運動訓(xùn)練和白藜蘆醇保護NAFLD大鼠肝細胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制研究

阮 凌，李方暉

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運動訓(xùn)練和白藜蘆醇保護NAFLD大鼠肝細胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制研究

阮 凌1，李方暉2

目的：研究運動訓(xùn)練和白藜蘆醇(RVS)干預(yù)對非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠血脂代謝、肝細胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)相關(guān)蛋白表達的影響。方法：將SPF級雄性SD大鼠70只分為普通安靜對照組(NC)、NAFLD模型組(HF)、HF小強度耐力運動組(LE)、HF中等強度耐力運動組(ME)、HF遞增強度耐力運動組(IE)、HF白藜蘆醇組(RVS)、中等強度耐力運動聯(lián)合RVS組(RE)，共7組，每組各10只。運動組每次運動時間60 min，每周運動5天。RVS灌胃按照40mg/kg/天，每周7天。干預(yù)6周后測試血脂指標和分析肝組織HE切片；免疫組化測試Bax、Bcl-2蛋白表達；TUNEL測試肝細胞凋亡情況；采用Western-blot檢測肝組織ERS 相關(guān)因子GRP78、Caspase3、IRE1、p-IRE1、JNK1、CHOP、PERK和eIF2α蛋白表達。結(jié)果：與HF組相比，所有干預(yù)組均降低NAFLD大鼠血清TG、TC、FFA、LDL-c含量和肝細胞的凋亡率和Bax蛋白表達，同時增加了HDL-c含量和Bcl-2表達；與HF組相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE1、PERK蛋白表達和GRP78/Caspase3比值顯著增加，Caspase3、p-IRE1、eIF2α、JNK1和CHOP蛋白表達顯著降低，綜合運動組中各指標發(fā)現(xiàn)，ME組較LE和IE效果好，而RE組則優(yōu)于其他各組。結(jié)論：1)16周高脂飲食可復(fù)制NAFLD大鼠模型，NAFLD大鼠肝細胞凋亡的發(fā)生與ERS同時激活I(lǐng)RE1/JNK1和eIF2α/CHOP兩條信號通路有關(guān)；2)不同強度耐力運動對NAFLD大鼠血脂各項指標和肝細胞凋亡均有不同程度的改善作用，但中等強度耐力運動優(yōu)于其他運動組，這可能依賴于對ERS信號途徑IRE1/JNK1和eIF2α/CHOP雙重調(diào)控；3)RVS對NAFLD大鼠肝細胞凋亡也具有改善作用，但并非依賴于對ERS凋亡途徑的調(diào)控；4)聯(lián)合干預(yù)組對ERS信號通路IRE1/JNK1和eIF2α/CHOP也具有雙重抑制作用，且優(yōu)于中等強度耐力運動組。

運動訓(xùn)練；白藜蘆醇；非酒精性脂肪肝；凋亡； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史，但肝實質(zhì)細胞發(fā)生脂肪性變和脂肪貯積為主要特征的臨床病理綜合癥。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在西方國家有將近30%的成人和10%的兒童患有NAFLD。研究表明，NAFLD與心血管事件的發(fā)生、肝臟及腫瘤相關(guān)的死亡率增加密切相關(guān)[9]。近年來研究證實，肝細胞凋亡在NAFLD發(fā)展進程中扮演重要角色。文獻報道，NAFLD患者膽固醇代謝異常和脂肪酸堆積常會導(dǎo)致肝細胞損傷及凋亡，這與肝臟枯否細胞(Kupffer cells，KCs)和肝衛(wèi)星細胞內(nèi)凋亡信號通路的激活有關(guān)；此外，KCs和肝衛(wèi)星細胞的激活和凋亡同時又進一步加速了肝臟組織損傷、纖維化和慢性炎癥的進程[9]?？傊瑴p少肝臟組織的膽固醇生物合成、保護因脂毒性導(dǎo)致的肝細胞氧化損傷及其凋亡是抑制NAFLD肝臟纖維化與炎癥、防止肝臟癌變的重要途徑。

普遍認為，細胞凋亡的發(fā)生機制有3條途徑，即死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)驅(qū)動的凋亡途徑。研究發(fā)現(xiàn)，適度的ERS在調(diào)控細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)過程中扮演重要角色；但應(yīng)激時間過長或程度過強時，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)無法恢復(fù)，便通過ERS誘導(dǎo)細胞凋亡。因此，調(diào)控ERS及其誘導(dǎo)的肝細胞凋亡已成為治療NAFLD的新思路[2]。白藜蘆醇(resveratrol，RVS)是一種天然的多酚類小分子化合物，廣泛存在于紅葡萄皮、虎杖、花生紅衣和其他堅果中，具有抗氧化、抗衰老、抗凋亡和調(diào)節(jié)糖、脂代謝等多種生理活性。人體實驗表明，補充RSV對NAFLD患者具有積極的療效，包括改善肝臟組織的胰島素敏感性、調(diào)節(jié)肝臟的能量代謝水平和炎癥反應(yīng)[15]。體外細胞模型進一步發(fā)現(xiàn)，RVS能抑制花生四烯酸誘導(dǎo)的肝細胞凋亡[36]。動物試驗也報道，RVS能通過抑制ERS來保護乙醇誘導(dǎo)的肝細胞凋亡[27]。然而，RVS能否通過調(diào)控ERS及其誘導(dǎo)的肝細胞凋亡來治療NAFLD？

