姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

宋永周 童九輝 馬維 關(guān)健 蘇瑞紅 李飛 孫淑芹 王華軍

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·論著·

姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

宋永周 童九輝 馬維 關(guān)健 蘇瑞紅 李飛 孫淑芹 王華軍

目的 通過建立H2O2誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷模型，觀察姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。方法 體外培養(yǎng)SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組(H2O2)、姜黃素低中高劑量劑量組(20、40、80 μmol/L)。姜黃素與軟骨細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入H2O2，24 h后收集細(xì)胞，MTT和流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞增殖能力，測定細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)含量，Real-Time PCR和Western blot法檢測細(xì)胞Nrf2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組軟骨細(xì)胞存活率降低，具有分裂象的S期和G2/M期細(xì)胞明顯減少;SOD、CAT含量降低，MDA含量增加，Nrf2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平下調(diào)。經(jīng)姜黃素預(yù)先處理，軟骨細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞增殖能力恢復(fù)，SOD、CAT含量升高，MDA含量降低，Nrf2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平升高。隨濃度升高變化更明顯。結(jié)論 姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用，可通過增強(qiáng)Nrf2表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

姜黃素；軟骨細(xì)胞；氧化應(yīng)激；Nrf2

骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性關(guān)節(jié)病，以骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)軟骨破壞變性為特征[1]。研究表明，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及發(fā)展與氧化應(yīng)激關(guān)系密切[2]。氧化應(yīng)激主要是活性氧(ROS)的產(chǎn)生和抗氧化酶降解ROS的能力失衡導(dǎo)致的[3]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激的核心轉(zhuǎn)錄因子[4]，Nrf2通過與胞漿蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)以及抗氧化反應(yīng)原件(ARE)相互作用，啟動(dòng)下游解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)作用。姜黃素是一種來源于姜黃的植物多酚，可以抑制細(xì)胞炎性反應(yīng)和氧化損傷[5,6]。同時(shí)Nrf2也是姜黃素作用的重要靶標(biāo)，激活Nrf2是姜黃素藥理作用的重要分子機(jī)制[7,8]。本研究利用H2O2誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激，同時(shí)予以姜黃素干預(yù)，探討姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，為姜黃素治療骨關(guān)節(jié)炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 姜黃素、DMSO購自sigma公司；胰蛋白酶(Sigma公司)，膠原酶NB4(德國Serva公司)，DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司；過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化(SOD)測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)購自浙江四季青公司；Real-Time PCR試劑盒產(chǎn)自日本Takara公司；BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗大鼠Nrf2單克隆抗體購自美國Abcam公司；FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自美國Jackson Immuno Research公司)，Ⅱ型膠原單克隆抗體購自NeoMarker公司。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細(xì)胞的培養(yǎng):參考此前的方法[9]：將新生1周SD大鼠脫頸處死，無菌條件下切取雙側(cè)髖膝關(guān)節(jié)軟骨，放入培養(yǎng)皿，L-DMEM漂洗，用眼科剪將軟骨組織剪碎至1 mm3小塊，再次漂洗。膠原酶NB4(0．3 U/ml) 37℃消化4 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入含10%胎牛血清、雙抗(青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml)的L-DMEM培養(yǎng)基，以1×105/ml接種于培養(yǎng)瓶，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度37℃，飽和濕度，5%CO2)。每2～3天換液1次。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。當(dāng)?shù)怪蔑@微鏡下觀察軟骨細(xì)胞匯合成片長滿大部分培養(yǎng)瓶壁后，傾去培養(yǎng)液，加入0．25胰蛋白酶+0．02%乙二胺四乙酸進(jìn)行傳代培養(yǎng)。甲苯胺藍(lán)染色及SABC法Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。采用2～3代軟骨細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 H2O2及姜黃素處理：實(shí)驗(yàn)分為5組：對(duì)照組，H2O2模型組，姜黃素低、中、高劑量組(20、40、80 μmol/L)。細(xì)胞傳代鋪于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞貼壁后輕吸去培養(yǎng)液，對(duì)照組和模型組使用正常培養(yǎng)液，而低、中、高劑量組分別加入20、40、80 μmol/L的姜黃素培養(yǎng)液培養(yǎng)。48 h后吸去培養(yǎng)液，除對(duì)照組外均用0．1 mmol/L的H2O2進(jìn)行處理，24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 細(xì)胞MTT測定:將所培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞以1×107/L,100 μl接種于96孔板中。24 h后待細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，按上述方法進(jìn)行處理后，每組加入50 μl MTT(5 mg/ml)，5%CO2，37℃孵育4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 200 μl，振蕩10 min后，于酶標(biāo)儀上570 nm處測定每孔細(xì)胞吸光度(A)。細(xì)胞存活率按下列公式計(jì)算：細(xì)胞存活率=用藥組A/正常對(duì)照組A×100%。

