胃癌組織中miR-381與PCNA、Cyclin D1、p21表達的關(guān)系及臨床意義

劉凱軍 李茂恒 王文韜 魏娉

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·論著·

胃癌組織中miR-381與PCNA、Cyclin D1、p21表達的關(guān)系及臨床意義

劉凱軍 李茂恒 王文韜 魏娉

目的 檢測微小RNA(miR-381)、增殖細胞核抗原(PCNA)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p21基因在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達，探討miR-381在胃癌組織中表達的情況及臨床意義。方法 實時定量PCR技術(shù)檢測85例胃癌組織、50例癌旁正常組織中miR-381、PCNA、Cyclin D1、p21的表達情況；記錄患者的臨床病理資料。分析miR-381與患者臨床病理特征的關(guān)系；同時分析miR-381與PCNA、Cyclin D1、p21的關(guān)系。結(jié)果 miR-381在胃癌組織中表達低于癌旁組織；PCNA、Cyclin D1的mRNA在胃癌組織中高于癌旁正常組織，而p21基因的表達在胃癌組織中低于癌旁正常組織(P<0.05)。miR-381與胃癌的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與胃癌其他病理特征無明顯關(guān)系(P>0.05)。相關(guān)分析顯示，miR-381與Cyclin D1存在負相關(guān)(r=-0.3864,P<0.05)，與p21存在正相關(guān)(r=0.3223,P<0.05)。結(jié)論 miR-381與胃癌的臨床病理特征有關(guān)，miR-381可能通過調(diào)節(jié)Cyclin D1、p21而參與胃癌的進展。

微小RNA-381；胃癌；臨床病理特征；增殖

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，危害極大[1]。雖然近年來胃癌的發(fā)生率有所下降，但由于該病的癥狀無特異性，因此早期確診者仍然較少；同時胃癌進展轉(zhuǎn)移的機制極其復(fù)雜，目前仍是以手術(shù)聯(lián)合化療為主的綜合治療，這些措施的針對性不佳，因此胃癌的5年生存率一直不足40%[2]。胃癌預(yù)后較差的主要原因在于胃癌細胞具有較強的增殖能力，這種無限制的生長能力使腫瘤生長迅速，且很快發(fā)生局部或遠處轉(zhuǎn)移[3]。因此，如能有效抑制胃癌細胞生長增殖則可能減緩腫瘤生長速度，延長疾病進展時間，甚至可能找到胃癌治療的靶點。但迄今此方面的研究還沒有突破性進展。胃癌細胞增殖侵襲的過程中多種基因參與其中，近年來與胃癌有關(guān)的微小RNA(microRNAs)已引起研究者的關(guān)注。作為一種小分子單鏈RNA，microRNAs對其調(diào)控的把基因具有強大的抑制作用。研究表明，microRNAs在包括胃癌在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮了重要作用[4-7]。微小RNA-381(microRNA-381,miR-381)是microRNAs家族的成員之一，在多種腫瘤中表達下降，對腫瘤細胞的生長侵襲有抑制作用[8-10]。但在胃癌臨床標(biāo)本中miR-381表達情況及其與胃癌患者生物學(xué)特征的關(guān)系還不完全明確。為了解miR-381在胃癌組織中表達的情況及臨床意義，并對其作用機制進行初步分析，本研究檢測了胃癌患者腫瘤組織中miR-381表達情況，分析了miR-381與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系；同時檢測了與胃癌細胞增殖關(guān)系密切的增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p21，對miR-381與這些基因的關(guān)系進行了相關(guān)分析，初步探討了miR-381參與胃癌增殖的作用機制，為尋找胃癌治療新靶點、確定新的腫瘤標(biāo)志物提供了依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年1月至2015年12月在我院外科確診為胃癌并行手術(shù)治療的患者85例為研究對象，所有患者均有完整的病歷資料。男64例，女21例；年齡33～79歲，平均年齡(54.42±8.95)歲；患者均經(jīng)手術(shù)切除原發(fā)腫瘤?；颊呓M織學(xué)分型為中高分化腺癌66例，低分化腺癌19例；按UICC分期，Ⅰ期8例，Ⅱ期15例，Ⅲ期52例，Ⅳ期10例。腫瘤標(biāo)本離體后立即取腫瘤組織1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm置于-80℃保存用于熒光定量PCR檢測。

