吡格列酮對(duì)MZT期小鼠胚胎發(fā)育阻滯的影響

徐禮杰，李鐘淑，方南洙

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)系，延邊 133002)

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吡格列酮對(duì)MZT期小鼠胚胎發(fā)育阻滯的影響

徐禮杰，李鐘淑，方南洙*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)系，延邊 133002)

本研究旨在了解活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、發(fā)育阻滯與抗氧化物吡格列酮(Pioglitazone，PIO)之間的關(guān)系。試驗(yàn)分3組：對(duì)照組、H2O2處理組和H2O2+PIO處理組。通過(guò)H2O2建立小鼠胚胎氧化損傷模型，添加抗氧化物質(zhì)PIO對(duì)胚胎進(jìn)行氧化修復(fù)， DCHFDA測(cè)定胚胎內(nèi)部ROS水平，半定量PCR測(cè)定母型-合子型胚胎內(nèi)部相關(guān)母性效應(yīng)基因和合子型基因的表達(dá)。結(jié)果表明：(1)1-細(xì)胞和2-細(xì)胞胚胎H2O2處理組的ROS水平明顯比對(duì)照組和H2O2+PIO處理組的高(P<0.05)；(2)H2O2處理組的2-細(xì)胞向4-細(xì)胞過(guò)渡率明顯比對(duì)照組和H2O2+PIO處理組低(P<0.05)，但各處理組之間1-細(xì)胞向2-細(xì)胞過(guò)渡率差異不顯著(P>0.05)；(3)H2O2處理組的母性效應(yīng)基因Hsf1、Zfp3612、Zp3和合子型基因Eif1-α、Zscan4d和Muerv-L的表達(dá)明顯比對(duì)照組和H2O2+PIO處理組低(P<0.05)。綜上表明，氧化應(yīng)激通過(guò)下調(diào)2-細(xì)胞胚胎母型效應(yīng)基因和合子型基因表達(dá)，導(dǎo)致小鼠胚胎2-細(xì)胞發(fā)育阻滯，抗氧化物質(zhì)吡格列酮可促進(jìn)胚胎發(fā)育，有效克服胚胎體外2-細(xì)胞發(fā)育阻滯現(xiàn)象。

吡格列酮；氧化應(yīng)激；發(fā)育阻滯；母性效應(yīng)基因；合子型基因

小鼠胚胎早期發(fā)育期間，2-細(xì)胞胚胎形成標(biāo)志著胚胎發(fā)育從母性效應(yīng)基因向合子型基因過(guò)渡(Maternal to Zygotic transition, MZT)[1]，這是大部分多細(xì)胞動(dòng)物的一個(gè)現(xiàn)象[2]。卵子發(fā)生時(shí)期，卵母細(xì)胞合成母性效應(yīng)mRNA和蛋白質(zhì)直至卵子形成，這些物質(zhì)將執(zhí)行早期胚胎生物合成，指導(dǎo)第一次減數(shù)分裂以及指定最初的細(xì)胞命運(yùn)和模式[3]。受精后，卵母細(xì)胞啟動(dòng)母性mRNA降解，這個(gè)過(guò)程是在2-細(xì)胞末期完成的。隨著母性效應(yīng)mRNA降解，受精卵的合子型基因激活(Zygotic gene activation, ZGA)并進(jìn)一步加快母性mRNA降解[3]。胚胎的發(fā)育調(diào)控實(shí)現(xiàn)從母性效應(yīng)基因向合子型基因過(guò)渡，合子型轉(zhuǎn)錄物指導(dǎo)胚胎進(jìn)一步發(fā)育。因此，ZGA是胚胎繼續(xù)發(fā)育的基本條件。延伸啟動(dòng)因子1a(Elongation initiation factor 1a, Eif1-a)、熱休克蛋白70.1(Heat-shock protein 70.1, Hsp70.1)、鼠內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒樣基因(Murine endogenous retrovirus-like, Muerv-L)以及鋅指和SCAN結(jié)構(gòu)域4d(Zinc finger and SCAN domain-containing protein 4d, Zscan4d)是ZGA的內(nèi)源性標(biāo)記基因[4]。通過(guò)基因敲除的方法，越來(lái)越多的母性效應(yīng)基因及其功能得到確認(rèn)。如早期胚胎中缺失熱休克因子1(Heat-shock factor 1, Hsf1)[5]、合子阻滯因子1(Zygote arrest 1, Zar1)[6]等將會(huì)導(dǎo)致胚胎1-細(xì)胞發(fā)育阻滯，缺失ZFP36環(huán)指蛋白2(ZFP36 ring finger protein like 2, Zfp36l2)[7]、透明帶蛋白3(Zona pellucida protein 3, Zp3)[8]、胚胎必要的母體抗原(Maternal antigen that embryos require, Mater)[9]等導(dǎo)致2-細(xì)胞發(fā)育阻滯。

