溶血磷脂酸通過(guò)RhoA?YAP通路調(diào)控脂肪干細(xì)胞增殖的研究

葉亞平 李覓 吳穎星 黃俊明 印衛(wèi)鋒 郭風(fēng)勁

·實(shí)驗(yàn)研究論著·

溶血磷脂酸通過(guò)RhoA?YAP通路調(diào)控脂肪干細(xì)胞增殖的研究

葉亞平 李覓 吳穎星 黃俊明 印衛(wèi)鋒 郭風(fēng)勁

目的探討溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,LPA）調(diào)控脂肪干細(xì)胞（adipose?derived stem cells,ASCs）增殖的作用及其分子機(jī)制。方法分離SD大鼠ASCs，利用LPA對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)時(shí)間為1 h，采用Western Blot檢測(cè)YES相關(guān)蛋白（yes associated protein,YAP）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor,CTGF）蛋白表達(dá)水平。利用免疫熒光檢測(cè)YAP亞細(xì)胞定位，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction,RT?PCR）檢測(cè)CTGF和Ankrd1的mRNA表達(dá)水平。慢病毒轉(zhuǎn)染ASCs，Western Blot檢測(cè)不同分組YAP蛋白表達(dá)。進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)和CCK?8法檢測(cè)不同分組中ASCs增殖情況。最后采用RhoA抑制劑C3干預(yù)，免疫熒光檢測(cè)不同分組中YAP亞細(xì)胞定位，Western Blot檢測(cè)YAP、CTGF和GTP?RhoA的表達(dá)情況。結(jié)果LPA能顯著促進(jìn)YAP的表達(dá)和在細(xì)胞核內(nèi)的聚集，同時(shí)LPA也能夠促進(jìn)YAP靶基因CTGF在蛋白水平的表達(dá)。LPA能上調(diào)YAP靶基因CTGF和錨蛋白重復(fù)域1（ankyrin repeating domain 1,Ankrd1）的mRNA表達(dá)水平。慢病毒轉(zhuǎn)染敲除YAP表達(dá)后，LPA對(duì)YAP的上調(diào)作用被明顯抑制。細(xì)胞周期流式細(xì)胞術(shù)和CCK?8檢測(cè)結(jié)果顯示LPA可顯著促進(jìn)ASCs的增殖，但在shYAP慢病毒轉(zhuǎn)染特異性敲除YAP后，LPA對(duì)ASCs的促增殖能力被明顯削弱。RhoA抑制劑C3處理后，LPA對(duì)YAP細(xì)胞核聚集的促進(jìn)作用被削弱，同時(shí)LPA對(duì)YAP、CTGF和GTP?RhoA表達(dá)的促進(jìn)作用也得到了明顯抑制。結(jié)論LPA能夠通過(guò)RhoA?YAP通路調(diào)控ASCs的增殖。

溶血磷脂酸；脂肪干細(xì)胞；RhoA?YAP通路；細(xì)胞增殖

間充質(zhì)干細(xì)胞為具有自我更新能力的成體干細(xì)胞，其能向中胚層方向（如軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等）分化［1］。間充質(zhì)干細(xì)胞存在于諸多部位，如骨髓、脂肪、牙髓及滑膜等組織中［2，3］。Zuk等［4］學(xué)者最早在脂肪組織中發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞，并將其命名為脂肪干細(xì)胞（adipose?derived stem cells, ASCs）。De Ugarte等［5］發(fā)現(xiàn)分離獲取ASCs與其他來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞比較，操作更為簡(jiǎn)單，所獲取的細(xì)胞量也更大。目前以ASCs為種子細(xì)胞的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中［6］。但是利用ASCs等干細(xì)胞的治療依舊具有局限性，主要因?yàn)橐浦驳募?xì)胞數(shù)目偏低，且移植的細(xì)胞容易發(fā)生凋亡［7］。促進(jìn)ASCs細(xì)胞的增殖能力對(duì)于有效提高以ASCs為種子細(xì)胞的臨床治療效果意義重大，目前仍缺乏關(guān)于ASCs細(xì)胞增殖及其分子機(jī)制的相關(guān)研究報(bào)道。

