花生根瘤菌遺傳多樣性及高效固氮菌株的篩選

吳海龍，李 巖，陳明娜，劉 衛(wèi)，任承鋼，楊金保,4，解志紅*，禹山林*

(1.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003； 2.中國科學院大學，北京 100049；3.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 4.山西農業(yè)大學，山西 太谷 030801)

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花生根瘤菌遺傳多樣性及高效固氮菌株的篩選

吳海龍1,2，李 巖1，陳明娜3，劉 衛(wèi)1，任承鋼1，楊金保1,4，解志紅1*，禹山林3*

(1.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003； 2.中國科學院大學，北京 100049；3.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 4.山西農業(yè)大學，山西 太谷 030801)

為揭示花生根瘤菌遺傳多樣性并篩選高效固氮菌株，本研究從山東省花生研究所萊西試驗站的5個樣點采集新鮮花生根瘤進行根瘤菌分離，對菌株的16S rRNA基因、持家基因(recA、atpD、glnII)序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析以確定根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育地位，同時對共生基因nifH序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，并通過溫室盆栽接種實驗篩選高效共生固氮根瘤菌菌株。從5個采樣點共分離到106株花生根瘤菌菌株，通過持家基因recA序列分析選定7株代表菌株。對代表菌株的16S rRNA基因與持家基因MLSA系統(tǒng)發(fā)育分析表明，所分離到的菌株分布于Bradyrhizobium的B.liaoningense、B.yuanmingense、Bradyrhizobiumsp.種群。同時，固氮基因nifH的系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，固氮基因高度保守，在系統(tǒng)進化樹上分別與B.arachidisCCBAU 051107T、B.yuanmingenseCCBAU 10071T聚為兩支。溫室盆栽實驗表明7株花生根瘤菌代表菌株均能與花生有效結瘤，其中代表菌株YIC61059共生固氮能力最強。結果分析表明，山東省萊西市花生根瘤菌遺傳多樣性較為豐富，其中B.liaoningense為優(yōu)勢種群。該地區(qū)的花生根瘤菌具有較好的結瘤和共生固氮能力，其中代表菌株YIC61059促生效果比較突出，具有良好的應用前景。

花生；根瘤菌；遺傳多樣性；高效菌株篩選

花生(ArachishypogaeaL.)為豆科一年生草本植物，是我國三大傳統(tǒng)油料作物之一，在油料作物生產中具有極其重要的地位?；ㄉc花生根瘤菌通過形成根瘤來固定空氣中的氮氣，為花生生長提供必需的氮素營養(yǎng)?；ㄉ鼍采痰w系可以滿足花生生長所需氮量的50%左右，同時還可以改善土壤肥力，提高花生的產量和品質[1]。而我國花生種植所需氮素大部分依靠化學氮肥，不僅增加了種植成本，同時由于化肥的大量生產和施肥過量引起的水肥流失造成環(huán)境污染[2-3]。因此，花生根瘤菌高效菌株的篩選和菌劑的推廣將有效降低種植成本，改善環(huán)境，促進花生種植產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

萊西市是山東省花生種植的主要地區(qū)之一，花生的播種面積居山東省前列[4]，具有優(yōu)質和豐富的花生和花生根瘤菌種質資源。本研究通過對采集、分離自山東省花生研究所萊西試驗站5個樣點的106株根瘤菌實驗分析，最終選取了7株花生根瘤菌代表菌株進行16S rRNA基因、持家基因(recA,atpD,glnII)及固氮基因nifH的系統(tǒng)發(fā)育分析研究，揭示山東萊西花生根瘤菌遺傳多樣性、分類地位及固氮基因的特性，為花生根瘤菌遺傳多樣性研究提供參考?；ㄉ鷾厥遗柙詫嶒灪Y選的高效共生固氮菌株，為研制根瘤菌劑提供了優(yōu)質的種質資源，對提高花生產量，減少化肥施用，促進生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展發(fā)揮積極作用。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

采自山東省花生研究所萊西試驗站花育33號的新鮮根瘤，分離純化獲得106株花生根瘤菌，置于20%甘油凍存管中-80℃保存[5]。

1.2 培養(yǎng)基

分離純化及花生溫室培養(yǎng)所用低氮培養(yǎng)液、YMA固體培養(yǎng)基、TY液體培養(yǎng)基成分和配制方法參照文獻[6-7]。

1.3 DNA提取

供試菌株總DNA用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒提取，在含有EB 的0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，用Nano Drop 2000檢測DNA的濃度和純度，并于-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 持家基因recA的擴增及代表菌株選取