在體外培養(yǎng)過(guò)程中，許多胚胎由于ZGA延遲導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯而死亡[10]。小鼠胚胎發(fā)育阻滯通常發(fā)生在2-細(xì)胞時(shí)期而被稱(chēng)為“2-細(xì)胞發(fā)育阻滯”。在過(guò)去的幾十年里，人們花費(fèi)了大量時(shí)間去探究2-細(xì)胞阻滯的原因。M.H.Nasr-Esfahani等[11]通過(guò)分析小鼠植入前胚胎中H2O2水平發(fā)現(xiàn)，2-細(xì)胞中期小鼠胚胎中H2O2含量上升，這個(gè)時(shí)期剛好與小鼠胚胎ZGA時(shí)期相吻合。因此，有學(xué)者將小鼠2-細(xì)胞發(fā)育阻滯與胚胎內(nèi)部上升的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平相關(guān)并證實(shí)高濃度ROS抑制胚胎分裂，影響母性效應(yīng)基因向合子型基因過(guò)渡[12]。孕前砷暴露可導(dǎo)致胚胎ROS水平明顯升高[13]，使小鼠植入前胚胎大部分阻滯在1-細(xì)胞和2-細(xì)胞。此外，培養(yǎng)基中添加過(guò)氧化氫酶抑制劑可導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯的發(fā)生[14]。結(jié)果表明，ROS是導(dǎo)致哺乳動(dòng)物胚胎體外發(fā)育阻滯的原因之一。

活性氧是指氧自由基和氧化作用較強(qiáng)的非自由基含氧產(chǎn)物。體外培養(yǎng)條件能造成各種細(xì)胞應(yīng)激因子增加，包括氧化劑和異常細(xì)胞成分[15]，從而導(dǎo)致體外胚胎ROS積累，降低胚胎的質(zhì)量[16]和阻礙胚胎的發(fā)育[17]。利用抗氧化酶能夠提高胚胎體外發(fā)育效率，降低胚胎氧化應(yīng)激，如CAT[18]、SOD[18-19]和GSH[20]。PPARγ被認(rèn)為是一種新型的抗氧化因子[21]，參與氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通道中。PPARγ可增加NRF2表達(dá)，激活的NRF2可促進(jìn)ARE介導(dǎo)抗氧化基因表達(dá)[22-24]。PPARγ可抑制ROS主要生產(chǎn)場(chǎng)所之一的NADPH氧化酶的表達(dá)[25]。PPARγ的其中一種特異性激動(dòng)劑，吡格列酮可降低NOX1的mRNA和蛋白水平以及NADPH氧化酶活性，提高抗氧化物Cu/Zn-SOD和Mn-SOD蛋白的水平，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)部ROS水平[26]。

本研究通過(guò)檢測(cè)氧化損傷胚胎及吡格列酮修復(fù)氧化損傷胚胎中相關(guān)母性效應(yīng)基因和合子型基因的表達(dá)水平，進(jìn)一步探明ROS、胚胎發(fā)育阻滯與吡格列酮的關(guān)系，為吡格列酮抑制ROS誘導(dǎo)的胚胎發(fā)育阻滯提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

所用的動(dòng)物為性成熟的昆明白系小鼠，購(gòu)自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)在24 ℃環(huán)境中，光周期為12 h(8:00-20:00)，暗周期為12 h(20:00-8:00)。