YES相關(guān)蛋白（yesassociated protein,YAP）能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、器官發(fā)育及腫瘤生長(zhǎng)［8］。Hippo通路能通過(guò)磷酸化YAP的127絲氨酸位點(diǎn)從而抑制YAP進(jìn)入細(xì)胞核并導(dǎo)致YAP表達(dá)下調(diào)［9］。Hippo?YAP通路在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和分化等領(lǐng)域中發(fā)揮著十分重要的作用［8］。Yung等［10］研究顯示溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,LPA）能通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體來(lái)調(diào)控細(xì)胞增殖、存活、黏附遷移等一系列生物學(xué)行為。LPA能通過(guò)激活ERK1/2和PI3K/AKT通路從而抑制H2O2導(dǎo)致的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow?derived stem cells,BMSCs）凋亡［11］。Radeff?Huang等［12］研究顯示LPA能夠抑制其他細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等）的凋亡。Yu等［13］于2012年報(bào)道了他們的研究，結(jié)果顯示LPA能夠調(diào)控乳腺癌上皮細(xì)胞中YAP的表達(dá)。但是LPA對(duì)于ASCs增殖的作用及其相關(guān)機(jī)制尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

LPA對(duì)于ASCs的促增殖作用，LPA相關(guān)分子機(jī)制對(duì)提高ASCs干細(xì)胞治療的效果和ASCs在再生醫(yī)學(xué)中的研究意義重大。在本研究中，我們將對(duì)其作用和相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)闡述。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)），Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connec? tive tissue growth factor,CTGF）一抗、辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗（Santa Cruz公司，美國(guó)），RhoA抑制劑C3（Cytoskeleton公司，美國(guó)），YAP一抗（CST公司，美國(guó)），GTP?RhoA一抗、RhoA檢測(cè)試劑盒（Thermo公司，美國(guó)），RIPA裂解緩沖液（上海碧云天生物科技公司），Alexa Fluor488免疫熒光二抗、Alexa Fluor 594免疫熒光二抗、TrizolReagent（Invitrogen公司，美國(guó)），DAPI染液（博士德公司，中國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reac?tion,RT?PCR）試劑盒、Taq聚合酶、dNTP（MBI公司，美國(guó)），引物合成（北京擎科生物技術(shù)有限公司），RNA酶、PI染液（Sigma公司，美國(guó)），IQ SYBR Green supermix（Bio?Rad公司，美國(guó)），流式細(xì)胞儀（FAC?Sort，BD公司，美國(guó)），CCK?8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（日本同仁生物科技公司，日本），蛋白定量檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），慢病毒構(gòu)建（上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司），熒光顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）ASCs的分離、培養(yǎng)

選取200～250 g成年SD大鼠（由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作都經(jīng)過(guò)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。手術(shù)分離得到大鼠腹股溝脂肪組織后，仔細(xì)修剪并去除血管及淺筋膜等結(jié)締組織，用眼科剪剪至糊狀，加入2倍于組織體積的0.1％Ⅰ型膠原酶，37℃水浴30min，加入等體積的含10％胎牛血清的DMEM終止消化，900×g離心10min后去掉上清液，沉淀物用5m l含10％胎牛血清的DMEM重懸，并以80目尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞種植于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，并標(biāo)記為原代。以后每隔2 d換液1次，并于換液后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和形態(tài)特征。待細(xì)胞接近融合時(shí)用0.25％胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代。

