一株苦馬豆素降解菌的分離與鑒定

賈琦珍，陶大勇，鄧 利，陳根元，王 帥

(塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

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一株苦馬豆素降解菌的分離與鑒定

賈琦珍，陶大勇，鄧 利，陳根元，王 帥

(塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

旨在從小花棘豆(OxytropisglabraDC)生長(zhǎng)環(huán)境中分離可降解其主要毒性成分苦馬豆素(Swainsonine，SW)的微生物。通過(guò)富集馴化培養(yǎng)，以SW為唯一碳源，從埋置小花棘豆的土壤中分離得到1株SW降解菌。形態(tài)學(xué)觀察表明該降解菌為革蘭氏陰性短小桿菌，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛；生理生化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該降解菌氧化酶陽(yáng)性，不產(chǎn)吲哚，不水解淀粉；16S rDNA 序列比對(duì)分析表明該降解菌屬于假單胞菌科假單胞菌屬微生物，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)與惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)同源性最高。在SW無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，菌株對(duì)100 mg/L SW的降解率為30.12%，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間不能提高其降解SW的能力，但可在高質(zhì)量濃度SW(1 000 mg/L)的處理下生長(zhǎng)；該降解菌在無(wú)SW刺激的條件下轉(zhuǎn)接 50 代，對(duì)100 mg/L SW的降解率無(wú)明顯影響。

苦馬豆素；小花棘豆；生物降解；假單胞菌

瘋草是豆科棘豆屬、黃芪屬和苦馬豆屬等有毒植物的總稱，廣泛分布于世界各地，具有繁殖系數(shù)高、抗逆性強(qiáng)、返青早、根系發(fā)達(dá)等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害草地畜牧業(yè)的發(fā)展[1]。國(guó)內(nèi)外研究[2-3]表明，因瘋草大量蔓延導(dǎo)致草場(chǎng)生態(tài)平衡受到破壞，天然草地退化嚴(yán)重，目前每年有700多萬(wàn)只放牧家畜因采食瘋草中毒，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。苦馬豆素(Swainsonine，SW)是瘋草的主要毒性成分[4]，通過(guò)影響動(dòng)物的繁殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等導(dǎo)致動(dòng)物中毒；但瘋草具有豐富的氨基酸、微量元素和能量物質(zhì)，可作為潛在的牧草資源，如能有效利用，既可促進(jìn)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，又有利于環(huán)境保護(hù)[5]。目前瘋草的防除主要有物理方法(人工挖除、焚燒等)、化學(xué)方法(除草劑滅除)和生物方法(以草治草、以蟲治草、以菌治草、以畜治草)等[6]，研究最多、最有成效的方法是SW的微生物降解，從而使瘋草去除毒性得到利用。本試驗(yàn)擬從埋置瘋草的土壤中富集篩選，找到高效穩(wěn)定降解 SW 的菌株，為瘋草的開(kāi)發(fā)利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材 料

小花棘豆于2014年9月采自新疆克州阿合奇縣色帕巴依鄉(xiāng)，由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)學(xué)科組鑒定，氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定小花棘豆樣品中SW質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(19.52±2.78) mg/kg，確定為瘋草[5]；采集小花棘豆生境地下0～30 cm土壤，密封后帶回。

SW標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%，生產(chǎn)批號(hào)0B003616)，甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(me-gal，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%，生產(chǎn)批號(hào)M7257)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(BSTFA+TMCS，二者體積比為99∶1，生產(chǎn)批號(hào)LB62404)，美國(guó)Supelco公司；吡啶，色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；TaqⅠ DNA聚合酶(1189A)、DL2000 DNA Marker(3591A)、IPTG(9030)、X-Gal(9031)等均購(gòu)自TAKARA寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、DNA片段快速回收純化試劑盒，北京天根生化科技有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Carry 100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)Varian公司；CX31型生物顯微鏡， 奧林巴斯(中國(guó))有限公司；Direct-Q3型超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；DYY-Ⅱ型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；GC-C14氣相色譜儀，島津(中國(guó))有限公司。