PCR反應體系、引物及擴增條件參照文獻[8]。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。測序返回結果在NCBI上進行在線比對，然后用MEGA5.0軟件采用鄰接法(neighbor-joining method)同參比菌株序列進行比對構建進化樹，自展值(bootstrap)為1000，將recA序列相似性100%的定為同一基因型并從中隨機選取一株菌株作為代表菌株進行后續(xù)分析[9]。

1.5 16S rRNA基因、持家基因(recA,atpD,glnII)、固氮基因nifH系統(tǒng)發(fā)育分析

代表菌株的16S rRNA基因 PCR擴增引物和反應體系(50 μL)及條件參見文獻[10]。持家基因(atpD,glnII)、固氮基因nifHPCR擴增引物，反應體系及條件參照文獻[11]。將測序得到的基因序列，用MEGA5.1軟件將測得的16S rRNA、nifH序列分別與其參比序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。同時，將得到的代表菌株的recA、atpD、glnII的順序依次進行剪切拼接處理，然后用多位點基因序列分析(MLSA)構建系統(tǒng)發(fā)育樹進行菌株的分類鑒定[12-13]。

1.6 高效共生固氮根瘤菌的篩選

挑選大小均勻且表皮完整的花生種子，表面消毒后置于0.6%的無菌水瓊脂板上避光萌發(fā)3d左右，待主根長到2 cm左右時種植到盛有滅菌蛭石的雙層缽中。將待測菌株同時活化，用TY液體培養(yǎng)基28℃，180 rpm搖床震蕩培養(yǎng)2～3d，測定菌液OD600=0.8～1.0。然后將1 mL的代表菌株菌液接種于幼苗根部，同時以不接菌液只接種1mL的TY培養(yǎng)基作為對照，每個處理設置5個重復。將所有處理全部隨機置于溫室內培養(yǎng)，溫室溫度為26℃，光照時間16 h/d，5～7d補充一次無菌水。培養(yǎng)至25d左右時用葉綠素計SPAD-502 Plus測量花生葉片葉綠素含量并做好記錄。培養(yǎng)至35d收獲，測量統(tǒng)計各處理花生植株的地上部株高、鮮重、根瘤重及根瘤固氮酶活性。采用乙炔還原法測定花生根瘤固氮酶活性，測出乙烯成分，經過固氮酶活性的換算公式，以每克根瘤產生的乙烯(mmol)量為固氮酶活性衡量指標[14]。

2 結果與分析

2.1recA基因型分群結果

將供試菌株recA測序結果同參比菌株序列進行聚類分析構建系統(tǒng)進化樹并隨機選取一株作為代表菌株進行后續(xù)實驗。由于菌株數(shù)量較大，故將數(shù)據(jù)分析結果整理于表1中。如表1所示，分離得到106株供試菌株初步分為7個recA基因型，其中基因型I有90株根瘤菌，較其他類群菌株數(shù)量具有明顯優(yōu)勢。

表1 供試菌株recA基因系統(tǒng)發(fā)育分析結果

2.2 代表菌株 16S rRNA 基因建樹分析

將測序得到的7株代表菌株的16S rRNA序列在NCBI上BLAST進行序列比對并用Sequin 軟件將序列提交至GenBank得到代表菌株的序列號。采用鄰接法與參比菌株一起構建16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。

由圖1可以看出，7株代表菌株均屬于慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)。其中YIC60756、YIC60933、YIC61000、YIC61059、YIC60767具有相同的序列，與參比菌株B.liaoningenseUSDA 3622T的16S rRNA基因序列相似性為100%。而代表菌株YIC60838與B.yuanmingenseCCBAU10071T親緣關系最近，相似性為99.8%。在另一分支的代表菌株YIC60881的16SrRNA基因序列與參比菌株B.manausenseBR3351T聚在一起，相似性為99.9%。

圖 1 7株代表菌株16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA genesequences showing diversity of the 7 representative isolates注：7株代表菌株為黑色加粗字體，菌株GenBank序列號在括號中給出。Note: Representative strains indicated with black bold. The accession numbers in GenBank areindicated after the bacterial names.