1.3.2 SOD、MDA、CAT測定:細(xì)胞經(jīng)處理后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，胰蛋白酶消化，4℃、1 000 r/min離心，4℃超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上破碎細(xì)胞，取裂解液4℃、1 000 r/min離心10 min后取上清檢測。BCA試劑盒定量，按試劑盒說明書進(jìn)行SOD、MDA和CAT含量測定。

1.3.3 測定Nrf2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平:采用Real-time PCR法檢測軟骨細(xì)胞Nrf2的mRNA表達(dá)，目的基因的上游引物為上游5’-TTCCTCTGCTGCCATTAGTCAGTC-3’，下游引物為5'-GCTCTTCCATTTCCGAGTCACTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為215 bp[10]，β-actin作為內(nèi)參基因。收集培養(yǎng)細(xì)胞，抽提總RNA，測定RNA 純度，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈后進(jìn)行PCR，用AB 7500型熒光定量PCR儀，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性3 min,94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 30 s,循環(huán)35次,最后一輪72℃延伸10 min。采用2-ΔΔCT法計(jì)算其表達(dá)量相對(duì)值，目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量以同一反應(yīng)體系中實(shí)驗(yàn)組的熒光定量指數(shù)與對(duì)照組的比值表示。

1.3.4 Nrf2的蛋白表達(dá)水平測定：采用Western blot法檢測。處理過的軟骨細(xì)胞以PBS清洗3次，加入預(yù)冷的裂解緩沖液，超聲至組織完全碎裂，14 000 r/min，在4℃的冰凍環(huán)境下離心后收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，經(jīng)蛋白分離及膜。分別采用封閉一抗(兔抗大鼠Nrf2單克隆抗體)和熒光二抗(FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體)，掃描記錄各條帶的積分光密度值(IOD)。以β-actin作為內(nèi)參照。

1.3.5 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期和增殖指數(shù)測定:5組待測細(xì)胞以胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，后棄上清，以冷PBS清洗細(xì)胞3次，離心去上清。70%預(yù)冷乙醇固定，4℃過夜。離心，棄去乙醇上清，加入預(yù)冷的PBS洗滌，離心棄上清。1 ml冷PBS重懸細(xì)胞，RNase(10 μg/ml)37℃孵育30 min，加入碘化丙啶(PI，50 μg/ml)染色5 min后進(jìn)行檢測。增殖指數(shù)(PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)觀察檢測 倒置顯微鏡下觀察，分離培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞呈圓球形，24～48 h大部分貼壁伸展，72 h大部分貼壁，分裂增殖加快。培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞胞漿豐富，胞核清晰，有1～2個(gè)核仁，約7 d左右匯合成單層鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿底面。經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，細(xì)胞質(zhì)染成淺藍(lán)色，細(xì)胞核染成深藍(lán)色，清晰可見1～2個(gè)核仁。Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色，胞漿被染成棕黃色，細(xì)胞相互接觸少的地方棕色較淡，細(xì)胞密集生長的地方棕色較深，并且細(xì)胞外也可見到棕色。說明在培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中有Ⅱ型膠原表達(dá)說明培養(yǎng)的細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞的特征[9]。見圖1。

第二代軟骨細(xì)胞形態(tài)(倒置顯微鏡×100)甲苯胺藍(lán)染色×200Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性×200

圖1 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)觀察

2.2 姜黃素對(duì)H2O2損傷的軟骨細(xì)胞存活率的影響 模型組與對(duì)照組比較，軟骨細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)，經(jīng)用姜黃素中、高劑量預(yù)先處理后，與模型組比較，明顯提高了軟骨細(xì)胞的存活率(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.3 姜黃素對(duì)H2O2損傷的軟骨細(xì)胞SOD、MDA、CAT的影響 H2O2模型組與對(duì)照組比較，SOD、CAT活性降低，MDA含量增加(P<0．01)，而姜黃素中、高劑量組與模型組比較，SOD、CAT活性增強(qiáng)，MDA含量降低(P<0.05或P<0.01)，提示該藥可減少H2O2造成的氧化應(yīng)激損傷。見表1。

