卵泡期和黃體期山羊垂體miRNAs表達(dá)譜及差異分析

凌英會(huì)，朱 龍，睢夢(mèng)華，鄭 琪，吳 昊，張運(yùn)海，章孝榮,3*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036； 2.安徽地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036；3.安徽省羊繁育工程技術(shù)研究中心，合肥 230036)

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卵泡期和黃體期山羊垂體miRNAs表達(dá)譜及差異分析

凌英會(huì)1,2，朱 龍1,2，睢夢(mèng)華1,2，鄭 琪1,2，吳 昊1,2，張運(yùn)海1,2，章孝榮1,2,3*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036； 2.安徽地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036；3.安徽省羊繁育工程技術(shù)研究中心，合肥 230036)

旨在通過高通量測(cè)序的方法篩選與分析卵泡期和黃體期安淮山羊垂體中差異表達(dá)miRNAs，探索垂體在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)山羊從卵泡期-黃體期過渡中發(fā)揮的作用。測(cè)序結(jié)果表明，卵泡期和黃體期文庫(kù)分別得到11 319 069和11 432 846條原始序列。經(jīng)過去除雜質(zhì)后，得到11 162 888和11 016 138條純凈序列。在兩個(gè)不同時(shí)期的文庫(kù)中，分別檢測(cè)到148和150種差異表達(dá)的miRNA，有147種miRNA共同表達(dá)；分別預(yù)測(cè)到52和95種差異表達(dá)的miRNA，有27種miRNA兩文庫(kù)共同表達(dá)。已知miRNA中，let-7f在兩文庫(kù)表達(dá)量最高，且差異極顯著；新miRNA中，novel-miR-159在兩文庫(kù)表達(dá)量最高，且差異極顯著。通路分析表明，ko00511、ko00052、ko01100、ko00030、ko00520 5個(gè)通路可能影響性激素的合成。測(cè)序獲得安淮山羊垂體組織miRNA序列及表達(dá)譜，垂體組織miRNA表達(dá)豐富，且表達(dá)量各異。研究結(jié)果有助于理解miRNA在山羊垂體中調(diào)節(jié)性激素分泌的作用，并且所鑒別的miRNA有助于后續(xù)卵泡期～黃體期轉(zhuǎn)變的相關(guān)研究。

miRNA;山羊;卵泡期;黃體期;垂體;Solexa

microRNA(miRNA)是一種內(nèi)源性的18～22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制mRNA翻譯或促使miRNA降解進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[1]。已有研究表明，在高等真核生物基因組中，已知miRNA約占1%，并且高達(dá)30%的蛋白編碼基因受miRNA的調(diào)控[2]。miRNA的調(diào)控涉及到多種生理過程，包括細(xì)胞增殖[3-4]、細(xì)胞凋亡[5]、腫瘤發(fā)生[6]、生殖調(diào)控[7]、細(xì)胞分化[8]、新陳代謝[9]和激素的分泌[10]。在山羊的研究中，有關(guān)山羊乳腺miRNA的相關(guān)研究[11]、毛囊發(fā)育[12]和繁殖及肌肉方面的功能研究[13-14]較多。在垂體組織的研究已經(jīng)證實(shí)EphA2是miR-26b的靶基因，并且成功建立miRNA的表達(dá)模式，為研究miR-26b在早期胚胎發(fā)育、垂體激素分泌和其他生殖功能中的研究提供基礎(chǔ)[15]。在培養(yǎng)的垂體細(xì)胞中過表達(dá)miR-325-3p可抑制促黃體激素(LH)的分泌及其在細(xì)胞中的含量[16]。進(jìn)一步的研究表明，促性腺激素釋放激素(GnRH)通過miR-132/212和SIRT1-FOXO1通路促進(jìn)促卵泡激素(FSH)的表達(dá)，這是第1個(gè)促性腺激素釋放激素調(diào)節(jié)促性腺激素基因表達(dá)的microRNA通路[17]。在卵巢中部分miRNA的表達(dá)是由FSH調(diào)控的，并且FSH通過miRNA的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)卵泡的生成，垂體可通過分泌FSH調(diào)節(jié)卵泡的生成，從而調(diào)節(jié)山羊的繁殖[18]。

垂體是動(dòng)物體最重要的內(nèi)分泌腺，分泌多種激素，如生長(zhǎng)激素、促性腺素、催產(chǎn)素、催乳素等。這些激素對(duì)代謝、生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖等有重要作用。對(duì)于垂體中參與調(diào)節(jié)生殖激素的miRNA的研究還較少。本研究通過高通量測(cè)序的方法，探測(cè)卵泡期和黃體期安淮山羊垂體中miRNA的表達(dá)和差異表達(dá)情況，預(yù)測(cè)其候選靶基因，并對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。有助于理解miRNA在山羊垂體中調(diào)節(jié)性激素的分泌所起的作用，所鑒別的一些miRNA有助于后續(xù)卵泡期～黃體期轉(zhuǎn)變的相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

采集安淮山羊垂體組織樣品6份，分成卵泡期組(FP)和黃體期組(LP)，兩組分別來(lái)自3只卵泡期的母羊垂體和3只黃體期的母羊垂體，6只山羊均為3歲半左右，已產(chǎn)過3胎。每組3只山羊垂體混合為一個(gè)池。在采集垂體組織樣前，通過試情和B超觀察山羊卵巢，符合條件的母羊屠宰后收集該羊的垂體組織樣于液氮中暫時(shí)保存，后轉(zhuǎn)移至-80 °C冰箱中長(zhǎng)期冷凍保存。本試驗(yàn)中的6只安淮山羊均來(lái)自于合肥博大牧業(yè)科技開發(fā)有限責(zé)任公司。為排除試驗(yàn)中的其他因素的影響，各個(gè)試驗(yàn)羊只的體況和年齡等基本一致，在種羊場(chǎng)內(nèi)統(tǒng)一采取該場(chǎng)的舍飼飼喂與管理制度。