1.2 主要試劑 miR-381及PCNA、Cyclin D1、p21的PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。熒光定量PCR檢測試劑盒購自美國GeneCopia公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量RT-PCR試劑為美國Promega公司產(chǎn)品。

1.3 熒光定量PCR檢測miR-381及PCNA、Cyclin D1、p21基因mRNA表達 采用Trizol一步法提取總RNA，檢測miR-381按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行，miR-381的引物序列：上游:5'-GTCTATA CAAGGGCAAGCTCTC-3',下游: 5'-ATCCATGACAGATC CCTACCG-3'; U6 snRNA為內(nèi)參照基因。PCR反應(yīng)條件：在95°C變性5 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，78℃ 20 s，共進行40個循環(huán)。檢測miR-381的熒光信號。另取2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，取2 μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測靶基因mRNA表達。各基因引物序列：PCNA上游:5'-TAAGGGCTGAAGATAATGCTGAT-3';下游:5'-CCTGTTCTGGGATTCCAAGTT -3';Cyclin D1上游:5'- CCGTCCATGCGGAAGATC-3';下游: 5'-GTCACACTTGATCACTCTGG -3';p21上游: 5'-CGCGGATCCCCTCTCACCCTAAGGGT-3';下游:5'-CCGCTCGAGCCCTGCACCTCCTCGTC-3';GAPDH上游:5’-GACCCCTTCATTGACCTCAAC -3’， 下游: 5’-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’。按試劑盒說明建立終體積為20 μl 的PCR反應(yīng)體系，2 μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix (Applied Biosystems,Foster City,CA)、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl。PCR熱循環(huán)參數(shù)：95℃ 5 min，然后三步反應(yīng)：94℃變性30 s，60℃退火30 s，進行45個循環(huán)。PCR結(jié)果檢測經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，熒光定量PCR檢測結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行計算。GAPDH作為內(nèi)參照基因。miR-381熒光定量PCR檢測按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 miR-381與PCNA、Cyclin D1、p21的mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達 熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，miR-381在胃癌組織中相對表達強度(0.333±0.085)低于癌旁組織(0.731±0.111)；PCNA、Cyclin D1的mRNA在胃癌組織中表達分別為(1.206±0.185)、(0.884±0.194)，均高于癌旁正常組織(0.403±0.086)、(0.386±0.088)，而p21基因的表達在胃癌組織中(0.376±0.092)則低于癌旁正常組織(0.778±0.112)(P<0.05)。見表1，圖1。

組別miR-381PCNACyclinD1p21胃癌組織(n=85)0.333±0.0851.206±0.1850.884±0.1940.376±0.092癌旁組織(n=50)0.731±0.1110.403±0.0860.386±0.0880.778±0.112t值-23.40628.87917.125-22.593P值<0.001<0.001<0.001<0.001

2.2 miR-381表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果顯示，miR-381與胃癌的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)血管侵犯情況、遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與胃癌其他病理特征無明顯關(guān)系(P>0.05)。在分化好的胃癌組織中miR-381相對表達強度為(0.349±0.084)，在分化差的胃癌組織中為(0.279±0.063)；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的胃癌組織中miR-381相對表達強度為(0.354±0.088)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的胃癌組織中為(0.275±0.035)；存在神經(jīng)血管侵犯的胃癌組織中miR-381相對表達強度為(0.358±0.095)，在無神經(jīng)血管侵犯的胃癌組織中為(0.320±0.076)；有遠處轉(zhuǎn)移的胃癌組織中miR-381相對表達強度為(0.385±0.099)，在無遠處轉(zhuǎn)移的胃癌組織中為(0.326±0.081)(P<0.05)。男性的胃癌組織中miR-381相對表達強度為(0.329±0.090)，在女性的胃癌組織中為(0.346±0.065)；在≥60歲患者的胃癌組織中miR-381相對表達強度為(0.337±0.082)，在<60歲患者的胃癌組織中為(0.332±0.086)；在腫瘤≥5 cm患者的胃癌組織中miR-381相對表達強度為(0.330±0.091)，在<5 cm患者的胃癌組織中為(0.338±0.074)；在腫瘤局限于漿膜內(nèi)的胃癌組織中miR-381相對表達強度為(0.338±0.090)，在腫瘤侵犯漿膜外患者的胃癌組織中為(0.331±0.082)；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期的胃癌組織中miR-381相對表達強度為(0.334±0.083)，在Ⅲ～Ⅳ期患者的胃癌組織中為(0.333±0.086)(P>0.05)。見表2。