1.2 主要培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：NH4NO31.0 g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO40.15 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，蒸餾水1 000 mL ，pH 7.0～7.2；固體培養(yǎng)基每100 mL再加入1.8 g瓊脂。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)：胰蛋白胨1.0 g，牛肉浸膏 0.5 g， NaCl 0.5 g，K2HPO40.1 g，蒸餾水1 000 mL ，pH 7.0～7.2 ；固體培養(yǎng)基每100 mL再加入2.0 g瓊脂。

普通肉湯培養(yǎng)基(LB)：胰蛋白胨 10 g，酵母浸膏 5.0 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL ，pH 7.0～7.2。

1.3 SW降解菌的篩選

稱取小花棘豆鮮樣10 g，埋置于采集的土壤中60 d。去除植物殘?jiān)蜕暗[等，稱取土壤10 g，加入90 mL滅菌蒸餾水，200 r/min振蕩混勻10 min。靜置后取上清液10 mL接種于90 mL液體NA培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。取10 mL上述培養(yǎng)基接種于90 mL 含50 mg/L SW的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔3 d按10%的接種量接種于新鮮的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并逐步提高SW的質(zhì)量濃度，直至1 000 mg/L。然后涂布接種于SW無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后根據(jù)菌落形態(tài)進(jìn)行分離純化。挑取純化菌種置于含50 mg/L SW的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，然后接種于斜面培養(yǎng)基，4 ℃保存。

1.4 SW降解菌降解能力的測(cè)定

將獲得的SW降解菌接種于含不同質(zhì)量濃度(50、100、200、400、800和1 000 mg/L)SW的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。參照文獻(xiàn)[7]方法，分別取100 μL培養(yǎng)前和培養(yǎng)后的培養(yǎng)基，加入去離子水100 μL和丙酮600 μL，超聲處理15 min 以去除培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，然后12 000 r/min離心10 min取上清液；重復(fù)3次后合并上清液，冷凍干燥得到待測(cè)樣。將待測(cè)樣與內(nèi)標(biāo)物甲基-α-D-吡喃甘露糖苷溶于吡啶，再與衍生劑雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷反應(yīng)5 h后，采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)SW質(zhì)量濃度。其色譜條件為：進(jìn)樣口溫度300 ℃，柱溫200 ℃，F(xiàn)ID溫度280 ℃，分流比60∶1，載氣為高純H2，壓力200 kPa，進(jìn)樣量為1 μL。降解率計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[8]。

1.5 SW降解菌降解SW穩(wěn)定性的測(cè)定

將該降解菌接入無(wú) SW 刺激的 LB 斜面上，每隔48 h轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)轉(zhuǎn)接50次，每隔10代按“1.4”方法檢測(cè)對(duì)100 mg/L SW的降解率。

1.6 SW降解菌的鑒定

將分離得到的SW降解菌在普通瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]，通過(guò)形態(tài)觀察、革蘭氏染色和生理生化試驗(yàn)進(jìn)行初步鑒定；然后提取降解菌DNA，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為27f-1492r，并轉(zhuǎn)入E.coliDH5α，藍(lán)白斑篩選后，挑取白色克隆培養(yǎng)送TAKARA(大連)有限公司測(cè)序、拼接。將得到的序列用NCBI在線BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)。用MEGA6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并進(jìn)行同源性和系統(tǒng)學(xué)分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)并判斷其分類。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA方法進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SW降解菌的篩選

根據(jù)菌落形態(tài)，試驗(yàn)初步分離得到28株菌。以SW為唯一碳源，細(xì)菌在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d后，通過(guò)氣相色譜法測(cè)定得到1株具有降解SW能力的菌，命名為XJAHQ26菌株。