體育運動被認為是防治NAFLD最有效手段之一[25]。研究發(fā)現(xiàn)，運動訓(xùn)練能明顯改善NAFLD大鼠肝臟病理學(xué)結(jié)構(gòu)，并抑制肝細胞凋亡的發(fā)生[2,3]。然而，不同強度的耐力運動對NAFLD療效是否存在差異？近年來，人們更熱衷于將體育運動與RVS聯(lián)合來探討二者聯(lián)用對衰老相關(guān)疾病的防治[29-30,39]，但目前二者聯(lián)合干預(yù)是否對改善NAFLD脂質(zhì)代謝、肝細胞凋亡具有協(xié)同或疊加效應(yīng)仍不清楚？基于此，本研究通過觀察不同強度運動訓(xùn)練和運動聯(lián)合RVS干預(yù)對NAFLD大鼠脂代謝和肝細胞凋亡的影響，并從ERS角度揭示其對改善NAFLD的潛在機制，為臨床上NAFLD的運動防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

將購于廣州醫(yī)學(xué)院動物中心的70只SD(sprague-dawley)雄性大鼠隨機分為普通安靜對照組(normal control，NC)和高脂飼料喂養(yǎng)組(high fat，HF)；再將HF組分為小強度耐力運動組(low intensity-endurance exercise，LE)、中等強度運動組(middle intensity-endurance exercise，ME)和遞增強度運動組(incremental intensity-endurance exercise，IE)、RSV組和中等強度運動聯(lián)合RVS組(RSV with middle intensity-endurance exercise，RE)，共計7組，每組10只。

1.2 非酒精性脂肪肝大鼠模型的構(gòu)建

采用高脂飼料(在基礎(chǔ)飼料基礎(chǔ)上添加5%蔗糖、18%豬油、15%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉和1%膽固醇)喂養(yǎng)大鼠。喂養(yǎng)16周后，處死大鼠取肝組織制作HE切片，測試各項生理生化指標，并參考NAFLD病理診斷標準對本模型進行評估TG、TC、LDL-c、FFA及肝功能酶；同時制作肝組織病理HE切片，并送兩位職業(yè)病理醫(yī)師通過盲法診斷是否符合臨床NAFLD患者診斷標準，建立NAFLD大鼠模型[16]。

1.3 運動方案

運動負荷的設(shè)定是根據(jù)大鼠的健康情況，參考Bedford TG經(jīng)典跑臺實驗?zāi)Ｐ蛠碓O(shè)計。所有運動組大鼠在適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練1周后進行相應(yīng)強度運動，LE組：速度15 m/min，60 min/次/天；ME組：速度20 m/min，60 min/次/天；IE組：速度15 m/min(10 min)、速度20 m/min(30 min)，速度27 m/min(20 min)。所有運動組均5天/周，共6周。

1.4 給藥方案

根據(jù)藥理學(xué)給藥原則，每天早上8:00給藥，7天/周，共計6周。具體方法為：將RSV充分溶于雙蒸水中，對RVS和RE這兩組大鼠稱重，并按照每只大鼠40.0 mg/kg/bw/天的劑量進行灌胃[1,18]。HF組大鼠給予同體積的雙蒸水灌胃。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 血液指標測試

通過全自動生化分析儀檢測血液中的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-c)和游離脂肪酸(FFA)含量。

1.5.2 肝組織病理學(xué)切片

取部分肝臟用生理鹽水漂洗數(shù)次后，將肝組織置于10%中性甲醛溶液固定24～48 h，用于制備肝組織病理學(xué)切片。鑒于脂肪肝的病理切片在脫蠟過程中肝細胞中的脂肪沉積會被洗脫，故在光鏡下呈空泡狀，可用于鑒定NAFLD病理形態(tài)學(xué)特性。

1.5.3 肝臟組織免疫組織化學(xué)

將大鼠肝臟石蠟切片，按SASC法進行TUNEL和Bcl-2、Bax免疫組織化學(xué)染色，嚴格按照試劑盒說明進行規(guī)范操作。采用JVC3-CCD攝像頭和Image-Pro Plus圖像處理軟件進行圖像采集與分析。每只大鼠肝組織連續(xù)切片，每隔5張選取一張，共取8張切片，每張片隨機選取6個視野，在400倍光鏡下對7組大鼠肝臟內(nèi)的凋亡細胞、Bcl-2和Bax的陽性表達計數(shù)。免疫組化定量分析結(jié)果以單個視野下陽性細胞光密度值表示。

1.5.4 蛋白免疫印記檢測蛋白表達

每100 mg肝組織中加入1 mL的RIPA和10 μL 100 mM 的PMSF和10 μL的磷酸酶抑制劑。勻漿機勻漿后將含樣品高速離心，將上清小心轉(zhuǎn)移到干凈無菌離心管中，置于-20℃冰箱保存。取肝組織裂解液，并加電泳上樣緩沖液，電泳(5%濃縮膠90 V，12%分離膠110 V，不恒定電流)，約1.5 h，取分離膠進行轉(zhuǎn)膜(90 V，90 min)，然后打開電轉(zhuǎn)儀，取出硝酸纖維膜(NC)，去離子水洗滌，洗液平衡后用5%脫脂奶粉(TBS稀釋)室溫封閉30 min，再4℃過夜，加已稀釋好的鼠抗兔抗GRP78、Caspase3、IRE1、p-IRE1、JNK1、CHOP、PERK、eIF2α(美國Santa Cruz公司)，4 ℃過夜，PBS洗膜，再加5 mL的1∶5 000稀釋(稀釋液含2%脫脂奶粉)羊抗兔二抗(北京博奧森)，37 ℃反應(yīng)1 h，把NC上PBS吸干，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，完全浸透后，放于膠片上，蓋上保鮮膜，放入X射線暗盒，應(yīng)用Quantity One凝膠電泳圖像軟件系統(tǒng)分析，以膠片中(蛋白條帶中的灰度值/內(nèi)參β-action灰度值)的比值大小表示。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 實驗結(jié)果

