水貂阿留申病毒納米PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

楊瑞梅，張傳美，張洪亮，單 虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東省預(yù)防獸醫(yī)重點實驗室，青島 266109)

?

水貂阿留申病毒納米PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

楊瑞梅，張傳美，張洪亮，單 虎*

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東省預(yù)防獸醫(yī)重點實驗室，青島 266109)

為建立便捷、靈敏的水貂阿留申病病毒(AMDV)納米PCR檢測方法，根據(jù)AMDVNS1基因的保守序列設(shè)計一對特異性引物，對納米PCR反應(yīng)的退火溫度、膠體金濃度進(jìn)行了優(yōu)化；測序檢測擴(kuò)增基因是否發(fā)生變異；對特異性和靈敏度進(jìn)行了評估。結(jié)果表明，此納米PCR的最佳退火溫度為51 ℃，普通PCR為55 ℃；加入膠體金最佳濃度在0.2～0.8 nmol·L-1，納米PCR與普通PCR產(chǎn)物測序相似性大于99%。特異性檢測表明該納米PCR方法只擴(kuò)增AMDV而不能擴(kuò)增犬瘟熱病毒和水貂腸炎細(xì)小病毒。在糞尿樣品檢測中該納米PCR敏感性比普通PCR高10倍。檢測40份臨床樣品，結(jié)果表明該方法比對流免疫電泳檢測敏感性提高，從而為用糞、尿等低病毒樣品檢測水貂阿留申病提供了一種新的有效方法。

水貂阿留申病病毒；納米PCR；檢測

水貂阿留申病病毒(Aleutian mink disease virus, AMDV)屬于細(xì)小病毒科阿留申貂病病毒屬，主要引起水貂慢性感染性疾病。該病特征為病程緩慢、血清中丙種球蛋白表達(dá)量過度升高和腎小球腎炎。臨診上主要表現(xiàn)為病貂被毛粗亂，失去光澤，母貂受孕率及仔貂成活率降低，給養(yǎng)貂業(yè)造成極大損失[1-2]。目前尚無有效預(yù)防該病的疫苗，在防制方面主要采取檢疫陽性貂并且淘汰的辦法[3]。對流免疫電泳(CIEP)是國際上公認(rèn)的檢測此病抗體的方法[4]。近年來，發(fā)展了ELISA檢測抗體方法，比對流免疫電泳更為靈敏。這些方法均需采集水貂血液獲得血清進(jìn)行檢測。水貂生性兇猛，保定困難，抓貂采血工作量大；而采血對水貂也有較大的刺激，成為該病血清學(xué)檢測的主要困難。若能從糞、尿中檢測該病毒，將會給該病的檢測提供極大的便利。PCR檢測病料中AMDV DNA操作簡單，靈敏度較高。但由于糞尿中AMDV 病毒含量低、雜質(zhì)多，影響普通PCR檢出效率。有研究表明，攻毒第10天后，用普通PCR才可檢測到水貂糞、尿中的AMDV[5]，因此檢測糞尿中的AMDV需要提高檢測靈敏度。

納米PCR是一種新型PCR技術(shù)，目前認(rèn)為其原理是將1～100 nm膠體金顆粒加入到PCR體系中，由于納米金具有良好的導(dǎo)熱性和吸附DNA的作用，能更快達(dá)到目標(biāo)溫度，減少了非特異擴(kuò)增，提高了特異性擴(kuò)增產(chǎn)量，從而增強了反應(yīng)靈敏度。研究表明，納米PCR檢測能極大提高PCR反應(yīng)的敏感性，例如，Y. Cui等[6]報道在檢測豬細(xì)小病毒時納米PCR方法的敏感性是普通PCR的100倍；X. L. Wang等[7]成功建立了豬博卡病毒的納米PCR方法，靈敏度是普通PCR的100倍；M. Li等[8]報道在PCR反應(yīng)中加入膠體金顆?？商岣叻磻?yīng)靈敏性5～10倍。納米PCR在AMDV檢測中的應(yīng)用尚未見報道，本研究探討nanoPCR對擴(kuò)增AMDV的影響，以期提高檢測靈敏性，探索從糞尿中檢測AMDV的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