2.2 降解SW能力的測(cè)定

由表1可知，當(dāng)SW質(zhì)量濃度處于50～1 000 mg/L時(shí)，菌株XJAHQ26均具有一定的降解能力。其中，在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，對(duì)質(zhì)量濃度為100 mg/L SW的降解率(30.12%)最高，顯著高于對(duì)質(zhì)量濃度為50 mg/L SW的降解率(P<0.05)，極顯著高于對(duì)質(zhì)量濃度為400、800和1 000 mg/L SW的降解率(P<0.01)，但與對(duì)質(zhì)量濃度200 mg/L SW的降解率差異不顯著(P>0.05)。表明菌株XJAHQ26對(duì)低質(zhì)量濃度(≤200 mg/L)SW的降解效果較好，但對(duì)較高質(zhì)量濃度SW(≥400 mg/L)的降解效果較差。

表1 不同SW質(zhì)量濃度下菌株的降解率

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株降解SW能力的影響

由表2可知，培養(yǎng)24、48、72、96和144 h時(shí)，菌株XJAHQ26對(duì)100 mg/L SW的降解率分別為30.12%、33.20%、33.87%、33.73%和33.84%，表明延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間可提高菌株XJAHQ26對(duì)100 mg/L SW的降解率，但與培養(yǎng)24h時(shí)的降解率差異均不顯著(P>0.05)。即延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間并不能有效提高菌株XJAHQ26對(duì)100 mg/L SW的降解率，而且試驗(yàn)72 h后，XJAHQ26對(duì)SW的降解率趨于穩(wěn)定。

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間下菌株對(duì)SW的降解率

2.4 SW降解菌降解SW的穩(wěn)定性

如表3所示，轉(zhuǎn)接10、20、30、40和50次時(shí)菌株XJAHQ26對(duì)100 mg/L SW的降解率分別為30.41%、31.25%、30.64%、30.13%和30.07%，5次測(cè)定的降解率差異均不顯著(P>0.05)。表明菌株XJAHQ26具有較好的降解穩(wěn)定性，在瘋草的脫毒利用方面具有一定的研究?jī)r(jià)值。

表3 不同轉(zhuǎn)接次數(shù)的菌株SW降解率

2.5 降解菌的形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果

通過(guò)菌落形態(tài)觀察和革蘭氏染色，菌株XJAHQ26為革蘭氏陰性短桿菌，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜。在LB平板上為乳白色圓形菌落，邊緣整齊，表面光滑，如圖1和圖2所示。

細(xì)菌的部分生理生化特征為：吲哚試驗(yàn)陰性、鞭毛染色陰性、葡萄糖發(fā)酵陰性、蔗糖發(fā)酵陰性、乳糖發(fā)酵陰性、甘露醇發(fā)酵陰性、淀粉水解陰性、硝酸鹽還原陰性、硫化氫生成陰性、過(guò)氧化氫酶反應(yīng)陽(yáng)性、接觸酶反應(yīng)陰性、明膠水解試驗(yàn)陰性、甲基紅試驗(yàn)陰性、苯丙氨酸試驗(yàn)陽(yáng)性、精氨酸試驗(yàn)陽(yáng)性、脯氨酸試驗(yàn)陽(yáng)性。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]，初步判斷為假單胞菌屬(Pseudomonas)。

圖1 菌株XJAHQ26菌落形態(tài)

2.6 降解菌的分子鑒定結(jié)果

圖2 菌株XJAHQ26的革蘭氏染色

測(cè)序結(jié)果表明菌株XJAHQ26的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1439bp，將菌株的16S rDNA序列與NCBI中核酸16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與假單胞菌屬(Pseudomonas)惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的一致性為100%。選取與其相近的部分菌株16S rDNA序列利用 MEGE 6.0 軟件建立無(wú)根進(jìn)化樹(shù)(圖3)，確定該菌株為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。

圖3 基于菌株XJAHQ26和親源關(guān)系相近菌株的16S rDNA序列的無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討 論