表1 姜黃素對(duì)H2O2損傷的軟骨細(xì)胞存活率及SOD、MDA、CAT的影響

組別濃度(μmol/L)存活率(%)SOD(U·mg-1·prot-1)MDA(μmol·g-1·prot-1)CAT(U·mg-1·prot-1)對(duì)照組-101.08±7.2532.12±3.499.95±1.4125.40±2.73模型組-52.74±7.31*19.46±2.58*19.48±1.05*8.62±1.88*姜黃素2060.40±2.9018.35±1.2718.30±0.928.42±2.084075.76±3.24#23.59±2.38#16.82±1.12#12.80±1.82#8087.07±2.51△23.90±1.37△13.82±1.15△17.88±2.04△

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01

2.4 Nrf2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平 H2O2模型組與對(duì)照組比較，Nrf2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)，姜黃素中、高劑量與模型組比較，Nrf2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，提示姜黃素可以促進(jìn)Nrf2的表達(dá)。見圖2，表2。

圖2 姜黃素對(duì)H2O2損傷的軟骨細(xì)胞的Nrf2蛋白表達(dá)的影響

注：1．對(duì)照組；2.H2O2模型組；3.姜黃素20 μmol/L組；4.姜黃素40 μmol/L組；5.姜黃素80 μmol/L組

2.5 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 對(duì)照組為正常培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，增殖能力旺盛，細(xì)胞PI達(dá)18%；模型組為經(jīng)過H2O2處理的軟骨細(xì)胞，PI明顯低于正常細(xì)胞，僅為8%，具有分裂象的S期和G2/M期細(xì)胞明顯減少;姜黃素低、中、高劑量與模型組比較，S期和G2/M期細(xì)胞明顯增多，PI明顯高于模型組，細(xì)胞增殖能力恢復(fù)，呈劑量依賴趨勢。見表3。

3 討論

在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中，氧化應(yīng)激及氧自由基成為近年來的研究熱點(diǎn)，可能對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病起重要作用[2]。在正常情況下，人體內(nèi)有過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化物酶等抗氧化酶系統(tǒng)，可以清除自由基，保證其清除與生成處于動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)自由基生成增加，超出機(jī)體的清除能力，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，可致細(xì)胞氧化損傷甚至凋亡壞死。H2O2是ROS的主要成分，具有穩(wěn)定、可自由彌散、無電荷等特點(diǎn)，能自由穿過細(xì)胞膜，與鐵離子反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，進(jìn)而引起一系列損傷。因此H2O2常被作為體外誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的陽性對(duì)照[11]。MDA是細(xì)胞生物膜上的不飽和脂質(zhì)被氧化后形成的代謝產(chǎn)物，所以培養(yǎng)液中MDA的水平可以間接反映軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的程度[12-14]。內(nèi)源性抗氧化物酶SOD、CAT等構(gòu)成機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線，這些抗氧化酶可以通過清除機(jī)體內(nèi)過量的ROS，使機(jī)體維持平衡狀態(tài)。這些內(nèi)源性抗氧化酶活力的高低反映機(jī)體清除氧自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：通過向培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中加入H2O2，造成氧化應(yīng)激模型，軟骨細(xì)胞存活率明顯下降，SOD、CAT活性降低，MDA含量增加，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明具有分裂象的S期和G2/M期細(xì)胞明顯減少，表明細(xì)胞受到了氧化應(yīng)激損傷。經(jīng)姜黃素預(yù)先處理后，SOD、CAT活性增強(qiáng)，MDA含量降低，S期和G2/M期細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞增殖能力恢復(fù)，提示姜黃素可能通過清除ROS，保持軟骨細(xì)胞膜的完整性，對(duì)H2O2損傷的軟骨細(xì)胞有保護(hù)作用。

表2 姜黃素對(duì)H2O2損傷的Nrf2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

組別濃度(μmol/L)Nrf2mRNANrf2蛋白表達(dá)水平對(duì)照組-1.98±0.351.65±0.14模型組-0.46±0.11*0.23±0.11*姜黃素201.01±0.190.52±0.10401.25±0.21#1.01±0.16#801.62±0.09△1.30±0.12△

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01

表3 姜黃素對(duì)H2O2損傷的軟骨細(xì)胞周期分布及增殖指數(shù)的影響

組別濃度(μmol/L)G0/G1SG2/MPI對(duì)照組-83±2.9112.4±0.345.9±0.430.18±0.01*模型組-88±4.743.8±0.673.9±0.190.08±0.01姜黃素2091±2.404.6±0.625.7±0.970.10±0.01*4088±2.157.1±0.927.1±0.640.14±0.11*8088±0.9438.7±0.578.8±0.440.17±0.01*