2.1 各組大鼠血脂變化

表1結(jié)果顯示，與HF組相比，其他各組TG非常顯著性降低(P<0.01)；與LE組相比，ME組和IE組TG顯著性降低(P<0.05)，與ME組相比，RE組TG顯著性降低(P<0.05)，與RSV組相比，IE組和RE組大鼠TG非常顯著性降低(P<0.01)；與HF組相比，NC組和RE組TC非常顯著性降低(P<0.01)，其他組均顯著性降低(P<0.05)；與HF組相比，NC組和RE組的LDL-c非常顯著性降低(P<0.01)，LE組、ME組、IE組和RSV組大鼠LDL-c顯著性降低(P<0.05)，與LE組相比，IE組LDL-c顯著性降低(P<0.05)，與ME組相比，RE組LDL-c降低且有非常顯著性差異(P<0.01)，與RSV組相比，RE組LDL-c非常顯著性降低(P<0.01)；與HF組相比，其他各組FFA均非常顯著性降低(P<0.01)，與LE組相比，ME組FFA顯著性降低(P<0.05)，而RE組FFA也非常顯著性降低(P<0.01)；與ME組相比，RSV組FFA顯著性升高(P<0.05)，RE組FFA非常顯著性降低(P<0.01)；但與RSV組相比，RE組FFA則非常顯著性降低(P<0.01)。

2.2 各組大鼠HE染色肝組織病理學(xué)切片

圖1B顯示，HF組大鼠的肝小葉和肝索消失，肝細胞內(nèi)可見脂肪小空泡，且散布胞漿中，脂肪融合大空泡的出現(xiàn)將細胞核擠壓到細胞膜邊緣，并融合成大小不一的脂囊。同時，伴有小葉內(nèi)混合性炎癥細胞的浸潤。LE組大鼠肝小葉內(nèi)可見彌漫性脂肪泡分布，脂肪大泡參雜其間，但脂肪變性程度明顯下降，且肝小葉內(nèi)炎癥病灶減輕(圖1C)；ME(圖1D)和IE(圖1E)組大鼠的肝組織尚可見彌散性脂肪小泡，單脂肪大泡明顯減少，且炎性病灶明顯減輕。RSV組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)尚可見，肝細胞呈放射排列，形成肝細胞索，但肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞較NC組體積增加，胞漿疏松呈網(wǎng)狀，肝細胞內(nèi)、細胞核周圍脂肪空泡較HF組體積減小，脂肪變性程度減輕(圖1F)。值得指出的是，RE組大鼠肝小葉清晰，肝索可見，脂肪空泡數(shù)目明顯減少(圖1G)。

表1 各組大鼠血脂各項指標的變化

圖1 本研究各組大鼠肝組織HE染色切片鏡下示意圖(400×)(A～G)

2.3 各組大鼠肝細胞凋亡變化

圖2運用TUNEL法對肝細胞進行原位末端標記，觀察肝細胞的凋亡情況。圖2結(jié)果顯示，NC組大鼠肝細胞凋亡細胞數(shù)目極少，細胞排列整齊(圖2A)；HF組大鼠肝細胞呈現(xiàn)深褐色陽性染色，并在肝小葉內(nèi)多為散在分布，凋亡的細胞呈圓形或橢圓形(圖2B)；經(jīng)6周不同強度運動和RVS單獨或聯(lián)合干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，各運動組大鼠肝細胞整體排列，陽性細胞著色較HF組顏色相對較淺，LE(圖2C)和IE(圖2E)組的陽性細胞顯著性降低(P<0.05)；而ME組陽性細胞數(shù)目呈現(xiàn)極顯著性降低(P<0.01)(圖2D)；RE組(圖2G)大鼠的肝細胞核染色多呈藍色，陽性細胞數(shù)量減少且著色較淺，陽性細胞的表達率不僅極顯著性低于HF組(P<0.01，圖2B)，甚至低于ME組(P<0.05，圖2D)。2.4 各組大鼠肝細胞Bax和Bcl-2表達變化

Bcl-2和Bax蛋白主要在肝細胞胞漿內(nèi)表達，陽性表達呈現(xiàn)棕黃色顆粒，陰性表達無著色。圖3結(jié)果顯示，NC組(圖3a)Bax陽性表達最弱，其他各組Bax陽性表達升高；與HF組(圖3b)相比，ME組(P<0.01，圖3d)、RE組(P<0.01，圖3g)和LE組(P<0.05，圖3c)Bax陽性表達降低；其中，IE(圖3e)組Bax表達顯著高于ME組(圖3d，P<0.05)，盡管RSV組(圖3f)Bax表達高于ME(圖3d)組，但無顯著性差異(P>0.05)；此外，RE組(圖3g)Bax陽性表達則顯著低于ME組(P<0.05，圖3d)。