（二）免疫熒光染色

PBS漂洗后將不同分組中的細(xì)胞以4％多聚甲醛固定15min，然后以0.1％Triton X?100于室溫下穿孔處理10 min。5％BSA封閉處理1 h后，將細(xì)胞爬片以YAP一抗4℃條件下孵育過(guò)夜。PBS漂洗3次，再以Alexa Fluor 488免疫熒光二抗或AlexaFluor 594免疫熒光二抗室溫下繼續(xù)孵育1 h。PBS漂洗3次，室溫下DAPI染色孵育5min。再次PBS漂洗去除背景干擾。最后將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察。

（三）Western Blot檢測(cè)

收獲細(xì)胞，用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。用蛋白定量檢測(cè)試劑盒對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。蛋白上樣量為25μg，SDS?PAGE法分離蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上，用5％脫脂牛奶進(jìn)行封閉。然后使用相應(yīng)一抗抗體進(jìn)行孵育，4℃過(guò)夜。漂洗后再加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗兔二抗，室溫下孵育2 h。最后采用化學(xué)發(fā)光法對(duì)蛋白表達(dá)濃度進(jìn)行檢測(cè)，選取GAPDH為內(nèi)參。條帶強(qiáng)度以Quantity One軟件進(jìn)行相對(duì)定量。

（四）RT?PCR檢測(cè)

收獲細(xì)胞，PBS輕柔漂洗，并使用Trizol分別提取各組細(xì)胞的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并選取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT?PCR。CTGF、錨蛋白重復(fù)域1（ankyrin repeating domain 1，Ankrd1）、GAPDH引物標(biāo)記采用熒光染料SYBR GreenⅠ（表1）。聚合酶鏈反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2min；95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，該步驟循環(huán)40次；溶解曲線。反應(yīng)結(jié)束后在PCR儀上讀取Ct值，并進(jìn)行相應(yīng)計(jì)算。以GAPDH為內(nèi)參。

（五）CCK?8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將不同分組細(xì)胞以2×103個(gè)/孔的密度種植于96孔板中。細(xì)胞分別予以LPA或不予以LPA進(jìn)行處理，處理時(shí)間分別為1 d、2 d、3 d。將10μL的CCK?8染液加入每個(gè)孔中，于37℃條件下避光孵育2 h。之后于490 nm波長(zhǎng)下微孔板分光光度計(jì)中讀取不同孔中的吸光度值（A490）并以此來(lái)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)數(shù)量。種植細(xì)胞每24 h標(biāo)記為1 d。記錄不同時(shí)間點(diǎn)分光光度計(jì)中的A490，并與2×103個(gè)細(xì)胞組A490進(jìn)行比較計(jì)算出實(shí)際細(xì)胞數(shù)目，研究細(xì)胞增殖情況。

（六）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

PBS漂洗細(xì)胞2次，70％冷乙醇于-20℃條件下孵育過(guò)夜。乙醇固定后的細(xì)胞以RNA酶于37℃條件下處理30min，然后以PI染液室溫下避光染色30min。PI染液的熒光強(qiáng)度采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)據(jù)采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

（七）慢病毒載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

將YAP特異性限制位點(diǎn)（NM_001034002）插入GV118質(zhì)粒中。YAP特異性抑制位點(diǎn)序列為GGCAATACGGAATATCAAT。插入YAP特異性抑制位點(diǎn)序列后的產(chǎn)物以雙酶切法及DNA測(cè)序法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。之后采用Lipofectamine 2000將慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T細(xì)胞，連續(xù)稀釋法測(cè)定病毒滴度。最后根據(jù)吉?jiǎng)P公司的操作說(shuō)明將慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)入ASCs細(xì)胞中，并于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后丟棄上清液，更換為普通DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

為了進(jìn)一步研究LPA對(duì)YAP的調(diào)控作用，我們?cè)贚PA干預(yù)前利用shYAP慢病毒對(duì)YAP表達(dá)進(jìn)行了特異性的敲除。慢病毒轉(zhuǎn)染成功后72 h再采用LPA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)時(shí)間為24 h。隨機(jī)序列shRNA被標(biāo)記為shControl組，YAP特異性敲除shRNA被標(biāo)記為shYAP組。最后采用Western Blot對(duì)YAP蛋白表達(dá)進(jìn)行分析。