注：與模型組比較，*P<0.01

Nrf2是核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用[4]。生理狀態(tài)下，Nrf2位于細(xì)胞質(zhì)中與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keapl)處于結(jié)合態(tài)；當(dāng)細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激損傷時(shí)，Nrf2與Keapl解離，進(jìn)而轉(zhuǎn)移入核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化酶的表達(dá)[15]。

從姜黃屬植物姜黃、莪術(shù)、菖蒲等根莖中提取的橙黃色酸性酚類物質(zhì)為姜黃素，有多種生物活性，包括痛經(jīng)止痛，散風(fēng)活血等。研究表明，姜黃素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化及降血脂及抗氧化、抗腫瘤等作用，而且其毒性低，具有良好的臨床應(yīng)用潛力。最近研究表明，Nrf2是姜黃素作用的重要靶標(biāo)[16]，可以誘導(dǎo)Nrf2 與Keap1 的解離并轉(zhuǎn)移入核，激活下游抗氧化酶的合成，從而降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平[17]。姜黃素可以抑制多種炎性因子的分泌，保護(hù)軟骨細(xì)胞，延緩軟骨退變[18-20]。通過檢測Nrf2-ARE信號(hào)通路下游產(chǎn)物MDA、CAT、SOD的變化，以及Nrf2mRNA及蛋白表達(dá)，可提示姜黃素保護(hù)軟骨細(xì)胞減輕氧化應(yīng)激損傷過程中是否有Nrf2-ARE信號(hào)通路參與。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)姜黃素預(yù)先處理的軟骨細(xì)胞，存活率提高，增殖指數(shù)升高，Nrf2mRNA及蛋白表達(dá)增高，MDA含量減少，SOD、CAT活性升高，說明Nrf2-ARE信號(hào)通路參與了此過程。

本實(shí)驗(yàn)通過分離大鼠的關(guān)節(jié)軟骨，通過膠原酶消化法可獲得足量軟骨細(xì)胞，且具有高純度、高活性特點(diǎn)。培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)甲苯胺類染色和Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色證實(shí)是純化的軟骨細(xì)胞。膠原酶消化法培養(yǎng)的細(xì)胞具有生長速度快、研究周期短的特點(diǎn)，完全滿足實(shí)驗(yàn)的要求。

綜上所述，姜黃素可能通過激活Nrf2轉(zhuǎn)運(yùn)入核，啟動(dòng)下游抗氧化酶的表達(dá)，進(jìn)而抑制H2O2等氧自由基引起的氧化應(yīng)激損傷，對(duì)軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用。

1 Valdes AM,Spector TD.The genetic epidemiology of osteoarthritis.Curr Opin Rheumatol,2010,22:139-143.

2 Afonso V,Champy R,Mitrovic D,et al.Reactive oxygen species and superoxide dismutases:role in joint deseases.Joint Bone Spine,2007,74:324-329.

3 Lee JW,Davis JM.Future applications of antioxidants in premature infants.Curt Opin ediatr,2011,23:161-166.

4 Que LL,Wang HX,Cao BS,et al.The regulation and functions of transcription factor Nrf2 in cancer chemoprevention and chemoresistance.J Chin Pharm Sci,2011,20:5-19.

5 Phillips J,Moore-Medlin T,Sonavane K,et al.Curcumininhibits UV radiation-induced skin cancer in SKH-1 mice.Otolaryngol Head Neck Surg,2013,148:797-803.

6 孫宗建,何琨,張東,等.姜黃素預(yù)先給藥對(duì)兔呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷時(shí)Nrf2蛋白表達(dá)的影響.中華麻醉學(xué)雜志,2014,34:237-240.

7 Shishodia S,Singh T,Chaturvedi MM.Modulation oftranscriptionfactors bycurcumin.Adv Exp Med Biol,2007,595:127-148.

8 梁莉,闕琳玲,曹寶山,等.Nrf2在姜黃素保護(hù)UVB所致細(xì)胞氧化損傷中的作用.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志,2014,34:583-587.

9 宋永周，崔慧先，呂哲,等.大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的培養(yǎng).河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29：534-536.

10 鄭海燕,洪遠(yuǎn),陳高.Nrf2-ARE在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型中的表達(dá)及意義.中華神經(jīng)外科雜志,2013,29:80-84.