從圖3A中看出，NC組大鼠肝細胞胞漿內(nèi)的Bcl-2表達量最高，HF組(圖3B)顯著性低于NC組(P<0.01，圖3A)；與HF組(圖3B)相比，各運動組(圖3C-G)中Bcl-2陽性表達均呈現(xiàn)不同程度的增加，盡管LE組(圖3C)和RSV組(圖3F)的Bcl-2表達顯著性增加(P<0.05)，但ME組(圖3D)呈現(xiàn)極為顯著性的差異(P<0.01)，RE組(圖3G)也出現(xiàn)極為顯著性的差異(P<0.01)；另外，較之ME組(圖3D)，IE組(圖3E)Bcl-2表達顯著性地減少(P<0.05)，RE組(圖3G)Bcl-2表達則顯著性地增加(P<0.05)。

圖2 TUNEL檢測各組大鼠肝細胞凋亡率示意圖

圖3 各組大鼠肝組織內(nèi)Bax(a-g)和Bcl-2(A-G)蛋白表達示意圖

2.5 大鼠肝臟GRP78、Caspase3蛋白表達及GRP78/Caspase3比值變化

圖4A～C結(jié)果顯示，與HF組相比，NC組大鼠肝細胞GRP78和Caspase3的蛋白表達均顯著性降低(P<0.01)；圖4B顯示，與HF組相比，LE組(P<0.01)、ME組(P<0.01)、IE組(P<0.05)、RE組(P<0.01)Caspase3蛋白表達顯著降低；此外，IE組Caspase3蛋白表達顯著高于ME組(P<0.05)，而RE組顯著性低于ME組(P<0.05)；LE組、ME組和RE組均顯著低于RSV組(P<0.05)。

圖4C結(jié)果顯示，與HF組相比，ME組和RE組GRP78/Caspase3比值顯著性增加(P<0.01)；與ME組相比，RE組GRP78/Caspase3比值顯著性增加(P<0.01)，與RSV組相比(P<0.01)，ME組和RE組GRP78/Caspase3比值均顯著增加。

2.6 大鼠肝臟CHOP和JNK1蛋白表達的變化

圖5A顯示，與HF組相比，NC組(P<0.01)、LE組(P<0.05)、ME組(P<0.05)和RE組(P<0.01)CHOP蛋白表達均顯著性降低；與ME組相比，RE組大鼠肝組織CHOP蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與RSV組相比，RE組肝臟CHOP蛋白表達顯著降低(P<0.05)。

圖5B顯示，與HF組相比(P<0.05)，NC組(P<0.01)、LE組(P<0.05)、ME組(P<0.05)和RE組(P<0.05)JNK1蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與ME組相比，RE組大鼠肝臟的JNK1蛋白表達顯著降低(P<0.05)，與RSV組相比，RE組大鼠肝臟JNK1蛋白表達顯著降低(P<0.05)。

圖4 各組大鼠肝組織GRP78(A)和Caspase3(B)蛋白表達及GRP78/Caspase3比值(C)變化示意圖

圖5 各組大鼠肝組織CHOP(A)和JNK1(B)蛋白表達示意圖

2.7 各組大鼠肝臟IRE1、p-IRE1、PERK和eIF2α蛋白表達的變化

圖6結(jié)果顯示，與HF組相比(P<0.01)，NC組大鼠肝組織IRE1(圖6A)、p-IRE1(圖6B)、PERK(圖6C)和eIF2α(圖6D)蛋白表達顯著降低，ME組和RE組p-IRE1(圖6B)、PERK(圖6C)和eIF2α(圖6D)蛋白表達均顯著性(P<0.05)降低；ME組IRE1(圖6A)則顯著性增加；與ME組相比(P<0.05)，RSV組大鼠肝臟組織IRE1(圖6A)和PERK(圖6A)蛋白表達顯著降低，RE組eIF2α(圖6D)蛋白表達顯著減少(P<0.01)，RE組PERK(圖6C)和IRE1(圖6A)蛋白表達顯著增加(P<0.05)；圖6B顯示，IE組和RSV組大鼠肝臟p-IRE1蛋白表達顯著高于ME組(P<0.05)；與RSV組相比，RE組PERK蛋白表達顯著性升高(P<0.05，圖6C)，RE組eIF2α蛋白表達則顯著性下降(圖6D，P<0.01)。

圖6 各組大鼠肝組織IRE1(A)、p-IRE1(B)、PERK(C)和eIF2α(D)蛋白表達示意圖

3 討論

3.1 NAFLD肝細胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

盡管對NAFLD的發(fā)病機制仍不清楚，但業(yè)界普遍認為“二次打擊”(two-hit)學(xué)說在NAFLD發(fā)病過程中扮演重要角色[37]?！岸未驌簟睂W(xué)說認為，第1次打擊源于肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝異常導(dǎo)致體內(nèi)大量的脂質(zhì)沉積；第2次打擊表現(xiàn)為脂質(zhì)沉積導(dǎo)致的脂毒性誘發(fā)肝細胞氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、線粒體能量代謝紊亂，引發(fā)肝細胞凋亡[13]。本研究表1表明，16周高脂飼料喂養(yǎng)可誘導(dǎo)大鼠機體脂肪代謝明顯異常，表現(xiàn)為血液TG、TC、LDL-c和FFA等指標的顯著高于對照組；HE肝組織學(xué)病理切片顯示，肝臟的脂質(zhì)大量沉積、肝小葉和肝索消失，肝細胞內(nèi)、核周可見脂肪小空泡，散布在胞漿中，脂肪融合大空泡的出現(xiàn)，將細胞核擠壓到細胞膜邊緣，類似脂肪細胞，并融合成大小不一的脂囊。伴有小葉內(nèi)混合性炎癥細胞浸潤(圖1B)。趙軍等[6]研究表明，16周高脂飲食誘導(dǎo)大鼠肝功能酶和血脂含量異常，肝臟呈現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷、脂肪肝炎和纖維化等特征。李軍漢等[2]實驗發(fā)現(xiàn)，8周高脂飲食能造成大鼠肝細胞脂肪變性明顯，肝細胞排列紊亂，可見大量肝細胞空泡、氣球樣變，但未從NAFLD臨床上常規(guī)的生理生化、病理學(xué)切片和盲法診斷等診斷標準進行復(fù)制動物模型。依據(jù)NAFLD生理生化和病理診斷標準和趙軍[6]等研究，本研究認為，16周高脂飲食可成功復(fù)制NAFLD大鼠模型。而這與國外文獻[16]報道的高脂飲食喂養(yǎng)大鼠16周后可以形成NAFLD大鼠的結(jié)論是一致的。