中國(guó)現(xiàn)有黃芪屬植物278種，棘豆屬植物120種，苦馬豆屬植物1種，其中新疆分布黃芪屬植物81種，約占全國(guó)總種數(shù)的29%；棘豆屬植物97種，約占中國(guó)總種數(shù)的81%，苦馬豆屬植物1種[4]。新疆牧區(qū)草原分布的瘋草(主要毒性成分為SW)共20種，其中優(yōu)勢(shì)種8種，分布面積已超過(guò)100萬(wàn)hm2，并且每年還在以3.3%～3.5%的速度蔓延，現(xiàn)已嚴(yán)重影響新疆草原畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6]。瘋草的防除方法目前主要有人工挖除、化學(xué)滅除和生物防除等，其中，生物防除是通過(guò)生物間的互相制約關(guān)系進(jìn)行防除，具有較好的防除效果與生態(tài)效應(yīng)。比如在瘋草滋生的地段，通過(guò)改變土壤氮、磷水平及補(bǔ)播一些適宜的優(yōu)良牧草，或采用封灘育草和草地施肥及灌溉等措施，使草地上優(yōu)良牧草增多，瘋草減少；還可利用家畜或昆蟲對(duì)瘋草的專嗜性進(jìn)行滅除；也可在瘋草含毒量較低的生長(zhǎng)階段適時(shí)適度放牧，即可減少瘋草數(shù)量，又可利用瘋草中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。應(yīng)用生物降解手段如培育SW降解菌也為解決家畜瘋草中毒提供一條新的途徑。

利用微生物進(jìn)行毒素降解具有成本低、對(duì)環(huán)境影響小、可最大限度降低污染物濃度、可用于其他技術(shù)難以應(yīng)用的場(chǎng)地等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)研究人員對(duì)SW的微生物降解已進(jìn)行大量的前期工作。李勤凡[10]從冰川棘豆生長(zhǎng)的環(huán)境土壤中分離得到1株能降解SW的菌，其對(duì)50 mg/L SW的降解率為14.2%。Zhao等[11]通過(guò)富集馴化培養(yǎng)，從甘肅棘豆生長(zhǎng)環(huán)境中的土壤中分離出4株SW降解菌，對(duì)SW的降解率分別為100%、100%、99.03%和 97.80%，鑒定發(fā)現(xiàn)1株為醋酸鈣不動(dòng)桿菌，1株為多食鞘氨醇桿菌，其余2株為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌；但4株菌降解 SW 的穩(wěn)定性均較差，不便于對(duì) SW 降解機(jī)制及應(yīng)用的研究。Wang等[12]從埋置黃花棘豆的土壤中分離得到1株SW降解菌，經(jīng)鑒定與解硝基鄰甲氧基苯酚節(jié)桿菌同源性最高，最終命名為ArthrobacternitroquajacolicusHW08；該菌連續(xù)在無(wú)SW刺激的條件下轉(zhuǎn)接100次，仍能在4 h內(nèi)降解300 mg/L的SW。胡延春等[8]從甘肅棘豆內(nèi)生細(xì)菌中篩選到1株SW降解菌，鑒定為缺陷短波單胞菌，命名為BrevundimonasdiminutaAb，但其對(duì)100 mg/L SW的降解率僅為11.577 1%。本試驗(yàn)獲得1株可降解SW的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，對(duì)200 mg/L 以下質(zhì)量濃度的SW均具有較高的降解率，而且該株菌在無(wú)SW刺激的條件下轉(zhuǎn)接50次，SW降解能力無(wú)顯著下降，表明具有較好的穩(wěn)定性。目前，假單胞菌主要應(yīng)用于有機(jī)物污染和重金屬污染的生物修復(fù)，尚未有假單胞菌屬降解生物堿的報(bào)道，本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌具有降解SW的能力，為SW降解菌的篩選提供新的方向。