慢病毒轉(zhuǎn)染ASCs后，采用LPA對(duì)ASCs進(jìn)行進(jìn)一步干預(yù)，干預(yù)時(shí)間為72 h，72 h后采用流式細(xì)胞術(shù)分析ASCs細(xì)胞周期，并利用CKK?8法于24 h、48 h和72 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。S及G2/M期細(xì)胞所占比例代表細(xì)胞增殖情況。

（八）GTP?RhoA檢測(cè)

利用RhoA檢測(cè)試劑盒對(duì)RhoA進(jìn)行定量檢測(cè)。采用GST?rhotekin?RBD融合蛋白及谷胱甘肽樹(shù)脂下拉激活的RhoA。最后利用RhoA特異性抗體對(duì)激活的RhoA進(jìn)行檢測(cè)。

采用RhoA特異性抑制劑C3（1mg/L）對(duì)LPA調(diào)控ASCs細(xì)胞的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。ASCs預(yù)先以C3干預(yù)2 h，再以LPA干預(yù)4 h，最后固定細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光及Western Blot分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1　各基因引物序列

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用oneway?ANOVA檢測(cè)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、LPA對(duì)YAP表達(dá)的影響

將LPA（10μmol/L）加入ASCs細(xì)胞培養(yǎng)液中，作用時(shí)間共計(jì)1 h。結(jié)果顯示LPA可以顯著上調(diào)YAP蛋白的表達(dá)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，LPA對(duì)YAP蛋白的上調(diào)效益更加明顯（圖1）。CTGF和Ankrd1為YAP蛋白的下游靶基因，我們也采用Western Blot對(duì)CTGF的表達(dá)進(jìn)行的分析。結(jié)果顯示，LPA（10μmol/L）亦可以顯著上調(diào)CTGF蛋白的表達(dá)，且該促進(jìn)作用同樣具有時(shí)間依賴性（圖1）。同時(shí)，我們利用免疫熒光染色對(duì)YAP的亞細(xì)胞定位和表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示LPA作用1 h后，YAP在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)得到明顯增強(qiáng)（圖2 a）。同時(shí)，RT?PCR檢測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步顯示LPA作用可以顯著促進(jìn)CTGF的表達(dá)（圖2 b）。

二、shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)YAP表達(dá)的調(diào)控

研究shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)YAP的調(diào)控作用，采用Western Blot對(duì)YAP蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示shYAP慢病毒轉(zhuǎn)染能特異性抑制YAP蛋白的表達(dá)，同時(shí)shYAP慢病毒敲除YAP之后LPA雖然依舊能夠輕微促進(jìn)YAP表達(dá)，但其促進(jìn)YAP表達(dá)的效果不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。而在shControl組中，LPA可顯著上調(diào)YAP的表達(dá)，且該促進(jìn)效果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

三、LPA對(duì)ASCs增殖的調(diào)控作用研究

圖1　LPA對(duì)YAP和CTGF表達(dá)的調(diào)控作用a～c：LPA能夠顯著上調(diào)YAP和CTGF的表達(dá)，且其促進(jìn)作用具有時(shí)間依賴性。與0 min比較，*P＜0.05

圖2　LPA對(duì)YAP亞細(xì)胞定位及其靶基因表達(dá)的調(diào)控作用（Alexa Fluor 488染色，×200）a、b：LPA能顯著促進(jìn)YAP在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)，并上調(diào)其靶基因CTGF和Ankrd1的表達(dá)。與未加LPA比較，*P＜0.05