1.2 試劑

孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)購(gòu)自寧波激素有限公司；吡格列酮(Pioglitazone, PIO)購(gòu)自Selleckchem；Qiagen RNeasy Mini Kit試劑盒購(gòu)自凱杰公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購(gòu)自寶生物公司；2×Taq PCR MasterMix購(gòu)自天根基因公司；其他相關(guān)藥品非特殊說(shuō)明均購(gòu)自Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 胚胎的收集及培養(yǎng) 挑選健康母鼠于第1天的17:00腹腔注射10 IU PMSG，時(shí)隔48 h腹腔注射10 IU hCG，然后與公鼠1∶1合籠，合籠15 h后檢查陰道栓。注射hCG 22 h后，脫頸處死見(jiàn)栓母鼠，打開(kāi)腹腔取出輸卵管，顯微鏡下挑破輸卵管壺腹部。300 mg·L-1透明質(zhì)酸酶脫去卵丘細(xì)胞，然后用M2清洗3遍，除去透明質(zhì)酸酶。收集的胚胎在相應(yīng)培養(yǎng)液中清洗3遍后，轉(zhuǎn)移到相應(yīng)培養(yǎng)液小滴中，在飽和濕度、5% CO2氣相條件、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，之后將其換成M16培養(yǎng)液孵育。

1.3.2 氧化損傷以及氧化修復(fù)胚胎模型的建立 收集的胚胎置于25 μmol·L-1的H2O2中孵育30 min后，分別在M16培養(yǎng)液和添加有5 μmol·L-1吡格列酮的培養(yǎng)液中清洗3遍，轉(zhuǎn)移到相應(yīng)培養(yǎng)液小滴中進(jìn)行培養(yǎng)。未經(jīng)H2O2處理的胚胎用作對(duì)照組。

1.3.3 胚胎內(nèi)部ROS含量的檢測(cè) 胚胎置于1 g·L-1PVA小滴中，洗滌2遍，然后避光置于10 μmol·L-1的2’7’-二氯熒光素二乙酸鹽(DCHFDA)染色液微滴中，放入培養(yǎng)箱孵育15 min。將孵育后的胚胎用M2洗3遍，在熒光顯微鏡下熒光顯色。用Image J 1.49對(duì)熒光圖片量化分析，結(jié)果用平均相對(duì)熒光強(qiáng)度相對(duì)值表示。

Type: Vietnam. Transplant collected from Son La Province, Van Ho District, Tan Xuan Municipality, Cot Moc Village, at ca. 1000 m a.s.l. 20°40′33.3″N, 104°39′0.3″E, 10 Nov 2015, L. Averyanov, CPC 7158a,b /13279 (holotype, LE, not seen).

1.3.4 總RNA的提取及cDNA合成 胚胎培養(yǎng)5和20 h，分別收集1-細(xì)胞和2-細(xì)胞胚胎各200個(gè)。胚胎總RNA提取根據(jù)Qiagen RNeasy Mini Kit試劑盒用法說(shuō)明進(jìn)行操作。總RNA提取后，根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒用法說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。合成的cDNA保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 半定量PCR 應(yīng)用2×Taq PCR Master Mix進(jìn)行PCR反應(yīng)，25 μL體系:模板4 μL，5 μmol·L-1上下游引物(表1)各1 μL，2×TaqPCR MasterMix 13 μL，ddH2O26 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min； 95 ℃變性30 s， 59～64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸5 min。5 μL的PCR產(chǎn)物用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，隨后用Lane 1D Analysis Software進(jìn)行IOD值分析。