圖1 miR-381、PCNA、Cyclin D1、p21的mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達。A: 熒光定量RT-PCR擴增曲線圖; B: miR-381、PCNA、Cyclin D1、p21的mRNA表達量的直方圖，與胃癌組織相比，*P<0.05

2.3 miR-381與PCNA、Cyclin D1、p21的mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的相關(guān)關(guān)系 相關(guān)分析顯示，miR-381與Cyclin D1存在負相關(guān)(r=-0.3864，P<0.01)，與p21存在正相關(guān)(r=0.3223，P=0.003)；Cyclin D1與p21存在負相關(guān)(r=-0.4017，P<0.001)。其他分子間未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性(P>0.05)。

3 討論

我國是胃癌高發(fā)區(qū)，胃癌的發(fā)生率和死亡率一直處于各種惡性腫瘤的前列[11]。近年來由于社會進步和生活水平的提高，胃癌在我國的發(fā)生率已有所下降。但由于胃癌患者沒有特異性的臨床表現(xiàn)且癥狀一般較輕，往往就診較晚，就診時患者已處于進展期甚至已出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。目前我國早期胃癌的檢出率不足10%[2]，大多數(shù)患者在就診時已失去了根治機會。胃癌的治療是以手術(shù)為主、聯(lián)合化療，有時聯(lián)合放療、生物治療等措施在內(nèi)的綜合治療，這些治療手段由于效果并不理想，進展期胃癌5年生存率一直不足40%。當(dāng)前胃癌治療措施中靶向治療雖然已在臨床開展應(yīng)用，但效果也不夠理想。因此，闡明胃癌進展機制、確定調(diào)控胃癌進展的主要分子具有重要意義。這已經(jīng)是近來胃癌研究的熱點。在本領(lǐng)域的研究中，微小RNA(microRNAs)是非編碼的單鏈RNA分子，一般為22個堿基，主要參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。microRNAs對其靶基因的表達具有強大的調(diào)控功能，可以直接抑制多個靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達[12,13]。在胃癌研究中，已發(fā)現(xiàn)miR-9、miR-421、miR-21、miR-27a、miR-135等均參與了胃癌的發(fā)生和進展，發(fā)揮了重要作用。本研究中的miR-381也是microRNAs的成員之一，研究表明miR-381與多種疾病有關(guān)。在生理狀態(tài)下，研究發(fā)現(xiàn)miR-381與細胞的增殖及分化有關(guān)。Shi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-381可以促進神經(jīng)干細胞的增殖和分化，在神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細胞的過程中發(fā)揮了重要作用。研究還證實，miR-381與多種腫瘤有關(guān)。Ming等[15]研究顯示，miR-381可以通過抑制C/EBPα依賴性的Cx43表達而參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。Liang等[16]研究證實，miR-381可以通過參與p53/PTTG1通路而參與垂體腫瘤的發(fā)生并有可能成為治療的靶點。還有研究表明，胃癌的印戒細胞癌和管狀腺癌中miR-381表達存在明顯差異，與胃癌的組織學(xué)類型有關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中miR-381表達比癌旁組織明顯降低，提示miR-381缺失可能是導(dǎo)致胃癌發(fā)生進展的重要因素。分析miR-381與胃癌患者的病理特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-381在分化差的腫瘤中表達降低，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤中表達下降，這些都說明miR-381可能是影響胃癌分化及轉(zhuǎn)移的重要因素。研究還顯示miR-381與其他的臨床病理特征關(guān)系不明顯，提示胃癌的進展轉(zhuǎn)移是多因素、多步驟的過程，miR-381可能只參與了其中的部分過程，具體的機制還有待深入研究。

指標(biāo)miR-381表達情況t值P值性別 男(n=64)0.329±0.090-0.8000.427 女(n=21)0.346±0.065年齡(歲) ≥60(n=20)0.337±0.0820.2300.819 <60(n=65)0.332±0.086腫瘤直徑(cm) ≥5(n=53)0.330±0.091-0.4200.675 <5(n=32)0.338±0.074腫瘤浸潤深度 漿膜內(nèi)(n=28)0.338±0.0900.3580.721 漿膜外(n=57)0.331±0.082臨床分期 Ⅰ～Ⅱ期(n=23)0.334±0.0830.0480.962 Ⅲ～Ⅳ期(n=62)0.333±0.086分化程度 分化好(n=66)0.349±0.0843.3640.001 分化差(n=19)0.279±0.063淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陽性(n=62)0.354±0.0884.172<0.001 陰性(n=23)0.275±0.035神經(jīng)血管侵犯 陽性(n=29)0.358±0.0952.0040.048 陰性(n=56)0.320±0.076遠處轉(zhuǎn)移 有(n=10)0.385±0.0992.1080.038 無(n=75)0.326±0.081

