo)志是小鼠已經(jīng)形成一定的尋找平臺(tái)的路線(xiàn)。淘汰訓(xùn)練未成功的小鼠，本實(shí)驗(yàn)15只小鼠訓(xùn)練成功，淘汰2只。對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)5 d灌胃后進(jìn)行水迷宮測(cè)量一次。測(cè)量時(shí)，將小鼠面向池壁從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入，反應(yīng)時(shí)(s)取平均數(shù)，作為測(cè)試成績(jī)，若小鼠60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則以60 s計(jì)。

1.6統(tǒng)計(jì)方法

2　結(jié)果

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠在水迷宮中的反應(yīng)時(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如表1。

3　討論

已有研究表明，睡眠對(duì)記憶的形成、儲(chǔ)存等都有密切關(guān)系[1-3]，而睡眠剝奪會(huì)對(duì)記憶造成一定損害。鑒于睡眠剝奪對(duì)記憶的影響已有大量的實(shí)驗(yàn)證明，所以本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)時(shí)，未設(shè)置正常對(duì)照組，即肯定了睡眠剝奪對(duì)學(xué)習(xí)記憶的不良作用。該實(shí)驗(yàn)中Morris水迷宮法進(jìn)行小鼠學(xué)習(xí)記憶的測(cè)試顯示，睡眠剝奪后，高濃度L-蘋(píng)果酸灌胃組的小鼠在蘋(píng)果酸灌胃后學(xué)習(xí)記憶能力并沒(méi)有得到明顯的改善；中、低濃度L-蘋(píng)果酸灌胃組的小鼠在蘋(píng)果酸灌胃后學(xué)習(xí)記憶能力得到了明顯的改善；蘋(píng)果汁灌胃組的小鼠在蘋(píng)果汁灌胃后學(xué)習(xí)記憶能力得到了明顯的改善，且改善效果優(yōu)于中、低濃度蘋(píng)果酸灌胃組。從總體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，適當(dāng)?shù)奶O(píng)果酸濃度的確能夠起到改善學(xué)習(xí)記憶的作用，同時(shí)蘋(píng)果也的確有一定的改善學(xué)習(xí)記憶的作用。但是蘋(píng)果是否僅通過(guò)L-蘋(píng)果酸來(lái)改善學(xué)習(xí)記憶，即蘋(píng)果中是否還存在其他可以改善學(xué)習(xí)記憶的物質(zhì)還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

睡眠剝奪可打亂人體的生物鐘，干擾腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量及分布，誘導(dǎo)某些異?；虻奶禺愋员磉_(dá)，使腦內(nèi)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)偏離平衡，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。海馬—邊緣系統(tǒng)中有豐富的膽堿能纖維分布，與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切。睡眠剝奪后的SD大鼠學(xué)習(xí)能力明顯下降，海馬乙酰膽堿含量明顯降低[9]。有研究表明L-蘋(píng)果酸對(duì)睡眠剝奪小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力具有明顯的改善作用，可以通過(guò)改善腦組織的能量代謝，調(diào)整腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)幫助學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)[10-11]。但L-蘋(píng)果酸通過(guò)影響海馬乙酰膽堿來(lái)達(dá)到改善學(xué)習(xí)記憶能力作用的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步證實(shí)和研究。

表1　睡眠剝奪前后各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶測(cè)定的結(jié)果[（±s），s]

表1　睡眠剝奪前后各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶測(cè)定的結(jié)果[（±s），s]

項(xiàng)目睡眠剝奪前睡眠剝奪后P值生理鹽水0 . 7 m g / m L L -蘋(píng)果酸組0 . 3 5 m g / m L L -蘋(píng)果酸組0 . 1 7 5 m g / m L L -蘋(píng)果酸組蘋(píng)果汁組5 6 . 9 5 ± 5 . 3 2 5 7 . 1 5 ± 8 . 9 9 0 . 9 7 5 4 9 . 3 8 ± 9 . 9 8 5 2 . 1 8 ± 7 . 1 7 0 . 7 1 4 4 8 . 8 5 ± 6 . 1 6 3 6 . 3 ± 1 6 . 4 2 0 . 2 8 4 5 1 . 7 7 ± 7 . 6 2 4 7 . 1 3 ± 2 3 . 1 7 0 . 7 5 8 5 0 . 1 8 ± 9 . 0 5 3 2 . 8 2 ± 3 . 6 1 0 . 0 3 7