表1 引物序列

Table1 Primer sequences

引物名稱(chēng)Primername基因鏈接號(hào)AccessionNo.上游引物(5'-3')Forwardprimer下游引物(5'-3')Reverseprimer退火溫度/℃Annealingtemperature擴(kuò)增產(chǎn)物/bpProductHsf1NM008296ACAACAACATGGCTAGCTTCGGGAGTCCATACACTCCTGTTT59901Zar1NM174877CTCAGGACCCCGGTGATTCACTCGGCAGAACTGTTTGA592050Zfp36l2NM001001806CCTCCTTTGTGGTGGTTGTTACACTACGTGGTGGCAATGA59121MaterNM011860GAGCATCATGGAGGTGAAGAGCTTCTGGTTAATCAGCAGCCA59301ZP3NM011776ATGGCGTCAAGCTATTTCCTCCGTGCCAAAAAGGTCTCTACT59186Zscan4dNM001100186CCATCTCATAGTTCTGGTGTGCGCTCCTTAGTCTGCTTTTCTGG59166Eif1aNM010120CCAAAGAATAAAGGCAAAGGAGCTCACACCGTCAAAGCACATT59164Hsp70.1NM010478AAGAGGAAGCACAAGAAGGACAGCGTGATGGATGTGTAGAAGTC59160Muerv-LY12713CGCACAGCAGCAGTCTATTATCTCTTCTCCTCTTCGGTCAGTTG64203GAPDHBC023196CATCACCATCTTCCAGGAGCGGAGGGGCCATCCACAGTCTTC59357

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果用“平均值±SEM”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 吡格列酮對(duì)小鼠1-細(xì)胞發(fā)育的影響

2.1.1 吡格列酮對(duì)小鼠胚胎1-細(xì)胞向2-細(xì)胞過(guò)渡的影響 H2O2誘導(dǎo)小鼠胚胎氧化損傷后，再經(jīng)5 μmol·L-1吡格列酮處理，其對(duì)胚胎1-細(xì)胞期過(guò)渡到2-細(xì)胞期的影響見(jiàn)表2，重復(fù)5次。對(duì)照組、H2O2處理組和H2O2+PIO處理組的1-細(xì)胞向2-細(xì)胞過(guò)渡率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明H2O2不會(huì)對(duì)小鼠胚胎1-細(xì)胞發(fā)育形成阻滯。

表2 吡格列酮對(duì)小鼠1-細(xì)胞胚胎向2-細(xì)胞過(guò)渡的影響

Table 2 The effect of pioglitazone on mouse 1-cell embryos to 2-cell transition

組別Group合子數(shù)Zygotenumber1-細(xì)胞向2-細(xì)胞過(guò)渡率/%Rateofzygoticto2-celltransitionControl19190.39±1.75aH2O218889.77±0.82aH2O2+PIO16991.50±2.05a

同一列不同字母代表處理組之間存在顯著差異(P<0.05)。下同

Different letters in the same column means significant difference between the treatments (P<0.05). The same as below

2.1.3 吡格列酮對(duì)小鼠1-細(xì)胞胚胎母性效應(yīng)基因表達(dá)的影響 1-細(xì)胞胚胎母性效應(yīng)基因電泳條帶見(jiàn)圖2A，其量化結(jié)果見(jiàn)圖2B。H2O2處理組母性效應(yīng)基因Hsf1的表達(dá)水平明顯比對(duì)照組和H2O2+PIO處理組低(P<0.05)，但H2O2+PIO處理組仍顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。Zar1在H2O2處理組和H2O2+PIO處理組中均沒(méi)有表達(dá)。

A.1-細(xì)胞胚胎內(nèi)部ROS熒光染色圖(10×40)；B.1-細(xì)胞胚胎內(nèi)部ROS熒光強(qiáng)度圖A. Fluorescence imaging of ROS in 1-cell embryos(10×40);B.Fluorescence intensity of ROS in 1-cell embryos圖1 1-細(xì)胞胚胎ROS熒光染色圖及其量化圖Fig.1 Fluorescence imaging of ROS and quantification in 1-cell embryos

A.Hsf1、Zar1和GAPDH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖；B.Hsf1和Zar1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量A.1% agarose gel electrophoresis for the PCR amplification products of the Hsf1, Zar1 and GAPDH; B.Relative expression of Hsf1 and Zar1圖2 小鼠胚胎1-細(xì)胞期母性效應(yīng)基因的表達(dá)Fig.2 The expression of maternal-effect genes in mouse 1-cell embryos