1.1.1 生化試劑 Trizol、dNTPs、ExTaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、基因組DNA提取試劑DNAiso Reagent均購自寶生物工程(大連)有限公司。膠體金顆粒(AuNPs)，粒徑30 nm，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)院提供。對流免疫電泳抗原購自吉林特產(chǎn)研究所。

1.1.2 毒株 水貂阿留申病標(biāo)準(zhǔn)毒株(AMDV-G)、犬瘟熱病毒(CDV, Onderstepoort株)、水貂腸炎細(xì)小病毒(MPV)均為本實驗室保存。

1.1.3 檢測病料來源 2016.01—2016.03從山東榮成、威海采集疑似病貂共40只，臨床表現(xiàn)為消瘦、食欲時好時壞，被毛光澤度差，喜飲水。采集糞尿作為檢測樣品；同時后肢中指趾尖采血1～2滴，脫脂棉壓迫止血，置室溫待血清自然析出后備用，取血清做對流免疫電泳。

1.2 引物設(shè)計

參照AMDV ADV-Utah 株NS1基因序列(GenBank 收錄號X77083)設(shè)計引物，將引物在NCBI BLAST中比對；預(yù)期擴(kuò)增大小為365 bp。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，其序列如下，AMDV-F: 5′-CAAGCAATCCAAACTTTCCATGGAC-3′；AMDV-R: 5′-GTGTTACTTACCAACGGCACTTA -3′。

1.3 AMDV NS1基因重組質(zhì)粒模板的制備

以AMDV-G株CRFK細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA為模板，以AMDV-F、AMDV-R為引物，使用exTaq酶擴(kuò)增AMDVNS1基因365 bp片段。將擴(kuò)增片段回收純化，連入pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-N，將其測序正確者作為質(zhì)粒陽性模板。

1.4 納米PCR條件優(yōu)化

參照文獻(xiàn)的方法[8]，PCR反應(yīng)條件預(yù)先設(shè)為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，進(jìn)行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)體系中預(yù)先設(shè)定為：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(濃度各2.5 mmol·L-1)混合液2 μL，exTaq酶1.5 U，引物各1 μL(濃度為20 pmol·L-1)，DNA模板10 ng，膠體金0.3 nmol·L-1(根據(jù)文獻(xiàn)報道[9]，膠體金濃度在0.2～0.8 nmol·L-1之間，初步選擇應(yīng)用0.3 nmol·L-1)，其余用水補齊。

用梯度PCR儀設(shè)置退火溫度為43～61 ℃，間隔2 ℃，探索最佳退火溫度、反應(yīng)體系和其他反應(yīng)條件均相同。

為確定膠體金最佳濃度，應(yīng)用0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 nmol·L-1膠體金加入PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。

1.5 特異性試驗

應(yīng)用上述建立的納米PCR方法分別對水貂腸炎細(xì)小病毒(MEV)的DNA和水貂犬瘟熱(CDV)的cDNA進(jìn)行檢測，驗證該方法的特異性，試驗重復(fù)3 次。

1.6 測序分析納米PCR 擴(kuò)增片段

提取標(biāo)準(zhǔn)毒株AMDV-G的病毒DNA，用上述建立的納米PCR和普通PCR方法分別進(jìn)行擴(kuò)增，膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物并測序。試驗重復(fù)4次。

1.7 敏感性試驗

陽性質(zhì)粒模板用分光光度計測定濃度后，根據(jù)公式計算拷貝數(shù)。用滅菌三蒸水對陽性質(zhì)粒10倍系列稀釋，以每個稀釋度為模板進(jìn)行納米PCR和普通PCR；同時從水貂糞尿中提取AMDV DNA，進(jìn)行倍比稀釋，用納米PCR和普通PCR方法進(jìn)行檢測。