11 Shim JH,Kim KH,Cho YS,et al.Protective effect of oxidative stress in HaCaT keratinocytes expressing E7 oncogene.Amino Acids,2008,34:135-141.

12 Tetik S,Ahmad S,Alturfan AA,et al.Determination of oxidant stress in plasma of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis patients.Indian J Biochem Biophys,2012,47:353-358.

13 Scott JL,Gabrielides C,Davidson RK,et al.Superoxide dismutase downregulation in osteoarthritis progression and end-stage disease.Ann Rheum Dis,2010,69:1502-1510.

14 Olszewska-Sonina DM,Matewski D,Drewa G,et al.Oxidative equilibriuminthe prophylaxis of degenerativejoint changes: an analy-sis of pre-and postoperative activity of antioxidant enzymes in patients with hip and knee osteoarthritls.Med Sci Monit,2010,16:CR238-245.

15 McMahon M,Thomas N,Hoh K,et al.Dimerization of substrate adaptors can facilitate cullin-mediated ubiquitylation of proteins by a “tethering” mechanism:a two-site interaction model for the Nrf2-Keapl complex.J Biol Chem,2006,281:24756-24768.

16 Johnson JA,Johnson DA,Kraft AD,et al.The Nrf2-ARE pathway:an indicator and modulator of oxidative stress in neurodegeneration.Ann N Y Acad Sci,2008,1147:61-69.

17 Rahman I.Antioxidant therapeutic advances in COPD.Ther Adv Respir Dis,2008,2:351-374.

18 Jagetia GC,Aggarwal BB.“Spicing up”of the immune system by curcumin.J Clin Immuno,2007,27:19.

19 Epstein J,Sanderson IR,MacDonald TT.Curcumin as a thempeutic agent：the evidence from in vitro，animal and human studies.Br J Nutr,2010,103:1545-1557.

20 陳瓊,趙明才,陳搖,等.姜黃素對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖及分泌MMP-13,IL-6的影響.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,22:271-275.

Protective effects of curcumin on oxidative stress injury of chondrocytes of rats in vitro

SONGYongzhou,TONGJiuhui,MAWei,etal.

DepartmentofOsteology,TheSecongHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

Objective To observe the protective effects of curcumin on chondrocytes through setting up the models of chondrocytes injury of rats in vitro induced by H2O2.Methods The articular chondrocytes of SD rats were prepared and cultured in vitro,which were randomly divided into five groups：control group, model group (H2O2), low-dose curcumin group (20μmol/L),median-dose curcumin group (40μmol/L) and high-dose curcumin group (80μmol/L). On 48 hours after the articular chondrocytes were cultured in culture medium with curcumin, H2O2was added into the culture medium and co-cultured for 24 hous,then the articular chondrocytes were collected. The cell proliferation ability and the contents of superoxide dismutase (SOD),malondialdehyde (MDA),catalase (CAT) were detected by MTT assay and flow cytometry,respectively. The expression levels of Nrf2 mRNA and protein were detected by Real-time PCR and Western Blot,respectively.Results As compared with those in control group,the survival rates of chondrocytes in model group were decreased,and the numbers of chondrocytes with mitotic figure in stage S and G2/M were obviously decreased.The contents of SOD and CAT were decreased,however,the levels of MDA were increased. The expression levels of Nrf2 mRNA and protein were down-regulated.After the chondrocytes were pretreated by curcumin, the survival rates of chondrocytes were increased,the cell proliferation ability was improved,and the contents of SOD and CAT were increased,however,the levels of MDA were decreased. The expression levels of Nrf2 mRNA and protein were increased with the increase of concentration of curcumin.Conclusion The curcumin has protective effects on oxidative stress injury of chondrocytes by increasing the expression levels of Nrf2.

curcumin; chondrocytes; oxidative stress; Nrf2

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.23.001

項(xiàng)目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號(hào)：20150666)；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：2015M582480)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2016A030313100)

050000 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科(宋永周、童九輝、馬維)；河北省石家莊市第三醫(yī)院(關(guān)健、蘇瑞紅)；河北省定州市人民醫(yī)院CT核磁科(李飛、孫淑芹)；暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科(王華軍)

關(guān)健，050011 河北省石家莊市第三醫(yī)院關(guān)節(jié)外科；

E-mail：467999223@qq.com

R 68

A

1002-7386(2016)23-3525-04

2016-09-02)