實(shí)驗(yàn)中高濃度的蘋(píng)果酸并沒(méi)有起到明顯的改善學(xué)習(xí)記憶的作用，可能是由于小鼠個(gè)體對(duì)蘋(píng)果酸敏感度的差異，蘋(píng)果酸無(wú)法作用于相應(yīng)靶點(diǎn)來(lái)達(dá)到改善學(xué)習(xí)記憶的作用引起，也可能是由其他原因造成，該實(shí)驗(yàn)并未對(duì)此進(jìn)行深入的研究。實(shí)驗(yàn)中，由于采用的樣本含量較小，存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差，建議對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的完善，擴(kuò)大樣本的含量，來(lái)為該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供更可靠的數(shù)據(jù)支持。L-蘋(píng)果酸及蘋(píng)果對(duì)于睡眠剝奪后學(xué)習(xí)記憶功能的影響對(duì)于夜間作業(yè)人員的保健具有重要意義，提供了一條新的思路。

[1]Yoo SS，Hu PT，Gujar N，et al.A deficit in the ability to form new human memories without sleep[J].Nat Neurosci，2007，10（3）：385-392.

[2]Mueller AD，Pollock MS，Lieblich SE，et al.Sleep deprivation can inhibit adult hippocampal neurogenesis Independent of adrenal stress hormones[J].Am J PhysiolRegulIntegr Comp Physiol，2008，294（5）：R1693-R1703.

[3]劉艷，吳衛(wèi)平.慢性睡眠限制對(duì)幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014,35（6）：620-622.

[4]宋國(guó)萍,張侃,苗丹明.睡眠剝奪后清醒程度和困倦程度變化[J].中國(guó)臨床心理學(xué)雜志，2004,12(3):290-292.

[5]Walsh CM，Booth V，Poe GR.Spatial and reversal learning in the Morris water maze are largely resistant to six hours of REM sleep deprivation following training[J].Learn Mem，2011，18（7）：422-434.

[6]Hagewoud R，Bultsma LJ，Barf RP，et al.Sleep deprivation impairs contextual fear conditioning and attenuates subsequent behavioural，endocrine and neuronal responses[J].J Sleep Res，2011，20（2）259-266.

[7]楊遙，劉靜，徐江濤．睡眠剝奪對(duì)認(rèn)知功能的影響研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（4）：791-794．

[8]趙忠新，張紅菊．重視睡眠剝奪導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙機(jī)制的腦功能成像研究[J].中國(guó)現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2013，13（5）：359-362．

[9]劉彤,徐淑梅.睡眠剝奪對(duì)大鼠學(xué)習(xí)能力和海馬乙酰膽堿含量的影響[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2007(3)：12-13.

[10]鄧龍祥，陳況，葉處陽(yáng).L-蘋(píng)果酸對(duì)睡眠剝奪小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2012(20):12-13.

[11]Morris R．Development of a water maze procedure for studying spacial learning in the rat[J].Neurosci Methods，1984，11: 47.

Effect of L-malic Acids and Apples on the Sleep Deprivation of Memory of Mice

LU Chao-yin1,SHEN Yu-sha1,ZHANG Ye1,NI Ye-qin1,YIN Yuan-jun2
1.Second Clinical College,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou,Zhejiang Province,310053 China；2.College of Basic Medicine,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou,Zhejiang Province,310053 China

Objective To study the effect of different concentrations of l-malic acids and apples on the sleep deprivation of memory of mice.Methods 15 mice were randomly divided into the control group(ICR+normal saline group)and the experiment group(ICR+high,middle and low concentrations of l-malic acid group,ICR+apple group),and the spatial learning and memory of mice before and after the sleep deprivation was tested by the Morris water maze.Results The learning memory of ICR+high concentration of l-malic acid group was not obviously improved,and the learning memory of ICR+middle concentration of l-malic acid group and ICR+low concentration of l-malic acid group was obviously improved,and the learning memory effect of ICR+apple juice group was better than that of middle concentration of l-malic acid group and ICR+low concentration of l-malic acid group.Conclusion The appropriate concentration of l-malic acids and apple can have an effect of improving the learning memory,but whether the improvement mechanism of apples on learning memory is only related to the l-malic acid needs the further study.

Sleep deprivation;L-malic acid;Apple;Learning memory

R96

A

1672-5654（2016）11（b）-0016-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.32.016

2016-08-11）

盧超銀（1995.7-），女，浙江臨海人，本科在讀，研究方向：行為醫(yī)學(xué)。

印媛君（1971.11-），女，浙江浦江人，碩士研究生，副教授，研究方向：心肌缺血，郵箱：hzyyjun@126.com。