Arguello等[9]研究認為，脂肪大量堆積直接導(dǎo)致肝細胞線粒體功能失調(diào)、細胞氧化應(yīng)激損傷，進而引發(fā)肝細胞凋亡。本研究圖2結(jié)果證實，16周高脂飲食可誘導(dǎo)大鼠肝細胞凋亡率顯著增加，這也得到李軍漢等[2]實驗的證實。李軍漢等[2]研究發(fā)現(xiàn)，8周高脂飲食就可導(dǎo)致大鼠肝細胞凋亡率顯著增加。然而，NAFLD大鼠肝細胞凋亡是否由線粒體凋亡途徑所介導(dǎo)目前仍存在爭議。M Rodrigues等[28]研究表明，NAFLD肝細胞凋亡與程序性細胞死亡因子4(pro-apoptotic target programmed cell death 4，PDCD4)激活有關(guān)。Zhen等[43]研究發(fā)現(xiàn)，PDCD4能激活Bcl-2介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑。作為Bcl-2家族成員，位于線粒體外膜的Bcl-2是凋亡抑制蛋白，可與胞漿中Bcl-2家族另一成員Bax(促凋亡因子)形成同源二聚體后向線粒體膜移動，進而利于線粒體膜電位的穩(wěn)定，直接或間接地阻斷細胞色素C釋放及其下游Caspase-3凋亡信號級聯(lián)的啟動，起到抗凋亡作用。本研究圖2結(jié)果顯示，HF組(圖3B)大鼠肝臟組織Bcl-2蛋白表達明顯低于NC組(圖3A)，同時HF組Bax(圖3b)和Caspase-3(圖4B)蛋白表達則顯著高于NC組大鼠。提示，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠模型的肝臟脂毒性導(dǎo)致了肝細胞凋亡信號級聯(lián)激活，引發(fā)細胞凋亡(圖2)。

ERS在NAFLD發(fā)病過程中扮演重要角色[38]。ERS主要由缺氧、氧化應(yīng)激等刺激致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)非折疊蛋白增多，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上感受器蛋白與GRP78分離，從而引發(fā)ERS。一方面，ERS可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成途徑并促進錯誤折疊蛋白降解過程，維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)；另一方面，延遲或過度的ERS經(jīng)GRP78、CHOP和Caspase3啟動肝細胞線粒體凋亡途徑[20]。Ozcan等[33,24]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠肝臟ERS標記物表達較高，并與肝臟損傷標志物表達和脂肪肝患病率呈正相關(guān)。提示，NAFLD肝組織脂質(zhì)沉積、肝細胞凋亡與ERS有關(guān)[24，40]。為了明確ERS與細胞凋亡的關(guān)聯(lián)，本研究引入“ERS”強度概念[5]，即采用GRP78/Caspase3比值來評價肝細胞ERS啟動未折疊蛋白反應(yīng)后，是抵御外界干擾保護肝細胞功能，還是啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)引起細胞凋亡。本研究圖4顯示，HF組大鼠肝組織GRP78和Caspase3蛋白表達均顯著高于NC組，但GRP78/Caspase3比值顯著低于NC組。結(jié)合圖2和圖3結(jié)果推測，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝細胞ERS強度過度，后者經(jīng)Caspase3和Bax途徑啟動了肝細胞凋亡過程。

作為ER腔中最豐富的分子伴侶，CHOP 和GRP78參與肝細胞凋亡，二者也被認為是介導(dǎo)ERS誘導(dǎo)肝細胞凋亡的標志性蛋白。研究表明，CHOP能調(diào)節(jié)凋亡因子表達，包括Bcl-2家族和Caspase3家族[10]。在無ERS狀態(tài)下，GRP78與肌醇需要蛋白1(IRE1)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)RNA樣蛋白激酶(PERK)結(jié)合而處于失活狀態(tài)；但處于ERS過度狀態(tài)時，GRP78與IRE1及PERK分離而活化，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ⅰ型跨膜蛋白，IRE1活化將激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)介導(dǎo)的凋亡途徑[11,36]；PERK活化將經(jīng)eIF2α上調(diào)CHOP表達?？傊?，ERS可以同時經(jīng)IRE1/JNK通路和PERK/eIF2α/CHOP兩條通路誘導(dǎo)肝細胞凋亡[10]。本研究圖5B和圖6結(jié)果顯示，HF組大鼠肝組織IRE1、JNK、PERK、eIF2α和CHOP蛋白表達均高于NC組。提示，NAFLD大鼠肝細胞線粒體凋亡途徑的啟動與ERS誘導(dǎo)IRE1/JNK1通路和eIF2α/CHOP兩條通路同時活化有關(guān)。

3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制介導(dǎo)運動訓(xùn)練對NAFLD肝細胞凋亡的保護作用