慢病毒轉(zhuǎn)染ASCs后，采用LPA對(duì)ASCs進(jìn)行進(jìn)一步干預(yù)，結(jié)果顯示與shControl組相比，shYAP組ASCs細(xì)胞增殖受到明顯抑制（P＜0.05）。shControl組+LPA與shControl組比較，可見(jiàn)LPA能夠顯著促進(jìn)ASCs的增殖（P＜0.05，圖4），我們推測(cè)這種增殖效益可能與LPA能促進(jìn)YAP的表達(dá)相關(guān)。同時(shí)，CCK?8計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，shControl組中，LPA干預(yù)后的ASCs細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，而shYAP組ASCs細(xì)胞增殖能力被明顯抑制（圖4）。

四、RhoA?YAP通路在LPA調(diào)控ASCs中的作用研究

免疫熒光研究結(jié)果顯示，LPA（10μmol/L）能夠顯著促進(jìn)YAP在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)，加入RhoA特異性抑制劑C3（1mg/L）后，LPA對(duì)YAP細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的上調(diào)作用得到明顯減弱（圖5 a）。同時(shí)，Western Blot顯示RhoA特異性抑制劑C3干預(yù)可顯著抑制LPA對(duì)YAP、CTGF和GTP?RhoA的上調(diào)作用（圖5 b）。因此，我們的結(jié)果初步顯示LPA可能通過(guò)RhoA來(lái)調(diào)控YAP的表達(dá)，并進(jìn)一步影響ASCs的增殖等生物學(xué)行為。

討論

圖3　慢病毒轉(zhuǎn)染ASCs細(xì)胞a、b：shYAP轉(zhuǎn)染能顯著抑制YAP表達(dá)，同時(shí)LPA對(duì)YAP表達(dá)的促進(jìn)作用被shYAP轉(zhuǎn)染削弱。與shControl比較，*P＜0.05

圖4　ASCs細(xì)胞增殖情況a、b：利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，結(jié)果顯示LPA可以顯著促進(jìn)ASCs增殖，shYAP轉(zhuǎn)染后LPA對(duì)ASCs的促增殖作用得到明顯抑制；c：CCK?8法分析細(xì)胞增殖，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)LPA能有效促進(jìn)ASCs增殖，同時(shí)shYAP轉(zhuǎn)染抑制YAP表達(dá)后，LPA對(duì)ASCs促增殖作用得到明顯抑制。與shYAP比較，*P＜0.05；與shControl組比較，#P＜0.05

ASCs為具有多向分化潛能且分離獲取相對(duì)容易的一類(lèi)成體干細(xì)胞，其臨床應(yīng)用前景良好。ASCs能顯著促進(jìn)受損組織或器官的功能恢復(fù)，相比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞而言，ASCs的分離獲取更加簡(jiǎn)便、微創(chuàng)。Barba等［14］研究顯示ASCs在體外傳代次數(shù)更多，且增殖能力也更強(qiáng)。ASCs在骨修復(fù)和骨重建的過(guò)程中發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2與ASCs結(jié)合應(yīng)用可以顯著促進(jìn)其骨修復(fù)效果。Ma?rino等［15］研究顯示磷酸鈣三維支架可以顯著促進(jìn)ASCs的成骨分化。Arrigoni等［16］采用羥基磷灰石或者種植有ASCs細(xì)胞的羥基磷灰石來(lái)治療脛骨骨缺損，他們以骨形態(tài)學(xué)、生物力學(xué)、免疫組化為研究指標(biāo)，顯示種植有ASCs的羥基磷灰石支架與單獨(dú)羥基磷灰石支架相比可以顯著促進(jìn)其骨缺損修復(fù)效果。Yeh等［17］發(fā)現(xiàn)ASCs在靶組織或器官中的數(shù)量對(duì)于提高治療效果至關(guān)重要。因此，對(duì)于ASCs增殖及其相關(guān)分子機(jī)制的研究意義重大。

