柿葉黃酮超聲輔助提取工藝及其抗氧化性研究

盧鑫，張琳

（濟(jì)源職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南濟(jì)源459000）

柿葉黃酮超聲輔助提取工藝及其抗氧化性研究

盧鑫，張琳

（濟(jì)源職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南濟(jì)源459000）

研究超聲波輔助提取柿葉總黃酮的工藝條件及其抗氧化活性。采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，考察乙醇濃度、固液比、超聲功率、浸提溫度及提取時(shí)間等因素對(duì)柿葉總黃酮提取率的影響，并以柿葉總黃酮體外清除DPPH自由基能力為指標(biāo)，評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明，超聲波輔助提取柿葉總黃酮最佳工藝條件為乙醇濃度為70%，固液比1∶20（g/mL），超聲功率350W，超聲時(shí)間40min，浸提溫度55℃，提取2次，柿葉總黃酮得率約為0.70%（以干柿葉計(jì)）；在0～100μg/mL范圍內(nèi)，柿葉總黃酮抗氧化能力高于VC，對(duì)DPPH自由基的體外清除率達(dá)85.96%；超過(guò)100μg/mL時(shí)，清除作用基本穩(wěn)定不變，濃度和清除率不顯示量效關(guān)系。通過(guò)擬合線性方程計(jì)算柿葉總黃酮的IC50值為5.45μg/m L，表明柿葉黃酮是良好的抗氧化劑。

柿葉總黃酮；提取工藝；抗氧化性

柿葉是柿樹(shù)科柿樹(shù)屬柿樹(shù)種植物的鮮葉或干燥葉，是重要的中藥資源。用柿葉制成的中成藥已經(jīng)用于臨床實(shí)踐，廣州白云山中藥廠“腦心清”的組方就只有柿葉一味中藥，臨床實(shí)踐證明它對(duì)治療心血管疾病有確切的療效；廣西生產(chǎn)的“腦心寧”以柿葉為主藥，能改善患者血液的濃、黏、凝聚狀態(tài)，達(dá)到改善心腦組織缺血、缺氧的目的。在保健食品方面，用柿葉制成的柿葉茶曾風(fēng)靡日本、韓國(guó)，至今仍然不衰，我國(guó)對(duì)柿葉茶

開(kāi)發(fā)研究利用的文章也有報(bào)道[1-4]。柿葉中主要的藥用成分為黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、酚類(lèi)、VC和胡蘿卜素等對(duì)人體有益的天然化學(xué)物質(zhì)。楊建雄等研究發(fā)現(xiàn)柿葉黃酮有明顯的抗氧化作用[5]。歐陽(yáng)平等研究發(fā)現(xiàn)柿葉黃酮對(duì)糖尿病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和機(jī)體衰老等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程均有一定的抑制作用[6]。除此之外，柿葉黃酮還有止血、抗菌、解熱、抗過(guò)敏，增強(qiáng)免疫等功能。近年來(lái)，不少國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、空化效應(yīng)、高加速度和攪拌作用，把超聲波提取技術(shù)應(yīng)用到天然產(chǎn)物提取分離中，使該領(lǐng)域有了很大的發(fā)展，超聲波輔助提取不僅能使有效成分提取率增高，而且可以降低溫度，有利于保護(hù)有效成分[7]。本文對(duì)采用超聲波輔助提取柿葉中黃酮類(lèi)化合物的工藝及其抗氧化性能進(jìn)行了研究，旨在為廢棄柿葉資源化利用和功能性保健柿葉產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柿葉：采自河南王屋山，自然干燥后粉碎并過(guò)60目篩得柿葉粗粉，密封備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙酸乙酯：均為分析純；試驗(yàn)用水：為去離子水。

1.2 主要儀器與設(shè)備

KQ-500E型超聲波發(fā)生器：上海昆山儀器有限公司；501BS超級(jí)恒溫水浴鍋：江蘇常州科邁試驗(yàn)儀器有限公司；FW100微型植物粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；XR205Sm-DR電子天平：瑞士普利塞斯分析天平；3K-30高速離心機(jī)：上海安亭科技儀器廠；RE-5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；UV-1801型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司。

1.3 柿葉總黃酮的提取工藝

1.3.1 柿葉總黃酮的超聲波輔助提取工藝流程

柿葉—風(fēng)干—粉碎—過(guò)60目篩—稱量—乙醇超聲波浸提—室溫過(guò)濾—濃縮—黃酮總含量測(cè)定

1.3.2 柿葉總黃酮提取的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的干燥柿葉，按一定的料液比加入一定濃度的乙醇溶液在一定的超聲波功率下超聲浸提一定的時(shí)間，冷卻至室溫過(guò)濾，用少量乙醇洗滌濾渣，提取一定的次數(shù)，合并濾液，濾液水浴旋轉(zhuǎn)蒸干，用0.1mol/L的NaOH溶液定量溶解，3 000 r/min離心15min，收集上清液，定容至50mL備用，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測(cè)得總黃酮得率。分別考察乙醇濃度、超聲功率、浸提溫度、液固比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)柿葉總黃酮得率的影響，確定各因素最佳水平[8-10]。