2.3 持家基因(recA、atpD、glnII)的系統(tǒng)發(fā)育分析結果

先前研究表明，持家基因的MLSA分析能有效確定根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育地位[15]，因此本研究對7株代表菌株的持家基因(recA、atpD和glnII)序列依次拼接并構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。以相似性97%作為定種標準[16]，分析表明有5株代表菌株YIC61000、YIC61059、YIC60756、YIC60933、YIC60767相似性較高(97.3%～99.7%)，在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一支，與參比菌株B.liaoningenseUSDA3622T相似性為97.9%～98.7%，故將這5株代表菌株歸為B.liaoningense種群，為所分離菌株的優(yōu)勢種群。YIC60838與參比菌株B.yuanmingenseCCBAU 10071T相似性最高為98.5%，將其歸于B.yuanmingense種群。YIC60881與其他參比菌株相似性均低于97%，故將其命名為Bradyrhizobiumsp.YIC60881。

對所有分離到的根瘤菌菌株統(tǒng)計分析表明，B.liaoningense為山東省花生研究所萊西試驗站所分離菌株的絕對優(yōu)勢種群，占所分離菌株的98.1%，這與之前研究報道中B.liaoningense是山東省花生根瘤菌的優(yōu)勢菌群的結果一致[17]。

圖 2 持家基因recA-atpD-glnⅡ拼接后的MLSA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of concatenated sequences of recA, atpD and glnII

2.4 固氮基因nifH的系統(tǒng)發(fā)育分析

固氮基因nifH對于根瘤菌與豆科植物的固氮至關重要，本實驗通過對慢生根瘤菌屬的7株代表菌株的nifH基因進行PCR擴增測序，然后采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹并分析計算與參比菌株的相似性。

如圖3所示，7株代表菌株的nifH基因聚類形成2個不同分支，與16S rRNA、持家基因的系統(tǒng)發(fā)育結果存在一定差異。YIC60756、YIC60767、YIC60838、YIC61059、YIC61000與B.yuanmingenseCCBAU 10071T聚在一起，序列相似性為100%，說明nifH在同一根瘤菌種內不同基因型中高度保守。YIC60881與B.arachidisCCBAU 051107T聚在一起，序列相似性為100%，而YIC60933與參比菌株B.arachidisCCBAU 051107T親緣關系最近，序列相似性為97.8%。

2.5 高效共生固氮菌株篩選

植物葉片葉綠素含量能夠定量反映出葉片氮含量水平，由表2可以看出，與對照組相比，接種YIC60933的花生葉片葉綠素含量雖然低于對照組但無顯著差異，而其他實驗組葉片葉綠素含量均有不同幅度增長。除接種YIC60756的實驗組株高低于對照組外，其余植株高度均高于對照組。植株地上部位鮮重和干重可以直觀反映花生生長發(fā)育期間的氮素積累情況，本研究中不同接菌處理的花生鮮重和干重均有不同程度增加，其中YIC60756、YIC61000、YIC61059的地上鮮重增長最為明顯，增幅均在38.7%以上。地上部干重的結果與鮮重基本一致，但差異不顯著。

圖 3 7株慢生根瘤菌代表菌株nifH基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 3 Phylogenetic tree of the 7 representative isolates and the reference strains based on nifH gene

菌株Strain葉綠素含量ChlorophyIIcontent株高Plantheight(cm)植株鮮重Freshshootweight(g)植株干重Dryshootweight(g)根瘤鮮重Nodulefreshweight(g)固氮酶活性ARA/TNFW(mmol·g-1·h-1)YIC6076746.28±2.8231.00±1.6312.47±2.54b*6.12±0.420.30±0.023.55±0.13YIC6075647.52±1.27a*26.67±3.4013.79±0.89b*6.15±0.780.23±0.034.43±0.21YIC6083846.82±2.15a*32.07±2.8212.97±3.47b*6.13±0.620.45±0.013.41±0.04YIC6105948.78±1.43a*29.20±3.5413.30±1.73b*6.01±0.090.24±0.026.95±0.15YIC6100043.42±0.8732.60±2.2413.72±1.32b*6.36±0.680.35±0.012.44±0.24YIC6088148.34±1.16a*32.67±1.8910.65±2.256.26±0.990.48±0.042.65±0.13YIC6093340.97±0.5833.60±2.4211.63±2.895.55±0.590.46±0.012.63±0.17CK43.30±1.4128.33±3.689.59±1.105.53±0.64 0 0