圖5　LPA通過(guò)RhoA調(diào)控YAP表達(dá)（Alexa Fluor 594染色，DAPI染色，×200）a：免疫熒光分析顯示LPA可以促進(jìn)YAP在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，RhoA抑制劑C3能夠顯著削弱LPA對(duì)于YAP核內(nèi)表達(dá)的促進(jìn)作用；b：RhoA抑制劑C3能夠削弱LPA對(duì)于YAP、CTGF及GTP?RhoA表達(dá)的促進(jìn)作用

LPA能夠通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體來(lái)調(diào)控細(xì)胞的一系列生物學(xué)行為，其下游信號(hào)包括Ras、Rac和MAPK等［18］。下游信號(hào)通路的激活能進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移、分化等生物學(xué)行為。Cai等［19］研究發(fā)現(xiàn)LPA?LPA3?G13?RhoA?ROCK?PP1A?dpYAP?AREG?EGFR信號(hào)軸在卵巢癌上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵的作用。另Chen等［20］研究顯示在急性心肌梗死患者急性發(fā)病時(shí)間為48～72 h，LPA濃度可上升至10mg/L，可能是因?yàn)長(zhǎng)PA可以通過(guò)調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖或者存活以提供對(duì)心臟的保護(hù)作用。LPA也能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡，并且LPA誘導(dǎo)凋亡的濃度與其在血液中的濃度（2～20μmol/L）十分一致［21］。Chen等［22］的研究進(jìn)一步顯示LPA抗間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制可能與LPA1受體相關(guān)，LPA1受體的激活介導(dǎo)LPA對(duì)新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞凋亡的調(diào)控。LPA也能夠通過(guò)LPA1受體來(lái)調(diào)控Schwann細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡［23?25］。LPA1下游的信號(hào)通路包括ERK1/2和PI3K/Akt通路，Li等［26］研究顯示這兩條通路與LPA對(duì)許多不同細(xì)胞的抗凋亡作用關(guān)系密切?？紤]到LPA是具有多種生物學(xué)活性的脂類(lèi)小分子，若能通過(guò)LPA調(diào)控ASCs的增殖將有助于進(jìn)一步優(yōu)化ASCs對(duì)相關(guān)的疾病的治療效果。

我們擬闡明LPA對(duì)ASCs的調(diào)控作用及其相關(guān)分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LPA能顯著促進(jìn)YAP的表達(dá)和在細(xì)胞核內(nèi)的聚集，同時(shí)LPA也能夠促進(jìn)YAP靶基因CTGF在蛋白水平的表達(dá)。LPA能進(jìn)一步上調(diào)YAP靶基因CTGF和Ankrd1在mRNA水平的表達(dá)。之后我們利用慢病毒轉(zhuǎn)染特異性敲除YAP表達(dá)，以研究LPA對(duì)YAP表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果顯示LPA在shControl組中可顯著促進(jìn)YAP的表達(dá)，而在shYAP組中，LPA對(duì)YAP的上調(diào)作用得到明顯抑制。隨后利用流式細(xì)胞術(shù)和CCK?8對(duì)ASCs的增殖能力進(jìn)行了分析研究，結(jié)果顯示LPA可明顯促進(jìn)ASCs的增殖，我們推測(cè)這種促進(jìn)增殖能力可能和LPA對(duì)YAP的上調(diào)作用相關(guān)。同時(shí)，利用shYAP特異性敲除YAP表達(dá)后，LPA對(duì)ASCs增殖能力的促進(jìn)作用得到明顯削弱。最后，利用RhoA抑制劑C3特異性抑制RhoA的表達(dá)，顯示LPA能夠促進(jìn)YAP和GTP?RhoA的表達(dá)，RhoA抑制劑C3干預(yù)能顯著抑制LPA誘導(dǎo)的YAP的表達(dá)和細(xì)胞核的聚集，同時(shí)CTGF表達(dá)也得到明顯下調(diào)。Qiao等［27］研究顯示RhoA分子在細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)行動(dòng)中也十分關(guān)鍵，但是缺乏RhoA與YAP間存在上下游的直接調(diào)控關(guān)系的充分證據(jù)。本研究通過(guò)RhoA抑制劑C3對(duì)RhoA表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而初步揭示了RhoA和YAP的上下游調(diào)控關(guān)系，該結(jié)果具有較大意義，但是需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究去證實(shí)RhoA和YAP間相互作用的直接分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)中，我們研究結(jié)果初步證實(shí)LPA可有效促進(jìn)ASCs的增殖，該促增殖效應(yīng)可能由RhoA/YAP通路來(lái)介導(dǎo)。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了LPA?RhoA?YAP信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為中的重要作用。與之前的研究不同的是，我們的研究重點(diǎn)集中于細(xì)胞增殖及其分子機(jī)制研究ASCs的增殖及其分子機(jī)制對(duì)于提高ASCs相關(guān)的干細(xì)胞治療效果及其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。同時(shí)，本研究也存在一定的不足之處，LPA介導(dǎo)細(xì)胞的一系列生物學(xué)行為，但是LPA在細(xì)胞膜上的受體較多，包括LPA1、LPA2和LPA3［28］。LPA與不同受體的結(jié)合可能導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)完全不同的生物學(xué)行為，而該研究中并未涉及。我們將在下一步的研究中對(duì)此進(jìn)行深入研究，以期進(jìn)一步明確LPA對(duì)ASCs增殖的調(diào)控作用和分子機(jī)制。

