病毒對(duì)蘋果香氣成分影響的探究

□ 鞠佳玥　趙玉靜　煙臺(tái)大學(xué)

病毒對(duì)蘋果香氣成分影響的探究

□ 鞠佳玥趙玉靜煙臺(tái)大學(xué)

以脫毒蘋果和未脫毒蘋果為原料，采用HS-SPME技術(shù)萃取蘋果中的香氣成分，GC-MS技術(shù)測(cè)定蘋果中的香氣成分，通過(guò)比較脫毒蘋果與未脫毒蘋果香氣成分的含量和種類的差異，找出脫毒蘋果的特征香氣，得出病毒侵染對(duì)蘋果香氣成分的影響。經(jīng)研究，脫毒蘋果香氣成分主要有酯類、醇類、酸類、醛類、酰胺類、烯類和其他類化合物，未脫毒蘋果的香氣成分主要是酸類、酯類和醇類和烯類和其他類化合物。脫毒蘋果特有的香氣成分為：丙酸芳樟酯、乙酸異戊酯、苯甲酸乙酯、癸酸乙酯、1,2－苯二甲酸二酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯、月桂醇、正己醇、十一醇、丁二醇、2－甲基－2－丁醇、6－甲基－3－庚醇、4－甲基甘露醇、雪松醇、3－酞酰亞氨甲基苯甲酸、碳酸等。病毒侵染使得蘋果的香氣物質(zhì)種類減少，含量下降。

脫毒蘋果 未脫毒蘋果 香氣成分

1　蘋果的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及社會(huì)地位

蘋果為薔薇科落葉喬木，是世界上種植面積最廣的一種果樹，我國(guó)蘋果的種植面積和產(chǎn)量都居世界第一。蘋果果實(shí)含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如糖分、膳食纖維、鈣、鐵、維生素C、維生素B1、維生素B2等30多種人體所需物質(zhì)[1]。

2　蘋果病毒概述及目前的預(yù)防研究

蘋果病毒在我國(guó)廣泛發(fā)生，已成為限制我國(guó)蘋果優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的關(guān)鍵因素[1]。目前已在我國(guó)發(fā)現(xiàn)并鑒定的蘋果病毒有：蘋果花葉病毒(Apple mosaic virus,ApMV)、蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)、蘋果凹果類病毒(Apple dimple fruit viroid,ADFVd)[2]，蘋果一旦感染上病毒就很難治愈。由于蘋果病毒是通過(guò)嫁接傳染，無(wú)傳毒介體，所以栽培無(wú)毒苗木是防治的主要途徑[3]，蘋果病毒的危害日益受到栽培者的重視[4]。針對(duì)這種情況，近年來(lái)，宋來(lái)慶、李元軍、趙玲玲等人[5]采用熱處理的方法培育出脫毒“煙富3號(hào)”蘋果苗木，成為近年來(lái)最暢銷的蘋果苗木之一。但大眾無(wú)法區(qū)分脫毒蘋果與非脫毒蘋果，容易造成兩種蘋果的混淆。目前，科學(xué)工作者通過(guò)對(duì)其多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)來(lái)區(qū)分，但操作復(fù)雜，涉及的步驟較多，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)龐大，處理數(shù)據(jù)消耗時(shí)間較長(zhǎng)，不僅浪費(fèi)資金，而且緩慢的檢測(cè)速度不能滿足廣大市場(chǎng)對(duì)蘋果的需求。

3　蘋果香氣成分探究的目的及意義

果實(shí)香氣是反映果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，研究蘋果香氣物質(zhì)對(duì)提高蘋果品質(zhì)、進(jìn)行優(yōu)選育種及其深加工具有重要意義。果實(shí)香氣源于某些揮發(fā)性物質(zhì)，目前，蘋果香氣中已鑒定出350多種成分，但只有含量超過(guò)其味感閾值的物質(zhì)成分才會(huì)對(duì)果實(shí)風(fēng)味的形成起重要作用，同一個(gè)果實(shí)的不同部位，致香物質(zhì)的含量也有差異[6]。本次探究主要針對(duì)病毒對(duì)蘋果果實(shí)及其葉子揮發(fā)性成分的影響，通過(guò)比較脫毒蘋果與非脫毒蘋果香氣成分種類和含量的差別，找出脫毒蘋果具有的特征香氣成分，將其轉(zhuǎn)化為一項(xiàng)或簡(jiǎn)單的幾項(xiàng)指標(biāo)，通過(guò)該特征香氣來(lái)判斷樣品蘋果是“脫毒蘋果”還是非脫毒蘋果，為蘋果的病毒檢測(cè)提供一種新手段。

4　研究方法

4.1頂空固相微萃取（HS-SPME）

頂空固相微萃取是一種無(wú)溶劑萃取技術(shù)，它集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，具有簡(jiǎn)單、快速、高效、無(wú)污染、便攜、靈敏度高[7]、易于與其他儀器聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于揮發(fā)性成分分析[8]。該方法優(yōu)化了分析條件，建立了快速測(cè)定香氣物質(zhì)的方法，在常見(jiàn)香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，對(duì)常見(jiàn)香氣物質(zhì)的定量比較準(zhǔn)確[9]?？煽焖贆z測(cè)出蘋果所含的幾百種香氣成分，具有高效、便捷、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