2.2 吡格列酮對(duì)小鼠2-細(xì)胞發(fā)育的影響

2.2.1 吡格列酮對(duì)小鼠胚胎2-細(xì)胞向4-細(xì)胞過(guò)渡的影響 H2O2誘導(dǎo)小鼠胚胎氧化損傷后，再經(jīng)5 μmol·L-1吡格列酮處理，其對(duì)胚胎2-細(xì)胞向4-細(xì)胞過(guò)渡的影響見(jiàn)表3，試驗(yàn)重復(fù)5次。對(duì)照組和H2O2+PIO處理組的2-細(xì)胞向4-細(xì)胞過(guò)渡率顯著比H2O2處理組高(P<0.05)。初步說(shuō)明H2O2參與小鼠2-細(xì)胞胚胎發(fā)育阻滯。

2.2.2 吡格列酮對(duì)小鼠2-細(xì)胞胚胎ROS的影響 收集各處理組2-細(xì)胞胚胎，DCHFDA避光染色后，藍(lán)色波長(zhǎng)光(535 nm)激發(fā)，熒光顯微鏡下觀(guān)察ROS的熒光強(qiáng)度(圖3A)，熒光圖片量化分析見(jiàn)圖3B。對(duì)照組和H2O2+PIO處理組在2-細(xì)胞時(shí)期顯著低于H2O2處理組(P<0.05)，而對(duì)照組與H2O2+PIO處理組沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。

表3 吡格列酮對(duì)小鼠2-細(xì)胞胚胎向4-細(xì)胞過(guò)渡的影響

Table 3 The effect of pioglitazone on mouse 2-cell embryos to 4-cell transition

組別Group2-細(xì)胞胚胎數(shù)2-cellnumber2-細(xì)胞向4-細(xì)胞過(guò)渡率/%Rateof2-cellto4-celltransitionControl16171.20±6.63aH2O218845.15±3.19bH2O2+PIO14674.93±3.90a

2.2.3 吡格列酮對(duì)小鼠2-細(xì)胞胚胎母性效應(yīng)基因表達(dá)的影響 2-細(xì)胞胚胎母性效應(yīng)基因電泳條帶見(jiàn)圖4A，其量化結(jié)果見(jiàn)圖4B。H2O2均能降低母性效應(yīng)基因Mater、Zfp3612和Zp3的表達(dá)水平(P<0.05)。添加吡格列酮后，Zfp3612和Zp3的表達(dá)水平顯著比H2O2處理組高(P<0.05)，但仍然顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。H2O2+PIO處理組Mater的表達(dá)水平比H2O2處理組低(P>0.05)。

2.3 吡格列酮對(duì)2-細(xì)胞胚胎合子基因表達(dá)的影響

2-細(xì)胞胚胎合子型基因電泳結(jié)果見(jiàn)圖5A，其量化結(jié)果見(jiàn)圖5B。H2O2均能降低合子型基因的表達(dá)水平，其中Eif1a、Muerv-L和Zscan4d顯著下降(P<0.05)。添加吡格列酮后，Eif1a、Hsp70.1、Muerv-L和Zscan4d的表達(dá)水平顯著比H2O2處理組高(P<0.05)。

A.2-細(xì)胞胚胎內(nèi)部ROS熒光染色圖(10×40)；B.2-細(xì)胞胚胎內(nèi)部ROS熒光強(qiáng)度圖A.Fluorescence imaging of ROS in 2-cell embryos(10×40);B.Fluorescence intensity of ROS in 2-cell embryos圖3 2-細(xì)胞胚胎ROS熒光染色圖及其量化圖Fig.3 Fluorescence imaging of ROS and quantification in 2-cell embryos

A.Mater、Zfp3612、Zp3和GAPDH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖；B.Mater、Zfp3612和Zp3基因mRNA相對(duì)表達(dá)量A.1% agarose gel electrophoresis for the PCR amplification products of the Mater,Zfp3612,Zp3 and GAPDH; B.Relative expression of Mater,Zfp3612 and Zp3圖4 小鼠胚胎2-細(xì)胞母性效應(yīng)基因的表達(dá)Fig.4 The expression of maternal-effect genes in mouse 2-cell embryos

A. Eif1a、Hsp70.1、Muerv-L、Zscan4d和GAPDH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖；B. Eif1a、Hsp70.1、Muerv-L和Zscan4d基因mRNA相對(duì)表達(dá)量A.1% agarose gel electrophoresis for the PCR amplification products of the Eif1a,Hsp70.1,Muerv-L,Zscan4d and GAPDH; B.Relative expression of Eif1a,Hsp70.1,Muerv-L and Zscan4d圖5 小鼠胚胎2-細(xì)胞合子基因的表達(dá)Fig.5 The expression of zygotic genes in mouse 2-cell embryos