1.3.3 柿葉總黃酮提取的正交試驗(yàn)

在綜合單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度（A）、超聲功率（B）、提取時(shí)間（C）和液固比（D）作為影響因素，仍以柿葉總黃酮的得率為目標(biāo)做正交試驗(yàn)，用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)的因素和水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table1 Factorsand levelsof orthogonal test

1.4 柿葉總黃酮含量的測(cè)定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，用60%乙醇溶解定容至50mL容量瓶中，制得濃度為0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。取0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、2、4、6、8、10mL于25mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1mL，搖勻靜置6min，再加入10%Al（NO3）3溶液1mL，搖勻靜置6min，再加入4%NaOH溶液5mL，搖勻，用60%乙醇溶解定容，靜置15min后于510 nm處測(cè)定吸光度（A）。以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1），得其回歸方程y= 8.856 3x+0.003，R2=0.999 6，測(cè)定范圍，0～0.080mg/mL，線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curveof rutin

1.4.2 總黃酮含量的測(cè)定

取一定量的備用樣品25mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液1 mL，搖勻靜置6 min，再加入10% Al（NO3）3溶液1mL，搖勻靜置6min，再加入4%NaOH溶液5mL，搖勻，用60%乙醇溶解定容，靜置15min后于510 nm處測(cè)定吸光度（A）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算不同試驗(yàn)組提取液的柿葉總黃酮含量，并計(jì)算得率。柿葉總黃酮得率（Y）/%=（提取物中總黃酮的質(zhì)量/原料的質(zhì)量）×100。

1.5 柿葉總黃酮的抗氧化性能試驗(yàn)

1.5.1 DPPH（二苯基苦基苯肼）溶液配制

準(zhǔn)確稱取7.9mgDPPH，用無(wú)水乙醇溶液溶解并定容于100mL棕色容量瓶中，搖勻，放置于冰箱中備用。

1.5.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

取上述DPPH無(wú)水乙醇溶液2mL于不同比色管中，再分別加入50、100、150、200、250、300μg/mL柿葉總黃酮溶液2mL于同一支具比色管中，充分混合，靜置30min，在517 nm測(cè)定其吸光度AS值，每一組吸光度平行測(cè)3次，取其平均值[11]。

式中：A0為2mLDPPH自由基溶液加2mL無(wú)水乙醇的吸光度；A為2mL無(wú)水乙醇加2mL試樣的吸光度；AS為2mLDPPH自由基溶液加2mL試樣的吸光度。

柿葉總黃酮抗氧化活性采用對(duì)DPPH自由基的體外清除率和柿葉總黃酮的IC50值表示，為了比較評(píng)價(jià)抗氧化能力，試驗(yàn)中用VC做陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 柿葉總黃酮提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)柿葉總黃酮得率的影響

試驗(yàn)中固定超聲時(shí)間15min，功率350W，溫度50℃，固液比1∶20（g/mL），考察的乙醇濃度分別為0%、30%、50%、60%、70%、80%、95%。乙醇濃度對(duì)柿葉總黃酮得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)柿葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effectof ethanolconcentration on extraction rateof total flavonoids from persimm on leaves

由圖2可知柿葉總黃酮得率隨乙醇濃度增高先增大，在乙醇濃度70%處，有最高峰值，隨后，得率隨乙醇濃度增高而減小。這可能是因?yàn)槭寥~中含有極性較大的黃酮苷和極性極低的黃酮苷元所致，低濃度的乙醇易提取高極性的黃酮苷，而高濃度的乙醇易提取出低極性的黃酮苷元，用70%的乙醇提取時(shí)，兩種類(lèi)型的黃酮都可以提取出來(lái)，所以總黃酮含量最高。因此選擇60%～80%的濃度范圍進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 超聲功率對(duì)柿葉總黃酮得率的影響

試驗(yàn)中固定乙醇濃度70%，超聲時(shí)間15min，溫度50℃，固液比1∶20（g/mL），考察的超聲功率分別為250、300、350、400、450W。超聲功率對(duì)柿葉總黃酮得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲功率對(duì)柿葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effectofultrasonic power on the yield of total flavonoids from persimmon leaves

由圖3可知，柿葉總黃酮得率隨著功率的增大先增大后減少，在350W附近有最大值，因此選擇300W～400W的功率范圍進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 浸提溫度對(duì)柿葉總黃酮得率的影響