1.8 臨診病例樣品檢測

從山東榮成、威海采集40只疑似水貂AMD病例的新鮮糞尿樣品，進(jìn)行納米PCR和普通PCR檢測，同時用血清做對流免疫電泳，作為標(biāo)準(zhǔn)陽性，以此為對照進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 陽性質(zhì)粒模板的制備

以AMDV-G株接種的CRFK細(xì)胞第5天出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時，細(xì)胞培養(yǎng)物提取的DNA作為模板，擴(kuò)增AMDVNS1部分基因，獲得365 bp目的片段。將其回收純化、連接pMD-18T載體、轉(zhuǎn)化入DH5α菌中。對陽性質(zhì)粒測序，正確者命名為pMD-N，作為PCR的陽性質(zhì)粒。

2.2 納米PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1 退火溫度條件優(yōu)化結(jié)果 用梯度PCR儀設(shè)置退火溫度為43～59 ℃，間隔2 ℃，測定最佳納米PCR反應(yīng)溫度，結(jié)果表明，最佳退火溫度為51 ℃(圖1)。最終確定的PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(濃度各2.5 mmol·L-1) 2 μL，exTaq酶1.5 U，引物各1 μL(濃度為20 pmol·L-1)，DNA模板10 ng，膠體金2 μL (0.3 nmol·L-1)，ddH2O補至25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s， 30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。普通PCR反應(yīng)中最佳退火溫度為55 ℃，其他條件同納米PCR反應(yīng)。

M. DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～9. 退火溫度范圍43～59 ℃(1. 43 ℃; 2. 45 ℃; 3. 47 ℃; 4. 49 ℃; 5. 51 ℃; 6. 53 ℃; 7. 55 ℃; 8. 57 ℃; 9. 59 ℃)M. DL2000 DNA Marker；1-9. The annealing temperature ranged from 43-59 ℃(1. 43 ℃; 2. 45 ℃; 3. 47 ℃; 4. 49 ℃; 5. 51 ℃; 6. 53 ℃; 7. 55 ℃; 8. 57 ℃; 9. 59 ℃)圖1 納米PCR退火溫度條件優(yōu)化Fig.1 Optimiztion of the annealing temperature of the AMDV nanoPCR

2.2.2 膠體金最佳濃度的確定 為確定膠體金最佳濃度，應(yīng)用0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 nmol·L-1膠體金加入PCR反應(yīng)體系中，其中0.2～0.8 nmol·L-1膠體金有明顯擴(kuò)增條帶，1.0 nmol·L-1濃度膠體金抑制了PCR特異性條帶的產(chǎn)生，見圖2。

2.3 納米PCR 特異性試驗

應(yīng)用該納米PCR擴(kuò)增兩種水貂主要病毒病CDV和MEV，均未擴(kuò)增出目的條帶，僅AMDV擴(kuò)增出特異條帶，見圖3，表明該納米PCR方法具有良好特異性。

M. DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～6. 不同濃度膠體金。1. 0 nmol·L-1；2. 0.2 nmol·L-1；3. 0.4 nmol·L-1；4. 0.6 nmol·L-1；5. 0.8 nmol·L-1；6. 1.0 nmol·L-1M. DL2000 DNA marker；1-6. The different concentration of gold nanoparticles. 1. 0 nmol·L-1；2. 0.2 nmol·L-1；3. 0.4 nmol·L-1；4. 0.6 nmol·L-1；5. 0.8 nmol·L-1；6. 1.0 nmol·L-1圖2 不同濃度膠體金在AMDV PCR擴(kuò)增中的效果Fig.2 The effect of the concentration of gold nanoparticles on the AMDV specificity of PCR

M. DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2. AMDV；3. CDV；4. MEVM. DL2000 DNA marker；1, 2. AMDV；3. CDV；4. MEV圖3 納米PCR 特異性試驗結(jié)果Fig.3 Specificity of the AMDV nanoPCR assay

2.4 測序分析納米PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

對AMDV-G株病毒用納米PCR和普通PCR分別擴(kuò)增目的片段，PCR產(chǎn)物膠回收后送寶生物工程(大連)有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行BLAST比對，擴(kuò)增產(chǎn)物與AMDV相應(yīng)區(qū)域相似性為100%。納米PCR和普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的相似性大于99%，說明加入膠體金后，DNA聚合酶的保真度不受影響。

2.5 納米PCR 敏感性試驗

用超微量分光光度計測得重組質(zhì)粒濃度為158 ng·μL-1，換算成拷貝數(shù)濃度為4×1011拷貝·μL-1。將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到濃度梯度(4×1010～4×101拷貝·μL-1)模板標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)用優(yōu)化后的納米PCR和普通PCR方法對稀釋質(zhì)粒模板進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，以質(zhì)粒為模板，納米PCR最低能夠檢測到4×102拷貝·μL-1，普通PCR最低能夠檢測到4×104拷貝·μL-1，納米PCR是普通PCR敏感性的100倍(圖4)；從糞尿樣品中提取病毒DNA進(jìn)行擴(kuò)增時，納米PCR是普通PCR敏感性的10倍(圖5)。表明納米PCR靈敏度高于普通PCR。

2.6 臨床檢測中的應(yīng)用

采集40只疑似AMD水貂的新鮮糞尿樣品及相應(yīng)血清，應(yīng)用上述建立的納米PCR和普通PCR方法檢測，同時進(jìn)行對流免疫電泳。結(jié)果表明，納米PCR和普通PCR檢測AMDV的陽性率分別為62.5%(25/40)和55%(21/40)，對流免疫電泳結(jié)果為47.5%(19/40)，AMDV 用CIEP 法檢測為陽性的樣品，經(jīng)納米PCR檢測均為陽性，AMDV納米PCR檢測為陽性而CIEP為陰性的樣品，經(jīng)測序鑒定，結(jié)果均確認(rèn)為AMDV陽性。表明納米PCR最敏感，其次是普通PCR，對流免疫電泳敏感度最低。也說明該方法可用于AMDV低含量(糞尿)臨床樣品的檢測。

M. DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～10. 產(chǎn)物。A. 質(zhì)粒的普通PCR; B. 質(zhì)粒的納米PCR。1. 4×1010拷貝·μL-1，2. 4×109拷貝·μL-1，3. 4×108拷貝·μL-1，4. 4×107拷貝·μL-1，5. 4×106拷貝·μL-1，6. 4×105拷貝·μL-1，7. 4×104拷貝·μL-1，8. 4×103拷貝·μL-1，9. 4×102拷貝·μL-1，10. 4×101拷貝·μL-1M. DL2000 DNA marker；1-10. The products of PCR assays. A. Conventional PCR assays plasmid as template; B. NanoPCR assays plasmid as template. 1. 4×1010 copies·μL-1，2. 4×109 copies·μL-1，3. 4×108 copies·μL-1，4. 4×107 copies·μL-1，5. 4×106 copies·μL-1，6. 4×105 copies·μL-1，7. 4×104 copies·μL-1，8. 4×103 copies·μL-1，9. 4×102 copies·μL-1，10. 4×101 copies·μL-1圖4 質(zhì)粒模板納米PCR 敏感性試驗結(jié)果Fig.4 Sensitivity of the AMDV nanoPCR assay in plasmid template

M. DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～4. 普通PCR(1.原倍糞尿提取DNA；2. 10倍稀釋提取DNA；3. 100倍稀釋提取DNA；4. 1 000倍稀釋提取DNA)；5～8. 納米PCR(5. 原倍糞尿提取DNA;6. 10倍稀釋提取DNA;7. 100倍稀釋提取DNA;8. 1 000倍稀釋提取DNA)M. DL2000 DNA marker；1-4. Conventional PCR assays(1. DNA extraction from the urine and feces；2. DNA diluted 10-fold；3. DNA diluted 100-fold；4. DNA diluted 1 000-fold)；5-8. NanoPCR assay(5. DNA extraction from the urine and feces；6. DNA diluted 10-fold；7. DNA diluted 100-fold；8. DNA diluted 1 000-fold)圖5 糞尿樣品中納米PCR 敏感性試驗結(jié)果Fig.5 Sensitivity of the AMDV nanoPCR assay in clinical diagnosis the urine and feces

3 討 論

AMDV全長約4 800個堿基，主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2。NS1長度1 932 bp，是最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1在感染和病毒早期復(fù)制中起重要作用。A. A. Knuuttila等[10]對不同AMDV毒株的NS1基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白序列非常相似，一致性高達(dá)86%～100%。NS1基因已用在普通PCR中檢測AMDV[5]，因此本研究針對NS1基因保守區(qū)設(shè)計特異性引物擴(kuò)增目的片段，確保該方法的特異性。病毒分離鑒定是最準(zhǔn)確的診斷方法，但由于耗時久，操作復(fù)雜，在本研究中沒有采用此法，而是用PCR產(chǎn)物回收、測序，測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行BLAST比對從而確定該方法的準(zhǔn)確性。

水貂阿留申病的國際標(biāo)準(zhǔn)檢測方法是使用對流免疫電泳法[11]，即采取水貂的血液，獲取血清后，用標(biāo)準(zhǔn)抗原做對流免疫電泳觀察是否出現(xiàn)特異條帶，該方法簡便、快速、結(jié)果較為準(zhǔn)確。但與普通PCR法相比，對流免疫電泳的靈敏度低[5，12]。檢測水貂糞、尿這些病毒含量少的樣品，需用靈敏度更高的方法。本研究首次建立了從糞尿樣品中檢測AMDV的靈敏、特異方法，應(yīng)用納米PCR檢測水貂阿留申病，以質(zhì)粒為模板，靈敏度較普通PCR提高100倍；以臨床糞尿樣品為模板，靈敏度較普通PCR提高10倍，能簡便快速檢測糞尿中AMDV。這與其他病毒病納米PCR研究結(jié)果一致，如，X. J. Ma等[13]建立了納米顆粒輔助的PCR，將豬偽狂犬病檢測效率提高了100～1 000倍。袁萬哲等[14]用納米PCR檢出新城疫病毒的效率提高10倍。本研究表明，質(zhì)粒為模板的納米PCR是普通PCR靈敏度的100倍，而在用糞尿樣品提取DNA為模板時，納米PCR是普通PCR靈敏度的10倍，分析原因可能是由于構(gòu)建的質(zhì)粒模板純度高，成分更為單一，對PCR擴(kuò)增的影響較小，而從糞尿樣品中提取DNA濃度相對較低，仍含有微量蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，影響了擴(kuò)增效果。

膠體金制備簡單，每次PCR擴(kuò)增中用量少，因此成本低。加入PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率能夠提高10倍，有利于臨床上水貂阿留申病的大量檢測。對加入膠體金后是否影響PCR保真度，本研究通過對納米PCR產(chǎn)物測序，與普通PCR相似性在99%，表明加入納米金后，在此PCR體系中DNA聚合酶仍能保持很高的保真度，保證了檢測的特異性和靈敏性。除此以外，作者在試驗中也發(fā)現(xiàn)膠體金的保存也極為重要，膠體金溶液應(yīng)無菌冷藏，非無菌狀態(tài)在4 ℃冷藏時間長(如超過10 d)易影響效果，膠體金的保存條件有待于下一步研究。