SW的降解途徑、降解產(chǎn)物及是否對(duì)動(dòng)物具有毒性已有部分結(jié)論，SW降解菌的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、降解酶的分離、結(jié)構(gòu)測(cè)定及編碼酶基因的測(cè)序等方法也趨于完善。在此基礎(chǔ)上，可以進(jìn)一步構(gòu)建出基因工程菌或開(kāi)發(fā)出酶制劑，應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中解決瘋草中毒問(wèn)題。Wang等[13]認(rèn)為菌株YLZZ-2降解SW的能力與質(zhì)粒有關(guān)，質(zhì)粒消除則降解能力就喪失。但胡延春等[14]制備節(jié)桿菌ArthrobacternitroquajacolicusHW08的質(zhì)粒，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒存在，表明其降解SW的功能基因存在于基因組中。國(guó)內(nèi)外研究[13-15]表明，假單胞菌降解有機(jī)污染物質(zhì)的基因多數(shù)是在質(zhì)粒上，但其降解SW的功能基因存在于質(zhì)粒還是基因組中，仍有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

從小花棘豆生境土壤中篩選得到1株SW降解細(xì)菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)方法鑒定，初步判斷該菌為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，命名為XJAHQ26。該菌在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，對(duì)質(zhì)量濃度為100 mg/L SW的降解率為30.12%，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間并不能明顯提高其降解SW的能力，但該菌能耐受高質(zhì)量濃度(1 000 mg/L)的SW，而且具有較好的降解穩(wěn)定性。

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(責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Isolation and Identification of Swainsonie Degrading Bacteria

JIA Qizhen,TAO Dayong,DENG Li,CHEN Genyuan and WANG Shuai

(Key laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production & Construction Corps,College of Animal Science, Tarim University, Alar Xinjiang 843300,China)

The aim of this study is to investigate the major toxin swainsonine(SW) degrading bacterial strain isolated from soil whereOxytropisglabraDC grows. Using traditional enrichment procedure, this bacterial strain was screened when SW was used as a sole carbon source, and this strain of SW-degrading bacteria was isolated from soil whereO.glabraDC embed. Morphological investigation showed that bacterial strain was Gram negative, bacillus pumilis, capsule-free and flagella-free. Physiological and biochemical results showed that bacterial strain was positive for oxidase, and negative for indoltheticum and amylolysis. 16S rDNA sequencing and blasting indicated that bacterial strain was taxonomically classified asPseudomonas. And the homology exhibited highest compared withPseudomonasputida. Its degradation rate reached to 30.12% under the circumstance of incubation on a shaker at 200 r/min and temperature at 37 ℃ within 24 hours when the concentration of SW was 100 mg/L in inorganic salt liquid medium, the capability of degrading SW could not be improved by extending cultivation time, while it could tolerate high concentration SW up to 1 000 mg/L, this strain was characteristic of degrading 100 mg/L SW after re-inoculating 50 times without stimulus of SW, Its degradation rate had no significant change. one bacterial stain was found resist to SW in this test, this bacterial stain couldbe made use for detoxification and utilization inO.glabraDC.

Swainsonine;OxytropisglabraDC ; Biodegradation;Pseudomonas

JIA Qizhen, female,master,assistant research fellow.Research area:animal pathology. E-mail:xiaxue1984521@126.com

WANG Shuai, male, master, experimentingist. Research area:forage development and utilization. E-mail:wangshuaidky@126.com

2015-07-17

2015-09-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(31460678，31260026)；國(guó)家星火計(jì)劃(2015GA891015)。

賈琦珍，女，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物病理學(xué)。E-mail:xiaxue1984521@126.com

王 帥，男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)槟敛葙Y源開(kāi)發(fā)利用。E-mail:wangshuaidky@126.com

日期：2016-10-20

S859.8

A

1004-1389(2016)10-1554-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1655.040.html

Received 2015-07-17 Returned 2015-09-15

Foundation item National Natural Science Foundation of China (No.31460678,31260026) ; National Sparking Plan Project of China (No. 2015GA891015).