4.2 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)

色譜法一般是由固定相和流動(dòng)相組成。氣相色譜法的流動(dòng)相是氣體，因此要求樣品應(yīng)在色譜柱內(nèi)轉(zhuǎn)化成氣體。根據(jù)分配系數(shù)的差異，使樣品在固定相與氣相之間分離。通過(guò)峰的形狀、大小對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析，通過(guò)保留時(shí)間、峰面積、內(nèi)標(biāo)物的峰面積及濃度來(lái)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。質(zhì)譜法是利用電磁學(xué)、質(zhì)核比(m/z)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離分析的一種方式。采用SPME與GC-MS結(jié)合，對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定分析，并優(yōu)化了SPME條件，為進(jìn)一步研究揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量提供理論和數(shù)據(jù)支持[10]。此方法可以快速處理大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，找出脫毒蘋果和非脫毒蘋果的香氣成分區(qū)別。

5　實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

5.1實(shí)驗(yàn)儀器

GC-MS-2010q氣質(zhì)聯(lián)用儀：日本島津公司；SPME纖維萃取頭CAR/DVB/PDMS（50μm/30μm）：美國(guó)Supelco公司；SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄：美國(guó)Supelco公司；DB-Wax色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）：美國(guó)Agilent公司；DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；分析天平：福州華志科學(xué)儀器有限公司；微量進(jìn)樣器（10μL）：上海市安亭微量進(jìn)樣器廠；移液管：5mL、10mL。

5.2實(shí)驗(yàn)樣品和試劑

喬納金蘋果葉、嘎啦蘋果葉：煙臺(tái)市棲霞蘋果園采摘；脫毒蘋果葉：煙臺(tái)農(nóng)科院提供；NaCl（分析純）：上海國(guó)藥集團(tuán)；3-辛醇（色譜純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

6　實(shí)驗(yàn)方法

6.1樣品預(yù)處理

將已采集的嘎啦、喬納金及脫毒蘋果的蘋果葉進(jìn)行剪碎，并放入研缽中研碎。利用分析天平稱量，每組等分后做2份樣品（約0.5g/份），將已分好的樣品放入保鮮膜中密封保存，并貼好標(biāo)簽備用，依次為1～6號(hào)。

6.2萃取條件的設(shè)定

在之前實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上對(duì)萃取的條件進(jìn)行設(shè)定[11]。

萃取時(shí)間5min，萃取溫度50℃，預(yù)平衡時(shí)間5min，解析時(shí)間5min。

6.3GC-MS條件的設(shè)定

在之前實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上對(duì)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的參數(shù)進(jìn)行設(shè)定[12]。

GC條件：色譜柱為DB-Wax（30m×0.25mm× 0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：230℃；檢測(cè)器溫度230℃；載氣：He；流速：3mL/min；分流比為50.0。

升溫程序：初始溫度（起始柱溫）40℃，保持2min，后以6℃/min的速度升溫至100℃，再以5℃/min的速度升溫至200℃，最后再以10℃/min的速度升到230℃，保持5min。

MS條件：EI電離源；電子能量70eV；離子源溫度200℃；接口溫度230℃；掃描范圍m/z 30～500。

6.4實(shí)驗(yàn)步驟

①將已預(yù)處理好的樣品1號(hào)喬納金蘋果葉加入到15mL棕色萃取瓶（內(nèi)含轉(zhuǎn)子）中，利用5mL移液管取4mL氯化鈉飽和溶液加入，再利用10μL的微量進(jìn)樣器取3-辛醇加入（3-辛醇濃度為101mg/L）。

②將15mL棕色萃取瓶放入恒溫加熱磁力攪拌器中，設(shè)定萃取溫度50℃，預(yù)平衡時(shí)間5min并采用秒表計(jì)時(shí)，然后先將涂有PDMS涂層的纖維萃取頭調(diào)到2cm刻度處，插入到萃取瓶后再將黑柄推下進(jìn)行萃取，注意針頭不要接觸液面，采用秒表計(jì)時(shí)5min。

③萃取完畢后，先將黑柄往上提再將纖維萃取頭拔出，并調(diào)至2.6cm刻度處，待氣質(zhì)聯(lián)用儀的電腦顯示綠色Ready，則進(jìn)針于GC-MS中，再按start鍵開(kāi)始測(cè)定，解析時(shí)間5min后將針提出，運(yùn)行時(shí)間40min。

④樣品2～6號(hào)重復(fù)上述步驟進(jìn)行測(cè)定。

⑤將各個(gè)樣品的總離子流色譜圖和揮發(fā)性成分種類圖的數(shù)據(jù)進(jìn)行完善并保存。

6.5揮發(fā)性成分的定量計(jì)算方法

采用內(nèi)標(biāo)物（本實(shí)驗(yàn)為3-辛醇）計(jì)算出各個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量，計(jì)算公式為：