應(yīng)用建立的AMDV納米PCR方法和對流免疫電泳對貂場40頭水貂的糞尿樣品和相應(yīng)的血清進(jìn)行了平行檢測，結(jié)果納米PCR比CIEP的檢出率高且測序后確認(rèn)均為AMDV陽性，證明納米PCR具有更高的敏感性，該方法可用于臨床中糞尿樣品的AMDV檢測。

關(guān)于膠體金提高PCR反應(yīng)的原理至今仍不是很清楚，主要認(rèn)為是金屬離子加強了導(dǎo)熱性和吸附相關(guān)DNA而提高了反應(yīng)速度和靈敏性，但有爭議，具體原因仍在研究之中。B. V. Vu等研究表明[15]，在進(jìn)行納米PCR設(shè)計引物時，擴(kuò)增片段最好小于500 bp，小的片段靈敏度更高，膠體金通過吸附DNA擴(kuò)增酶更易于擴(kuò)增小片段目的產(chǎn)物。本研究中擴(kuò)增片段為365 bp，具有較好擴(kuò)增效果。

總之，本研究首次應(yīng)用納米PCR技術(shù)對AMDV病毒NS1基因進(jìn)行檢測，表明該方法具有良好的特異性較高的敏感性，為檢測AMDV提供了新技術(shù)，可用水貂糞尿樣品檢出陽性病貂，從而用于該病的流行病學(xué)調(diào)查，為檢測、預(yù)防水貂阿留申病奠定基礎(chǔ)。

[1] PORTER D D, LARSEN A E, PORTER H G. Aleutian disease of mink[J].AdvImmunol, 1980, 29: 261-286.

[2] LARSEN A E, PORTER D D. Pathogenesis of aleutian disease of mink: identification of nonpersistent infections[J].InfectImmun, 1975, 11(1) : 92-94.

[3] 王廷鴻，祝 麗，魏 濤.水貂阿留申病凈化研究[J].經(jīng)濟(jì)動物學(xué)報, 2014, 18(3):159-160,167.

WANG T H, ZHU L, WEI T. Purification of mink aleutian disease from farm[J].JournalofEconomicAnimal, 2014, 18(3):159-160,167. (in Chinese)

[4] AASTED B, COHN A. Inhibition of precipitation in counter current electrophoresis. A sensitive method for detection of mink antibodies to Aleutian disease virus[J].ActaPatholMicrobiolImmunolScandC, 1982, 90(1):15-19.

[5] JENSEN T H, CHRISTENSEN L S, CHRIéL M, et al. Implementation and validation of a sensitive PCR detection method in the eradication campaign against Aleutian mink disease virus[J].JVirolMethods, 2011, 171(1): 81-85．

[6] CUI Y, WANG Z, MA X, et al. A sensitive and specific nanoparticle-assisted PCR assay for rapid detection of porcine parvovirus[J].LettApplMicrobiol, 2014, 58(2): 163-167.

[7] WANG X L, BAI A Q, ZHANG J, et al. A new nanoPCR molecular assay for detection of porcine bocavirus[J].JVirolMethods, 2014, 202: 106-111.

[8] LI M, LIN Y C, WU C C, et al. Enhancing the efficiency of a PCR using gold nanoparticles[J].NucleicAcidsRes, 2005, 33(21): e184.

[9] LI H, HUANG J, LV J, et al. Nanoparticle PCR : nanogold-assisted PCR with enhanced specificity[J].AngewChemIntEdEngl, 2005, 44(32) :5100-5103.

[10] KNUUTTILA A, UZCTEGUI N, KANKKONEN J, et al. Molecular epidemiology of Aleutian mink disease virus in Finland[J].VetMicrobiol, 2009, 133(3):229-238.

[11] 關(guān)中湘，王樹志，向敬芝，等.水貂阿留申病對流免疫電泳用診斷抗原的制備和試用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1987，18(1)：34-40.