試驗(yàn)中固定乙醇濃度70%，超聲時(shí)間15min，超聲功率350W，固液比1∶20（g/mL），考察的浸提溫度分別為30、40、50、60、70℃。浸提溫度對(duì)柿葉總黃酮得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 浸提溫度對(duì)柿葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effectof extraction tem peratureon the yield of total flavonoids from persimm on leaves

由圖4可知，柿葉總黃酮得率隨浸提溫度升高而緩慢增加，60℃以后有明顯降低趨勢(shì)，這有可能是黃酮類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)易被高溫破壞所致，考慮溫度較高時(shí)，雜質(zhì)的浸出率也會(huì)提高，不利于后期純化，也從節(jié)約能源角度考慮，選取浸提溫度55℃。

2.1.4 固液比對(duì)柿葉總黃酮得率的影響

試驗(yàn)中固定乙醇濃度70%，超聲時(shí)間15min，超聲功率350W，浸提溫度55℃，考察的固液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）。固液比對(duì)柿葉總黃酮得率的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，柿葉總黃酮得率隨固液比增大而增大，這是因?yàn)槿芤毫看?，黃酮類(lèi)物質(zhì)在植物到液體本體間濃度差大，有利于傳質(zhì)進(jìn)行，固液比在1∶20（g/mL）

以后增大變得緩慢，考慮液固比過(guò)大會(huì)造成雜質(zhì)過(guò)多的浸出，因此選擇1∶10（g/mL）～1∶20（g/mL）的固液比范圍進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 固液比對(duì)柿葉總黃酮得率的影響Fig.5 Effectof solid-liquid ratio on theyield of total flavones from persimm on leaves

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)柿葉總黃酮得率的影響

試驗(yàn)中固定乙醇濃度50%，固液比1∶20（g/mL），超聲功率350W，浸提溫度50℃，考察的提取時(shí)間分別為10、25、40、55、70、85min。提取時(shí)間對(duì)柿葉總黃酮得率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 提取時(shí)間對(duì)柿葉總黃酮得率的影響Fig.6 Effectof extraction timeon theyield of total flavonoids from persimm on leaves

由圖6可知，柿葉總黃酮得率在10min到40min范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增高，提取40min后葉總黃酮得率變化不大，這可能是在超聲波作用下，溶出在較短的時(shí)間內(nèi)就達(dá)到平衡了，因此選擇30min～50min的提取時(shí)間范圍進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.6 提取次數(shù)對(duì)柿葉總黃酮得率的影響

試驗(yàn)中固定乙醇濃度60%，固液比1∶20（g/mL），超聲功率350W，浸提溫度50℃，提取時(shí)間30min，考察的提取次數(shù)分別為1、2、3、4次。提取次數(shù)對(duì)柿葉總黃酮得率的影響見(jiàn)表2。

由表2可知，浸提2次后柿葉總黃酮的得率變化不明顯，因此，從節(jié)約成本及提高提取效率角度考慮，以提取2次為宜。

表2 提取次數(shù)對(duì)柿葉總黃酮得率的影響Table2 Effectof extraction timeson the yield of total flavonoids from persimmon leaves

2.2 柿葉總黃酮提取的正交試驗(yàn)

根據(jù)表1中選擇的因素水平進(jìn)行的正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析見(jiàn)表3和表4。

表3 正交試驗(yàn)及結(jié)果Table3 Resu ltsof orthogonal test

表4 方差分析Table4 Variance Analysisof orthogonal testm ethod

由表3和表4可知，超聲波輔助提取柿葉總黃酮工藝中，影響柿葉總黃酮得率因素的主次順序?yàn)椋阂掖紳舛?固液比>超聲功率>提取時(shí)間；為檢驗(yàn)各因素對(duì)提取率影響顯著性，進(jìn)行了方差分析，利用極差最小列來(lái)估計(jì)誤差，F(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，乙醇濃度在α=0.05水平上顯著，液固比在α=0.1水平上顯著。超聲波輔助提取柿葉總黃酮的最佳條件為A2B2C2D3，即乙醇的濃度為70%，超聲功率為350W，提取時(shí)間為40min，固

液比為1∶20（g/mL）。最佳參數(shù)組合不在試驗(yàn)點(diǎn)以內(nèi)，所以做驗(yàn)證試驗(yàn)。在最佳參數(shù)組合條件下，柿葉總黃酮類(lèi)3次得率平均值為0.70%（以干柿葉計(jì)）。

2.3 柿葉總黃酮的抗氧化性能試驗(yàn)

DPPH是一種比較穩(wěn)定的脂性自由基，每個(gè)DPPH分子在溶液中可生成一個(gè)穩(wěn)定的含N自由基，在517nm處有最大吸收，具有典型的紫色，在加入抗氧化劑后，DPPH捕捉一個(gè)電子配對(duì)，紫色褪去，溶液顏色變淺，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系。可依此原理來(lái)檢定抗氧化性物的抗氧化能力。