為探討miR-381參與胃癌細胞增殖的機制，本研究還檢測了增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p21的mRNA表達水平。PCNA是一種細胞核內(nèi)存在的蛋白質(zhì)，參與細胞周期的調(diào)控。PCNA在靜止期表達很少，在S期表達大量增多，其表達程度是評價細胞增殖能力的指標(biāo)。在許多惡性腫瘤中都存在細胞過度增殖的現(xiàn)象，在這一過程中PCNA表達多處于增強狀態(tài)[18]。Cyclin D1是細胞周期蛋白中的一種，是調(diào)節(jié)細胞周期G1期啟動的關(guān)鍵分子，可與周期素依賴激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)結(jié)合，使細胞周期由G1期進入S期。在腫瘤中Cyclin D1表達增高，促進了腫瘤的增殖[19]。p21基因具有明顯的抑癌作用，該基因可以通過抑制CDKs復(fù)合物活性而抑制細胞增殖，從而使腫瘤生長速度減緩[20]。本結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-381與Cyclin D1存在負相關(guān)，與p21存在正相關(guān)，提示miR-381可能通過調(diào)控Cyclin D1/CDK4/p21通路而抑制了胃癌細胞的增殖。但具體機制還需要大量的實驗室研究予以驗證。

本研究證實了胃癌細胞中miR-381表達降低，miR-381水平與胃癌細胞分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，且胃癌組織中miR-381與Cyclin D1存在負相關(guān)，與p21存在正相關(guān)。這些結(jié)果提示miR-381參與了胃癌的增殖調(diào)控，并有可能作為新的胃癌治療靶點。但本研究僅對臨床組織進行了檢測，具體的機制也沒有完全闡明，還有待進一步擴大樣本量、進行體外實驗及體內(nèi)研究對miR-381的具體作用進行分析。

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Clinical significance of expressions of miR-381,PCNA,Cyclin D1,p21 in gastric cancer tissues

LIUKaijun,LIMaoheng,WANGWentao,etal.

DepartmentofGeneralSurgery,HandanHospitalofFengfengGroup,Hebei,Handan056002,China

Objective To analyze the clinical significance of expressions of microRNA-381 (miR-381),PCNA,Cyclin D1,p21 in human gastric cancer tissues and adjacent normal tissues,and to explore their correlation.Methods Real time fluorescent quantify RT-PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression levels of miR-381,PCNA,Cyclin D1,p21 in 85 cases of gastric cancer tissues and 50 cases of para-carcinoma normal tissues. The correlation between miR-381and clinicopathological characteristics of patients and the correlation between miR-381 and PCNA,Cyclin D1,p21 were analyzed.Results The expression levels of miR-381 in gastric cancer tissues were significantly lower than those in adjacent normal tissues (P<0.05),however, the expression levels of PCNA,Cyclin D1 mRNA in gastric cancer tissues were significantly higher than those in adjacent normal tissues (P<0.05),but the expression levels of p21 mRNA in gastric cancer tissues were significantly lower than those in adjacent normal tissues (P<0.05). The expressions of miR-381 were closely correlated to the differentiation and lymphatic metastasis of gastric cancer (P<0.05), however, which were not related with the other clinicopathological characteristics of gastric cancer (P>0.05). The correlation analysis showed that the expression of miR-381 was negatively correlated to that of Cyclin D1 (r=-0.3864,P<0.05),however,which was positively correlated to that of p21 (r=0.3223,P<0.05).Conclusion The expression of miR-381 is related with clinicopathological characteristics of gastric cancers,and miR-381 may be involved in the development of gastric cancer by regulating the expressions of Cyclin D1 and p21.

miR-381;gastric cancer; clinicopathological characteristics; proliferation

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.23.004

056002 河北省邯鄲市，峰峰集團邯鄲醫(yī)院普通外科

R 735.2

A

1002-7386(2016)23-3537-04

2016-02-17)