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Lysophosphatidic acid regulates the proliferation of adipose?derived stem cells via the RhoA/YAP signaling pathway.

YE Yaping,LIMi,WU Yingxing,HUANG Junming,YINWeifeng,GUO Fengjin.Depart?ment ofOrthopaedics,TongjiHospital,TongjiMedical College,Huazhong University ofScience and Technology, Wuhan 430030,China
Corresponding author:GUOFengjin,E?mail:fjguo@tjh.tjmu.edu.cn

Objective To study the role andmolecularmechanism of lysophosphatidic acid(LPA)in regulating adipose?derived stem cells(ASCs)proliferation.M ethods ASCs were isolated from SD rats and treated with LPA for 1 h.Western blotting was applied to detect the expression of YAP and CTGF proteins. Immunofluorescence stainingwas performed to detect YAP subcellular localization.RT?PCRwas used to detect the expressions of YAP target genes CTGF and Ankrd1.Western blotting was done to detect YAP protein expression after lentivirus transfection.Flow cytometry and CCK?8 assaywere carried out to detect the prolifera?tion of ASCs in different groups.Finally,RhoA inhibitor C3 was utilized and YAPwas subcellularly localized by immunofluorescence staining.The expression of YAP,CTGF and GTP?RhoA was examined byWestern blot?ting.Results LPA could significantly promote the expression and nuclear localization of YAP.LPA could also promote the expression of YAP targetgene CTGF.The RT?PCR also showed that LPA promoted the expression of YAP targetgenes CTGF and Ankrd1.The promotion effectof LPA on YAP protein expressionwas abrogated after shYAP lentivirus transfection.LPA could also significantly promote proliferation of ASCs as demonstrated by the flow cytometry and CCK8 assay.However,the effectwas abrogated by transfection of shYAP lentivirus. The effectof LPA on YAPnuclear localization was abrogated by RhoA inhibitor C3 treatment.C3 treatmentalso abrogated the effect of LPA on YAP,CTGF and GTP?RhoA protein expression.Conclusion LPA could promote proliferation ofASCsvia the RhoA/YAPsignaling pathway.

Lysophosphatidic acid;Adipose?derived stem cells;RhoA?YAP signaling pathway;Cell proliferation

10.3969/j.issn.1674?8573.2016.06.011

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81371915）

430030武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科

郭風(fēng)勁，E?mail：fjguo@tjh.tjmu.edu.cn

（2016?05?13）