流行病學(xué)調(diào)查顯示[35]，久坐和缺乏活動與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)，體育運動是防治NAFLD最有效手段之一[25]。業(yè)已證實，體育運動改善機體的脂代謝與肌細胞對游離FFA的攝取及其分解供能增加有關(guān)。李軍漢等[2]在高脂喂養(yǎng)過程中進行有氧運動干預(yù)發(fā)現(xiàn)，8周運動干預(yù)能預(yù)防高脂飲食導(dǎo)致的肝組織病理形態(tài)和肝細胞凋亡。然而，本研究對NAFLD大鼠進行運動干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有NAFLD大鼠在運動干預(yù)后血清TG、TC、LDL-c、HDL-c和FFA均明顯低于HF組(表1)。LE組(圖1C)大鼠肝小葉內(nèi)可見彌漫性脂肪泡分布，脂肪大泡參雜其間，但脂肪變性程度顯著下降，小葉內(nèi)炎癥病灶減輕；ME(圖1D)和IE(圖1E)組大鼠肝組織尚可見彌散性脂肪小泡，脂肪大泡明顯減少，炎性病灶明顯減輕。研究證實，體育運動能減少NAFLD患者血液中TG、TC和FFA含量[32]。本研究圖3和圖4顯示，所有運動干預(yù)組大鼠肝細胞凋亡、Bax及Caspase3蛋白表達較模型組明顯升高，Bcl-2表達較模型組明顯降低。結(jié)合本研究表1、圖2和圖3可推測，有氧運動訓(xùn)練可能通過改善NAFLD大鼠脂代謝，進而減弱了脂毒性所導(dǎo)致的肝細胞氧化應(yīng)激損傷和肝細胞凋亡[19]。值得指出的是，本研究表1結(jié)果顯示，ME組大鼠FFA水平顯著低于RVS組。提示，運動訓(xùn)練對NAFLD大鼠的脂代謝改善優(yōu)于RVS補充。這也得到Jeong等[21]研究印證。Jeong等[21]研究進一步表明，有氧運動對肥胖小鼠骨骼肌脂肪酸代謝相關(guān)基因表達、炎癥反應(yīng)的改善優(yōu)于RVS組?？傊趋兰≈舅岽x基因表達和信號通路在中等強度耐力運動后的發(fā)生適應(yīng)性改變參與了機體脂代謝改善過程。

本研究圖4和圖5A結(jié)果顯示，與HF組相比，ME和LE組大鼠的CHOP、Caspase3、eIF2α蛋白表達和GRP78/Caspase3比值均顯著降低；僅有ME組p-IRE1蛋白表達降低，而IRE1和PERK蛋白表達顯著增加。提示，LE可能通過eIF2α/CHOP通路抑制NAFLD大鼠的肝細胞凋亡，而ME可能同時抑制了IRE1/JNK1和eIF2α/CHOP兩條通路，推測ME對NAFLD大鼠脂代謝和肝細胞凋亡的保護作用優(yōu)于LE，這也得到了脂代謝相關(guān)指標TG、HDL-c、FFA(表1)和凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax表達的印證(圖3)。羅艷蕊等[3]研究也證實，6周ME能明顯改善NAFLD大鼠肝臟病理學(xué)結(jié)構(gòu)，并抑制肝細胞凋亡發(fā)生。Kannan等[23]研究也認為，3種運動強度(小、中和大強度)中更建議采用中等強度運動，更有利于降低NAFLD患者血脂，同時在改善患者的心功能方面效果更好。

值得注意的是，IE組大鼠TG、TC、LDL-c和FFA顯著低于HF組，但肝細胞IRE1/JNK1和eIF2α/CHOP兩條通路相關(guān)蛋白表達與NAFLD組均無顯著性差異，僅Caspase3蛋白表達顯著降低，這也說明IE對NAFLD脂代謝改善并非依賴IRE1/JNK和eIF2α/CHOP介導(dǎo)的凋亡通路調(diào)控；但可能依賴于脂聯(lián)素對SIRT1/NF-KB介導(dǎo)的炎癥通路抑制作用，后者減少了炎性細胞因子MCP1、NCF2基因表達，從而抑制NAFLD的炎癥反應(yīng)和纖維化程度，提高促進機體脂代謝水平[6]。

3.3 白藜蘆醇對NAFLD肝細胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

小分子多酚類物質(zhì)RSV具有多種藥理活性，可以發(fā)揮類胰島素樣作用，包括促進骨骼肌、脂肪、肝臟對葡萄糖和游離脂肪酸的攝取和利用，從而降低血糖、血脂水平[22]，RVS可用于NAFLD防治。人體研究表明，補充RSV可改善NAFLD患者的肝臟胰島素敏感性、提高肝臟組織的能量代謝水平[12]。通過對NAFLD患者進行為期12周的RSV補充和單純生活方式改變后發(fā)現(xiàn)，RSV補充對NAFLD患者肝臟組織的炎癥反應(yīng)的改善作用明顯優(yōu)于單純生活方式[15]。研究表明，為期8周、劑量為8 mg/kg/天[41]、10 mg/kg/天[7]、15 mg/kg/天[18]、30 mg/kg/天[8]和40 mg/kg/天[18]的RSV補充可降低TG、TC和LDL-C，其中劑量10 mg/kg/天的RSV對TG和LDL-C改善分別達83%和86%。本研究表1結(jié)果顯示，為期6周劑量為40 mg/kg/天的RVS對NAFLD大鼠血清TG、TC、LDL-c、HDL-c和FFA均具有改善作用。RSV組(見圖1F)肝臟HE切片光鏡下觀察肝小葉結(jié)構(gòu)尚可見。肝細胞呈放射排列，形成肝細胞索，但肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞較對照組體積增加，胞漿疏松呈網(wǎng)狀，肝細胞內(nèi)、細胞核周圍脂肪空泡較模型組體積減小，脂肪變性程度減輕。曹姣等[2]研究也證實發(fā)現(xiàn)，劑量為40 mg/kg/天的RVS能通過降低TG、LDL-c和FFA來改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠的脂代謝。盡管有研究認為RSV對NAFLD的改善仍存在爭議[11]。推測可能與采用RVS劑量差異有關(guān)。