注：CK：對照；a*，b*：與對照組相比葉綠素含量和植株鮮重的T檢驗達到顯著水平(p<0.05)；ARA：乙炔還原法；TNFW：全部根瘤的鮮重；ARA/TNFW：固氮酶活性，以每克根瘤每小時產生的乙烯量(mmol)為衡量指標。*表示在0.05水平差異顯著。

Note: CK, control; a*, b* indicate a significant increase in chlorophyll content plant and fresh shoot weight, respectively, according to t-test (p<0.05); ARA: Acetylene reduction assay; TNFW: the total nodule fresh weight; ARA/TNFW: It represents relative nitrogenase enzyme activity, mmol C2H4/(h·g nodule).

如表2所示，接種YIC60838、YIC60881和YIC60933的花生所結根瘤量最大。同時測定出固氮酶活性最高的3株接種菌株依次為YIC61059、YIC60756和YIC60767。對比發(fā)現(xiàn)，結瘤數(shù)最多的3株菌株并非固氮酶活性最高，因此，花生結瘤數(shù)量的多少不一定代表所結根瘤固氮能力的強弱?；ㄉ咝Ч采痰鼍暮Y選應考慮花生生長指標和固氮能力各方面的因素，然后對菌株的促生效果做出綜合評價。

3 討 論

本研究采用持家基因recA聚類分析選取代表菌株、持家基因(atpD、recA和glnII)和固氮基因(nifH)系統(tǒng)發(fā)育分析等方法對分離自萊西地區(qū)的106株花生根瘤菌進行遺傳多樣性研究。持家基因recA聚類分析結果表明，萊西花生根瘤菌種群多樣性較為豐富，106株待測菌株均分布于根瘤菌的Bradyrhizobium屬中，共分為7個recA基因型，其中B.liaoningense分布范圍最廣、菌株數(shù)最多，為萊西市花生根瘤菌的優(yōu)勢種群，占分離菌株的98.1%。

結合16S rRNA基因序列和持家基因系統(tǒng)發(fā)育分析結果可以看出，7株代表菌株均屬于Bradyrhizobium。其中代表菌株YIC60881的持家基因序列與親緣關系最近的菌株相似性小于95%，故推測其有可能是新的種群，命名為Bradyrhizobiumsp.YIC60881。這還需要進一步的實驗分析確認其分類地位。同時研究發(fā)現(xiàn)16S rRNA基因與持家基因的MLSA分析結果在屬的水平上具有較好的一致性，但代表菌株YIC60881的聚類結果存在一些差異。YIC60881的16S rRNA基因序列與參比菌株B.cytisiCTAW11T聚群，相似性為99.6%，但在多位點序列分析結果中，其與參比菌株B.cytisiCTAW11T遺傳距離較遠，相似性僅90.9%。這種屬內種間系統(tǒng)發(fā)育上的差異，表明屬內種間存在廣泛的基因交流。造成這種差異原因可能是由于16S rRNA基因序列高度保守不能有效區(qū)分不同種的根瘤菌，而MLSA在 97%相似性水平上能夠有效確定根瘤菌的具體分類地位[18-19]。

固氮基因nifH編碼固氮酶，它不僅與根瘤菌的固氮功能相關，同時也是植物與固氮微生物建立共生關系過程中必不可少的基因[20]。本研究發(fā)現(xiàn)相同菌株的16S rRNA基因與固氮基因在系統(tǒng)發(fā)育中存在明顯差異的現(xiàn)象，如YIC60756、YIC61000、YIC61059、YIC60767與參比菌株B.liaoningenseUSDA 3622T的16S rRNA基因序列相似性為100%，而在固氮基因nifH的系統(tǒng)發(fā)育分析中這4株代表菌株則與B.yuanmingenseCCBAU 10071T親緣關系最近并聚為一支，相似性為100%。雖然它們之間序列高度同源，但固氮基因nifH的系統(tǒng)發(fā)育表明花生根瘤菌種間可能存在水平基因轉移。在先前的報道中就有關于固氮基因經過水平轉移到其他的共生細菌中的研究，Barcellos等人研究表明B.japonicum的共生基因能夠在宿主根瘤中轉移給它的伴生菌[21]。Sullivan等人發(fā)現(xiàn)非共生根瘤菌也有可能通過接受共生基因而轉化成共生菌株[22]。因此相同菌株的16S rRNA基因與共生基因在系統(tǒng)發(fā)育中的差異可能是根瘤菌為適應不同地理環(huán)境和宿主通過水平基因轉移而產生了共生基因的遺傳多樣性。