GUAN Z X， WANG S Z， XIANG J Z， et al. Preparation and application of counter-immunoelectrophoresis antigen for the diagnosis of Aleutian disease in mink[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica,1987,18(1):34-40.(in Chinese)

[12] MURAKAMI M, MATSUBA C, UNE Y, et al. Nucleotide sequence and polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism analyses of Aleutian disease virus in ferrets in Japan[J].JVetDiagnInvest, 2001, 13(4):337-340.

[13] MA X J, CUI Y C, QIU Z Q, et al. A nanoparticle-assisted PCR assay to improve the sensitivity for rapid detection and differentiation of wild-type pseudorabies virus and gene-deleted vaccine strains[J].JVirolMethods, 2013, 193(2):374-378.

[14] 袁萬哲,鄒云婧,孫繼國,等.檢測新城疫病毒的納米PCR技術(shù)建立與初步應(yīng)用[J].畜牧與獸醫(yī),2016，48(1):104-106.

YUAN W Z，ZOU Y J，SUN J G，et al． Development of a nanoparticle-assisted PCR assay for detection of Newcastle disease virus[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine, 2016, 48(1):104-106. (in Chinese)

[15] VU B V, LITVINOV D, WILLSON R C. Gold nanoparticle effects in polymerase chain reaction: favoring of smaller products by polymerase adsorption[J].AnalChem, 2008, 80(14): 5462-5467.

(編輯 白永平)

The Establishment and Application of Nanoparticle PCR Molecular Assay for Detection of Aleutian Mink Disease Virus

YANG Rui-mei, ZHANG Chuan-mei, ZHANG Hong-liang, SHAN Hu*

(KeyLaboratoryofPreventiveVeterinaryMedicineofShandongProvince,CollegeofAnimalSciencesandTechnology,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao266109,China)

Nanoparticle-assisted polymerase chain reaction (nanoPCR) is a novel method for the rapid amplification of DNA. This study was aimed to establish a simple and sensitive nanoPCR assay for detection of Aleutian mink disease virus (AMDV), primers were designed based on the conserved region of theNS1 gene sequences available in GenBank to amplify a 365 bp fragment. The optimized annealing temperature and the concentration of gold nanoparticles were studied. Whether or not the DNA replication fidelity compromised in nanoparticla-assisted PCR was detected by sequencing nanoPCR products. A nanoPCR assay was developed and its sensitivity and specificity were investigated. Under the optimized conditions of nanoPCR assay, annealing temperature was 51℃ but that of conventional PCR was 55 ℃. The best concentration of gold nanoparticles was in the range of 0.2-0.8 nmol·L-1. The 99% homology between the products obtained with the nanoPCR amplification and the conventional PCR showed that highly levels of DNA replication fidelity in this nanoPCR. In addition, the other mink viruses detected by the nanoPCR were all negative. Under the optimized conditions of the AMDV nanoPCR assay, the nanoPCR assay was 10-fold more sensitive than a conventional PCR assay in urine and feces samples. The lower detection limit of the nanoPCR assay was about 4.0×102copies. Furthermore, a total of 40 clinical samples were detected by this assay. The results showed that the nanoPCR is sensitive than counter immunoelectrophoresis (CIEP). The nanoPCR assay developed in this study can be applied widely in clinical diagnosis the urine and feces and field surveillance of AMDV-infection.

Aleutian mink disease virus; nanoparticle PCR; molecular assay

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.017

2016-07-01

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(2012FY111000)；山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(2014ZZCX07105)

楊瑞梅(1975-)，女，陜西長安人，副教授，博士，主要從事毛皮動物疫病研究， E-mail:yrm.cc@163.com

*通信作者：單 虎，教授，博士，主要從事動物傳染病研究，E-mail:shanhu@163.com

S852.659.2

A

0366-6964(2016)11-2288-06