RVS對NAFLD患者的肝細胞凋亡是否具有保護作用尚不清楚。文獻報道，花生四烯酸誘導(dǎo)肝細胞氧化應(yīng)激可作為NAFLD體外細胞模型，RVS能抑制花生四烯酸誘導(dǎo)的肝細胞凋亡[36]。本研究實驗證實，與NAFLD組相比，RVS降低NAFLD大鼠的肝細胞凋亡率、Bax及Caspase3蛋白表達，而Bcl-2表達顯著增加。Liu等[27]研究也發(fā)現(xiàn)，RVS下調(diào)Bax蛋白表達，并降低Bax/Bcl-2比值和Caspase-3的活化，進而抑制乙醇誘導(dǎo)的肝細胞凋亡。Shin等[36]進一步發(fā)現(xiàn)，RVS可通過激活A(yù)MPK/GSK3beta來加強肝細胞抗氧化活性，進而保護花生四烯酸誘導(dǎo)的肝細胞凋亡。作為SIRT1的激活劑，RVS能通過激活SIRT1降低乙醇誘導(dǎo)肝細胞ERS相關(guān)蛋白(GRP78、p-IRE1α、p-eIF2α、p-PERK和CHOP)和凋亡促進因子(Bax、ATF4和caspase-3/12)表達，進而通過抑制ERS來防止乙醇誘導(dǎo)的肝細胞凋亡[27]。

然而，RVS是否能通過調(diào)節(jié)ERS來抑制高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝細胞凋亡？本研究結(jié)果表明，RVS對NAFLD大鼠肝細胞ERS相關(guān)蛋白GRP78、p-IRE1、eIF2α、PERK和CHOP蛋白表達均沒有明顯影響(圖4、圖5和圖6)。提示，單純的RVS補充對NAFLD大鼠脂代謝的改善及其肝細胞凋亡的保護并非依賴于對ERS的調(diào)控。文獻報道，RVS可通過激活A(yù)MPK[42]、TNF-alpha/NF-κB[8]和SIRT1[42]改善NAFLD大鼠脂代謝，這些信號通路是否與RVS抑制肝細胞凋亡有關(guān)有待進一步證實。

3.4 運動訓(xùn)練聯(lián)合白藜蘆醇對NAFLD肝細胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

近年來人們熱衷于將體育運動與RVS聯(lián)合起來研究二者的協(xié)同效應(yīng)[14,38,39]。文獻表明，運動聯(lián)合RVS對抑制機體炎癥反應(yīng)、提高細胞內(nèi)抗氧化酶活性具有協(xié)同效應(yīng)[17,31]，對改善心肌脂肪酸分解和骨骼肌運動能力優(yōu)于單純的耐力運動和RVS[17]。王軍立等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與單純運動干預(yù)相比，運動聯(lián)合RVS對2型糖尿病大鼠骨骼肌的胰島素信號通路和脂代謝的改善作用更加顯著。然而，運動聯(lián)合RVS是否對NAFLD大鼠也有相似的保護作用？基于本研究發(fā)現(xiàn)的中等強度運動作用效果優(yōu)于其他運動組，故在中等強度運動前補充劑量為40 mg/kg/天的RVS，探究RVS優(yōu)化運動訓(xùn)練對NAFLD的保護作用。本研究表1顯示，RE組大鼠血清TG、TC、LDL-c和FFA顯著低于HF組，而HDL-c則明顯高于HF組；值得指出的是，與ME組和RSV組相比，RE組大鼠TG、LDL-c和FFA顯著降低(P<0.05)。RE(圖1G)組大鼠肝小葉尚清楚，肝索可見，核周的脂肪小空泡數(shù)目明顯減少。Dolinsky等[14]研究證實，與單純的中等強度運動訓(xùn)練相比，運動訓(xùn)練聯(lián)合RVS對肥胖大鼠的心肌細胞的脂肪酸分解速率、脂肪酸代謝相關(guān)基因及其信號通路的改善作用更為顯著。提示，RVS補充可強化運動訓(xùn)練對肥胖大鼠脂肪酸代謝紊亂的調(diào)理作用。提示，運動訓(xùn)練聯(lián)合RVS能更有效的改善NAFLD大鼠脂代謝紊亂，加速了脂代謝，降低血清FFA水平。

文獻報道，RVS能強化運動訓(xùn)練對衰老大鼠的骨骼肌線粒體功能失調(diào)[30]、肝臟抗氧化酶活性降低[38]、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的改善作用[29]。機制研究表明，SIRT1/FOXO3和PI3K/AKT雙重信號通路介導(dǎo)了RVS對運動訓(xùn)練延緩心肌細胞衰老、抑制衰老大鼠心肌細胞凋亡的強化作用[26]。