3 討 論

已有研究報(bào)道，PPARγ激動(dòng)劑具有抗氧化效果。GW1929可增加人多巴胺能神經(jīng)元活性和保護(hù)它們免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激傷害[27]。羅格列酮通過(guò)上調(diào)UCP2的表達(dá)減輕ROS損傷以及血管平滑肌增殖和遷移，從而抑制內(nèi)膜增生相關(guān)的血管疾病[28]。吡格列酮通過(guò)調(diào)控人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的脂過(guò)氧化反應(yīng)，改善TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而減少細(xì)胞凋亡[29]。本研究通過(guò)DCHFDA測(cè)定2-細(xì)胞期胚胎內(nèi)部ROS水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，H2O2+PIO處理組的ROS水平顯著低于H2O2處理組，證實(shí)吡格列酮能夠降低H2O2誘導(dǎo)的胚胎內(nèi)部ROS水平。

導(dǎo)致胚胎體外發(fā)育阻滯可分為外因和內(nèi)因。外因是指植入前胚胎體外培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液的高滲透壓、輻射、胚胎代謝和試驗(yàn)操作都會(huì)使胚胎產(chǎn)生過(guò)多ROS[13]。由于植入前胚胎尚不具有成熟的抗氧化系統(tǒng)，因此早期胚胎對(duì)氧化應(yīng)激十分敏感，容易導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯或延遲[13-14]。在CZB培養(yǎng)液中，谷氨酰胺被用來(lái)替代葡萄糖作為能量物質(zhì)，其在克服2-細(xì)胞發(fā)育阻滯中起到積極作用[30]。這是由于CZB培養(yǎng)液中缺少由葡萄糖引起氧化應(yīng)激[31]，這間接說(shuō)明了ROS是導(dǎo)致小鼠2-細(xì)胞發(fā)育阻滯的原因之一。本研究中，H2O2誘導(dǎo)胚胎氧化應(yīng)激并不能導(dǎo)致小鼠1-細(xì)胞胚胎發(fā)育阻滯，但可明顯導(dǎo)致小鼠2-細(xì)胞胚胎發(fā)育阻滯，添加吡格列酮后可有效改善小鼠2-細(xì)胞胚胎發(fā)育阻滯。

此外，胚胎發(fā)育阻滯也受內(nèi)因影響。受精前，卵母細(xì)胞在體內(nèi)儲(chǔ)備大量母性效應(yīng)轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)在ZGA前指導(dǎo)和調(diào)控胚胎早期發(fā)育，如果卵母細(xì)胞或胚胎中ROS積聚，造成母性效應(yīng)基因損傷或減少，將危害隨后的細(xì)胞分裂[13]。J.T.Flood等[32]通過(guò)轉(zhuǎn)胞漿的研究提出，早期發(fā)育胚胎內(nèi)母型mRNA缺乏可導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定1-細(xì)胞胚胎母性效應(yīng)基因Hsf1、Zar1以及2-細(xì)胞母性效應(yīng)基因Mater、Zfp36l2、Zp3的mRNA表達(dá)，證實(shí)H2O2可加快胚胎內(nèi)部母性效應(yīng)基因的降解，吡格列酮可延緩氧化損傷胚胎部分母性效應(yīng)基因的減少，促進(jìn)胚胎的發(fā)育。雖然H2O2導(dǎo)致Hsf1、Zar1表達(dá)量明顯下降，但是并沒(méi)有使胚胎發(fā)生1-細(xì)胞阻滯，這可能是氧化應(yīng)激初期，胚胎內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能還完善，母型效應(yīng)因子儲(chǔ)備量充足，從而使合子順利過(guò)渡到2-細(xì)胞。至于本次研究中Zar1經(jīng)過(guò)處理后H2O2不顯條帶，可能是由于胚胎發(fā)育初期Zar1的表達(dá)量開(kāi)始迅速下降[6]，再加上H2O2使部分Zar1降解，以致電泳不足以顯示微量DNA條帶的緣故。