7　結(jié)果與討論

脫毒葉子與不脫毒葉子最大的揮發(fā)性成分差異為：醛類物質(zhì)所占的比重遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)普通葉子為20%以上，而普通葉子醛類的比重均在10%以下，這可能與通過(guò)一定手段對(duì)蘋果樹脫毒有關(guān)；脫毒葉子酯類、醇類和醛類所占比重均在20%左右，為揮發(fā)性成分的主要種類；酸類物質(zhì)所占的比重較普通葉子略高；肼類物質(zhì)略有下降，低于普通葉子；脫毒葉子出現(xiàn)苯類物質(zhì)，占2%左右。對(duì)于喬納金、嘎啦及脫毒蘋果葉這3種品種中所檢測(cè)出來(lái)的揮發(fā)性成分的主要物質(zhì)來(lái)看，有約10種物質(zhì)在脫毒葉子中未檢測(cè)到。

圖1　不同種類蘋果葉揮發(fā)性成分所占比重

8　結(jié)論

對(duì)于喬納金、嘎啦及脫毒蘋果葉這3種樣品，經(jīng)HSSPME萃取后再經(jīng)GC-MS方法分析確定了其主要揮發(fā)性成分，并采用峰面積歸一化法比較脫毒與不脫毒葉子之間的差異，對(duì)于監(jiān)控蘋果的健康狀況、提高或改善蘋果的品相品質(zhì)具有重要意義。

從各種類的香氣成分所占比重來(lái)分析，脫毒葉子中醛類物質(zhì)所占的比重遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)普通葉子為20%以上，而普通葉子醛類的比重均在10%以下；脫毒葉子揮發(fā)性成分主要種類為酯類、醇類和醛類，所占比重均在20%左右；酸類物質(zhì)所占的比重較普通葉子略高；肼類物質(zhì)略有下降，低于普通葉子；脫毒葉子出現(xiàn)苯類物質(zhì)，占2%左右。

從具體的揮發(fā)性物質(zhì)來(lái)分析，喬納金與嘎啦蘋果葉中所共有的十種成分在脫毒蘋果葉中未檢出，為6-甲基3-庚醇、3-辛烯-1-醇、氨基草酰肼、1,1-二甲基乙基肼、5-甲基-2-（1-甲基乙基）反式環(huán)己酮、五氟酸庚酯、乙醇醛二聚體、2-辛醇、5-甲基-2-（1-甲基乙基）-環(huán)己醇。

通過(guò)結(jié)合以上兩種手段，可以建立一種檢測(cè)果樹是否感染病毒的方法和理論體系，對(duì)于檢測(cè)果樹的健康成長(zhǎng)以及指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有積極的作用。

[1]聶繼云,李志霞等.蘋果理化品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012(14):2895～2903.

[2]郝璐，葉婷，陳善義，王少杰，周穎，范在豐，國(guó)立耘，周濤.我國(guó)北方部分蘋果產(chǎn)區(qū)病毒病的發(fā)生與檢測(cè)[J].植物保護(hù)，2015，41（2）：158～161.

[3]程玉琴，韓振海，徐雪峰.蘋果病毒及其脫毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)報(bào)，2003，19（1）：72～5.

[4]項(xiàng)殿芳，宋金耀，劉永軍，薛國(guó)杰，任立兵.脫毒對(duì)蘋果苗木生長(zhǎng)的影響[J].河北農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，8（3）：7～11.

[5]宋來(lái)慶，李元軍，趙玲玲，于青，劉美英，唐巖，孫燕霞，姜中武.脫毒“煙富3號(hào)”蘋果品種的主要特點(diǎn)和栽培管理要點(diǎn)[J].煙臺(tái)果樹，2013，123（3）：26～27.

[6]靳蘭，陳佰鴻，毛娟，王振華，趙鑫.兩個(gè)品種蘋果果皮和果肉中香氣成分的比較[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（6）：149～154.

[7]盧靜茹，林向陽(yáng)，張如，吳佳，戴巧玲，羅登來(lái)，李丹，陳曉燕，黃光偉，Roger RUAN.HS-SPME-GC-MS聯(lián)用分析美國(guó)巴旦木香氣成分[J].食品科學(xué)，2015，36（2）：120～125.

[8]馬錁，谷超，尹君樂(lè)，胡銳清，羅詩(shī)，王澤槐，李建國(guó).“觀音綠”荔枝香氣成分的頂空固相微萃取GC-MS分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36（2）：113～116.

[9]汪立平，徐巖，趙光鰲，陳堅(jiān)，王利平，劉楊岷，李記明.頂空固相微萃取法快速測(cè)定蘋果酒中的香味物質(zhì)[J].無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22（1）：14～20.

[10]楊雪娟，李永歌，許麗娟，劉會(huì)雙.SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析酸水解玉米蛋白粉中的揮發(fā)性物質(zhì)[J].食品科學(xué)，2015，36（4）：176～180.

[11]韓素芳,丁明等.頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定百香果香氣條件的優(yōu)化[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2010(04)：278～284.

[12]王晗光,張健等.氣相色譜-質(zhì)譜法分析巨桉葉的揮發(fā)性化感成分[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006(01):51～54.