本研究圖2和圖3表明，RE組大鼠肝細胞凋亡和凋亡的相關(guān)蛋白表達明顯低于ME組和RSV組，這說明運動干預(yù)聯(lián)合RVS對NAFLD大鼠肝細胞凋亡的保護作用明顯優(yōu)于二者的單獨作用。本研究圖6進一步顯示，ERS相關(guān)蛋白GRP78、IRE1、JNK1、eIF2α和CHOP在RE組的大鼠肝臟中的表達量顯著低于ME組和RVS組。提示，運動聯(lián)合RVS干預(yù)可能通過同時調(diào)控IRE1/JNK1通路和eIF2α/CHOP雙重信號通路來抑制NAFLD大鼠肝細胞凋亡信號級聯(lián)的激活，從而更加有效的延緩NAFLD發(fā)展進程。

4 小結(jié)

1.16周高脂飲食可復(fù)制NAFLD大鼠模型，NAFLD大鼠肝細胞線粒體凋亡途徑的啟動與ERS誘導(dǎo)IRE1/JNK1通路和eIF2α/CHOP兩條通路活化有關(guān)。

2.不同強度耐力運動對NAFLD大鼠血脂各項指標和肝細胞凋亡均有不同程度的改善作用，但中等強度耐力運動優(yōu)于其他運動組，這可能依賴于對介導(dǎo)肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號途徑IRE1/JNK1和eIF2α/CHOP調(diào)控。

3.白藜蘆醇補充對NAFLD大鼠血脂各項指標和肝細胞凋亡也有改善作用，但并非依賴于對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡途徑的抑制。

4.白藜蘆醇補充可以強化中等強度耐力運動對肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路IRE1/JNK1和eIF2α/CHOP雙重抑制效應(yīng)，從而更加有效的改善NAFLD大鼠脂代謝和肝細胞凋亡。

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Role of Endoplasmic Reticulum Stress in Exercise Training and Resveratrol-induced Prevention of NAFLD Rat Liver Cell Apoptosis

RUAN Ling1,LI Fang-hui2

Objective:To observe the impact on exercise and resveratrol (RSV) for blood lipids,liver cells apoptosis and endoplasmic reticulum stress on nonalcoholic fatty liver rats.Methods:70 SPF male SD rats were divided into seven groups,the normal control group (NC),high fat group (HF),model with low intensity-endurance exercise group (LE),model with middle intensity-endurance exercise group (ME),model with increment intensity-endurance exercise group (IE),RSV group,RSV with middle intensity exercise group (RE),10 rats in each group.rats were arranged to run on the treadmill 60 min per day and 5 days per week.Rats were given by gavage of resveratrol at the dose of 40mg/day,and 7 days a week.All the intervention lasted for 6 weeks.Blood lipids were determined,morphology of liver tissue was observed by making HE sections of liver tissue,the expression of Bax and Bcl-2 were detected by immunohistochemical method,and cells apoptosis was determined by TUNEL,the protein expression of GRP78,Caspase3,IRE1,p-IRE1,JNK1,PERK,eIF2α and CHOP were detected by Western-blot.Results:Compared to HF group,the content of TG,TC,FFA,LDL-c on NAFLD rats’ serum decreased.The expression of Bax decreased and cell apoptosis reduced.The expression of Bcl-2 and HDL-c increased.Compared to HF group,the protein expression of IRE1,PERK and the ratio of GRP78/Caspase3 increased.The protein expression of Caspase3,p-IRE1,eIF2α,JNK1 and CHOP decreased.The effect of ME group was better than LE group and IE group and RE group was the best in all groups.Conclusions:1) Duplicating the model of NAFLD after 16 weeks high-fat feeding,the enablement of mitochondrial apoptotic pathway of liver cells was related to the ERS induce the pathway of IRE1/JNK1 and the pathway eIF2α /CHOP on NAFLD rats.2)The different intensity of endurance exercise was improved blood lipids and liver cells apoptosis on NAFLD rats in different levels,but ME group was better than other exercise groups,this may depends on the regulation of liver cells mediated endoplasmic reticulum stress signaling pathways IRE1/JNK1 and eIF2α/CHOP.3) Resveratrol could improve apoptosis of liver cells on NAFLD rats,but not depends on regulation of ERS signaling pathway.4) RE group reminds that resveratrol can strengthen the control of endurance exercise to ERS signal pathway IRE1/JNK and elf-2α/CHOP,to improved lipid metabolism and apoptosis in liver cells of NAFLD rats more effective.

exercise;resveratrol;nonalcoholicfattyliverdisease;apoptosis;endoplasmicreticulumstress

1000-677X(2016)08-0056-11

10.16469/j.css.201608005

2016-01-19；

2016-07-25

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(31500961)；廣東省省級科技計劃項目(2014A020220015，2015A020219015)；廣東省高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才項目(2014KQNCX225)；安康學(xué)院交叉融合項目(2015AYXKJC01)；安康學(xué)院高層次人才項目(2014AYQDZR02)。

阮凌(1983-)，女，陜西安康人，講師，博士，主要研究方向為運動與慢性疾病的研究，E-mail:ruanling2000@qq.com；李方暉(1983-)，男，江蘇連云港人，博士，在站博士后，主要研究方向為運動抗衰老機制研究，E-mail:249924208@QQ.com。

1.安康學(xué)院 體育學(xué)院，陜西 安康 725000；2.肇慶學(xué)院 體育與健康學(xué)院，廣東 肇慶 526061 1.Ankang University,Ankang 725000,China；2.Zhaoqing University,Zhaoqing 526061,China.

G804.7

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