根瘤菌與豆科植物形成的共生固氮體系，能固定空氣中大量的氮氣轉化為氨供植物生長。高效共生固氮根瘤菌的應用能夠降低花生種植成本，減輕化肥對環(huán)境和土壤的危害，對發(fā)展生態(tài)農業(yè)具有重要意義。本研究通過對分離自萊西地區(qū)的7株花生慢生根瘤菌代表菌株進行回接宿主和溫室培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)均能與原宿主花生有效結瘤，這與先前國內的研究結果一致[23-26]。其中代表菌株YIC61059表現(xiàn)出較好的固氮促生效果，葉綠素含量、地上部位干重分別提高12.66%、8.68%。本研究為高效花生根瘤菌劑的篩選提供了優(yōu)質的種質資源，利用YIC61059生產成為可利用的高效花生根瘤菌劑還需要進一步小區(qū)及大田試驗的應用效果研究。

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Genetic Diversity of the Rhizobia and Screening of Effective Rhizobia Strains Isolated fromArachishypogaeaL. in Laixi County

WU Hai-long1,2, LI Yan1, CHEN Ming-na3, LIU Wei1, REN Cheng-gang1, YANG Jin-bao1,4, XIE Zhi-hong1*, YU Shan-lin3*

(1.YantaiInstituteofCoastalZoneResearch,ChineseAcademyofSciences,Yantai264003,China; 2.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China; 3.ShandongPeanutResearchInstitute,Qingdao266100,China; 4.ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

To reveal the genetic diversity of rhizobia isolated from breeding base of Shandong Peanut Research Institute (SPRI) and screen effective nitrogen-fixing bacteria strains, peanut rhizobia were collected and isolated from 5 separate samples in peanut breeding base, and all the isolates were selected to determine their phylogenetic relationship through analyses of the 16S rRNA gene, housekeeping genes (recA,atpDandglnII) and symbiotic genes (nifH). The growth-promoting efficiency was tested by plant inoculation assay on peanut in greenhouse. A total of 106 peanut rhizobium strains were isolated from 5 sampling sites. Through the phylogenetic analyses based onrecAsequences, all the isolates were classified to 7recAgenotypes, and 7 strains were selected as representative strains. The results of 16S rRNA and housekeeping gene MLSA phylogenetic analysis showed that all isolated strains belong toBradyrhizobium. Phylogeny analysis ofnifHshowed that the nitrogen-fixing genes is highly conserved. All the 7nifHsequences were subdivided to clade which related toB.arachidisCCBAU 051107TandB.yuanmingenseCCBAU 10071Trespectively, and thus indicated that horizontal gene transfer may existed among different peanut rhizobia species. Greenhouse experiments showed that 7 representative isolates were effective on symbiotic nitrogen fixation, among which YIC61059 showed the strongest symbiotic nitrogen-fixing capacity. It was found that severe genetic diversity existed in peanut rhizobia from Laixi Experimental Base of SPRI, whichBradyrhizobiumliaoningenseis the dominant species. Peanut rhizobia in this region showed perfect nodulation and symbiotic nitrogen fixation ability, one of the representative strains YIC61059 possessed prominent growth-promoting effect on peanut growth, and it has good prospects of application.

peanut; rhizobia; genetic diversity; high-efficient growth-promoting isolates

10.14001/j.issn.1002-4093.2016.02.001

2016-03-16

中科院重點部署項目(KZZD-EW-14)；煙臺市科技發(fā)展計劃(2013JH021)；中科院百人計劃項目；國家自然科學基金(31370108，31570063)；山東省自主創(chuàng)新及成果轉化專項(2014ZZCX07303)

吳海龍(1990-)，男，山東濟寧人，碩士研究生，主要從事農業(yè)微生物方面研究。

*通訊作者：解志紅(1976-)，女，研究員，博士，主要從事根瘤菌與植物互作關系研究。E-mail: zhxie@yic.ac.cn

S565.2; Q939.11+4

A

禹山林(1956-)，男，研究員，博士，主要從事花生遺傳育種研究。E-mail: yshanlin1956@163.com