2-細(xì)胞胚胎向4-細(xì)胞胚胎過(guò)渡還需要合子型基因的調(diào)控，而ZGA啟動(dòng)依賴(lài)母性效應(yīng)物質(zhì)。氧化應(yīng)激下，母性效應(yīng)物質(zhì)降解加快，使大部分胚胎在2-細(xì)胞缺少這些物質(zhì)，ZGA啟動(dòng)延遲，最終導(dǎo)致2-細(xì)胞發(fā)育阻滯。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定MZT期胚胎合子基因的表達(dá)情況，證實(shí)H2O2抑制合子基因Zscan4d、Eif1a和Muerv-L的表達(dá)，這與D.P.Chu等[33]利用鄰苯二甲基-單-乙基己基酯(MEHP)暴露建立胚胎氧化應(yīng)激模型，導(dǎo)致合子基因Muerv-L表達(dá)下降相一致。然而，H2O2并不能明顯抑制Hsp70.1表達(dá)，與Y.Zhang等[34]利用ER抑制劑處理小鼠胚胎后得出的結(jié)論類(lèi)似。添加吡格列酮處理后，氧化損傷胚胎內(nèi)Eif1a、Hsp70.1、Muerv-L和Zscan4d的表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明能促進(jìn)氧化損傷胚胎合子型基因的表達(dá)，促進(jìn)小鼠2-細(xì)胞胚胎向4-細(xì)胞過(guò)渡。

從氧化應(yīng)激的角度推斷：氧化應(yīng)激下，小鼠胚胎啟動(dòng)自身防御系統(tǒng)，加快母性效應(yīng)物質(zhì)的消耗以抵御ROS對(duì)胚胎的傷害。在這個(gè)過(guò)程中，大部分母性效應(yīng)物質(zhì)的過(guò)度消耗甚至耗盡，導(dǎo)致合子型基因激活失敗，最終發(fā)生2-細(xì)胞發(fā)育阻滯。抗氧化物吡格列酮通過(guò)降低胚胎氧化應(yīng)激水平，延緩母性效應(yīng)基因的降解，增加合子型基因的表達(dá)，一定程度上促進(jìn)了胚胎的發(fā)育。

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(編輯 程金華)

Effect of Pioglitazone on Development Block of Mouse Embryos during Maternal to Zygotic Transition

XU Li-jie，LI Zhong-shu，F(xiàn)ANG Nan-zhu*

(DepartmentofAnimalScience，AgriculturalCollegeofYanbianUniversity，Yanji133002，China)

The aim of this study was to investigate the relationship of ROS, developmental block and pioglitazone as an antioxidant. The experiment was divided into 3 groups：Control group, H2O2group and H2O2+PIO group. The oxidative damage model of mouse embryos induced by H2O2was established and treated with or without pioglitazone. The ROS level after treatment with pioglitazone was measured by DCHF-DA and the expression of maternal effect genes and zygotic genes were analyzed by Semi-quantitative reverse transcription PCR. The results showed that: (1) the ROS level of H2O2group was significantly higher than control group and H2O2+PIO group in both 1-cell and 2-cell embryos (P<0.05); (2) the rate of 2-cell to 4-cell transition in H2O2group was significantly lower than control group and H2O2+PIO group (P<0.05), while the difference of 1-cell to 2-cell transition rate among the groups was not significant (P>0.05)；(3) the expression of maternal effect genes (Hsf1,Zfp3612,Zp3) and zygotic genes (Eif1-α,Muerv-L,Zscan4d) in H2O2group was lower than control group and H2O2+PIO group (P<0.05). The results provided a clear molecular aspect regarding the mechanism by which pioglitazone promoted embryos development and overcome 2-cell block.

pioglitazone; oxidative stress; development block; maternal effect gene; zygotic gene

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.011

2016-05-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360546)

徐禮杰(1984-)，男，廣東順德人，博士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：dsd0765@163.com

*通信作者：方南洙，教授，E-mail: nzfang@ybu.edu.cn

Q813.7

A

0366-6964(2016)11-2240-08