柿葉總黃酮和VC對(duì)DPPH自由基清除率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 柿葉總黃酮對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.7 Persimmon leaf total flavonoidson the clearance rateof DPPH·

由圖7可知，柿葉總黃酮對(duì)DPPH自由基有顯著的清除作用，且隨著柿葉總黃酮濃度的增大清除作用也隨之增大，增大趨勢(shì)在濃度達(dá)到一定值后趨于平緩；在0～100μg/mL范圍內(nèi)呈近似線性相關(guān)，在100μg/mL時(shí)，柿葉總黃酮對(duì)DPPH自由基的體外清除率達(dá)85.96%，超過(guò)100μg/mL時(shí)，清除作用基本穩(wěn)定不變，清除率約為90.36%，濃度和清除率不顯示量效關(guān)系。在0～100μg/mL范圍內(nèi)，柿葉總黃酮抗氧化能力高于VC，通過(guò)擬合線性方程計(jì)算柿葉總黃酮和VC的IC50值分別為5.45μg/mL和7.67μg/mL。清除率與抗氧化劑加入量的線性關(guān)系及抗氧化物質(zhì)的IC50值見(jiàn)表5所示。

表5 清除率與抗氧化劑加入量的線性關(guān)系及抗氧化物質(zhì)的IC50值Table5 Relationship between the clearance rateand antioxidant contentand the IC50valueof antioxidant substances

3 結(jié)論

本文重點(diǎn)討論了柿葉總黃酮的超聲波輔助提取工藝和體外抗氧化活性，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)正交優(yōu)化柿葉總黃酮的提取工藝試驗(yàn)，最終確定了柿葉總黃酮超聲波輔助提取的最佳工藝條件為乙醇濃度為70%，固液比為1∶20（g/mL），超聲功率350W，超聲時(shí)間40min，提取溫度55℃，提取2次，柿葉總黃酮得率約為0.70%左右（以干柿葉計(jì)）。

通過(guò)改變柿葉總黃酮濃度對(duì)DPPH.清除率的影響研究，得出柿葉總黃酮在0～100μg/mL范圍內(nèi)，對(duì)DPPH自由基的體外清除作用隨柿葉總黃酮濃度增加而增強(qiáng)；濃度超過(guò)100μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的體外清除作用基本穩(wěn)定不變，清除率約為90.36%，濃度和清除率不顯示量效關(guān)系；通過(guò)擬合線性方程計(jì)算柿葉總黃酮的IC50值為5.45μg/mL，低于VC的IC50值7.67μg/mL，表明柿葉黃酮是良好的抗氧化劑。

本研究結(jié)果為柿葉資源開(kāi)發(fā)提供了更多的理論基礎(chǔ)，特別是對(duì)王屋山柿葉資源開(kāi)發(fā)利用提供了參考。

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Study on the Extraction Technology by Ultrasonic Assisted and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Persimmon Leaves

LUXin，ZHANGLin
（Jiyuan Vocationaland TechnicalCollege，Jiyuan 459000，Henan，China）

The extraction technology by ultrasonic assisted and antioxidantactivity of total flavonoids from persimmon leaveswere studied.Single factor testand orthogonal testweremade to study the effectsofethanol concentration，solid-liquid ratio，ultrasonic power，extraction temperature and extraction time on the extraction rate of total flavonoids from persimmon leaves and clearing DPPH radical scavenging ability in vitro of total flavonoids from persimmon leaveswas taken asan index to evaluate the antioxidantactivity.The resultsshowed that the bestcondition forextraction technology by ultrasonic assisted from persimmon leaveswaswhen ethanol concentrationwas70%，solid-liquid ratiowas1∶20（g/mL），ultrasonic powerwas350W，ultrasonic timewas 40min，soaking temperaturewas55℃and extraction wasmade for 2 times，then total flavonoids from persimmon leavescould be0.70%（calculated in dry persimmon leaves；in thescopeof0-100μg/mL，theantioxidant capacity of total flavonoids from persimmon leaveswashigher than Vc，DPPH free radical scavenging rate was 85.96%；when itwasover 100μg/mL，clear effectwasbasically stable，concentration and clearance did not show the relationship between quantity and effect.By fitting the linear equation of total flavonoids from persimmon leaves，the IC50valuewas5.45μg/mL，which showed that flavonoids from persimmon leaveswere good antioxidants.

total flavonoids from persimmon leaves；extraction process；antioxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.024

2016-02-21

濟(jì)源市科技局2014年度科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（14031018）

盧鑫（1971—），女（漢），副教授，本科，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。