1.2 RNA文庫(kù)的構(gòu)建

采用RNAiso Plus (TaKaRa)試劑盒提取山羊的垂體組織總RNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。使用PAGE膠分離不同片段大小的RNA，切取18～30 nt的條帶，回收Small RNA；配制5′接頭連接體系，混勻離心，室溫反應(yīng)一定時(shí)間，再用PAGE 膠純化回收5′連接產(chǎn)物；配制3′接頭連接體系，混勻離心，室溫反應(yīng)一定時(shí)間，再用PAGE 膠純化回收3′連接產(chǎn)物；配制反轉(zhuǎn)錄體系，在PCR 儀上室溫反應(yīng)一定時(shí)間，使連接產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄成雙鏈，再配制PCR 反應(yīng)體系，在PCR 儀上按照一定程序進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)過純化和質(zhì)檢，達(dá)到要求后，基于Illumina Solexa測(cè)序平臺(tái)的高通量測(cè)序，由深圳華大基因科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

小RNA測(cè)得raw data數(shù)據(jù)通過雜質(zhì)的過濾和初步判斷進(jìn)行篩選。對(duì)過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)和長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)兩樣品間公共序列和特有序列的種類(用unique表示)及數(shù)量(用total表示)分布情況，并將所有sRNA與各類RNA，采用NCBI GenBank (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)和Rfam (http://rfam.janelia.org/)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋[19]。通過Blast或Bowtie將sRNA和miRBase (http://www.mirbase.org/ftp.shtml)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，鑒定出已知miRNA用于后續(xù)分析。對(duì)未注釋上任何RNA且比對(duì)上基因組外顯子反義鏈、內(nèi)含子、基因間區(qū)的sRNAs，通過選用軟件Mirdeep篩選miRNA的生物特征預(yù)測(cè)出新miRNA。

對(duì)兩個(gè)樣品中表達(dá)的miRNA統(tǒng)計(jì)，分析樣品間的表達(dá)量差異顯著性，并分別使用log2-ratio、Scatter plot圖比較兩者共同表達(dá)的miRNA表達(dá)量的差異[20]。

利用cluster軟件，依據(jù)顯著差異表達(dá)基因差異倍數(shù)的log2值進(jìn)行聚類。采用RNAhybrid軟件對(duì)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。通過GO功能顯著性富集分析確定候選靶基因行使的主要生物學(xué)功能。并以KEGG中的通路為單位進(jìn)行通路顯著性富集分析，篩選與整個(gè)參考基因相比較在候選靶基因中顯著性富集的通路[21]。FDR≤0.05的通路被認(rèn)為在候選靶基因中顯著富集。通過通路顯著性富集分析能確定候選靶基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.4 熒光定量PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)隨機(jī)選取了5個(gè)miRNA進(jìn)行qRT-PCR的驗(yàn)證試驗(yàn)。用1 μg的總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR?Prime ScriptTMmiRNA RT-PCR試劑盒(TaKaRa, Japan)的說(shuō)明書步驟來(lái)獲得cDNA。在37 ℃孵育1 h,95 ℃滅活5 min，之后加入80 μL 的RNase free H2O稀釋反應(yīng)體系至100 μL，并儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中，以產(chǎn)生qRT-PCR的模板。qRT-PCR的特異性上游引物是根據(jù)各個(gè)所選miRNA的自身序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，其下游引物為通用引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。選擇GAPDH作為內(nèi)參基因，每個(gè)miRNA指標(biāo)經(jīng)qRT-PCR擴(kuò)增后，得到各個(gè)指標(biāo)的CT值，使用2-(CTmiRNA-CT5sRNA)法計(jì)算不同miRNA之間的相對(duì)表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列

Table 1 Primer sequences of real-time PCR

名稱Name序列(5'-3')Sequence長(zhǎng)度/ntLengthGC含量/%GCcontentchi-let-7fUGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU2231.8chi-miR-125aUCCCUGAGACCCUUUAACCUGU2250.0chi-miR-148aAAAGUUCUGAGACACUCCGACU2245.5chi-let-7aUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU2236.4chi-miR-26aUUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU2240.9

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量與分布

隨機(jī)選擇5條RNA-Seq顯示在卵泡期垂體和黃體期垂體中存在顯著性差異的miRNA，通過實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)其檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。檢測(cè)顯示，5條差異miRNA，存在差異且差異趨勢(shì)與RNA-Seq檢測(cè)結(jié)果一致(圖1)。

對(duì)過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估合格后，統(tǒng)計(jì)測(cè)序結(jié)果顯示卵泡期山羊(FP)共得到11 319 069條原始序列，黃體期山羊(LP)共得到11 432 846條原始序列。經(jīng)過去除雜質(zhì)后，卵泡期文庫(kù)得到11 162 888條純凈序列，占測(cè)得高質(zhì)量序列的99.05%；黃體期文庫(kù)得到11 016 438條純凈序列，占測(cè)得高質(zhì)量序列的96.78%。這些純凈序列將用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析(表2)。

上標(biāo)的字母表示在0.05顯著水平上的比較結(jié)果Superscript letters indicate significant difference at the level of 0.05圖1 5條差異miRNAs的RT-PCR結(jié)果Fig.1 The RT-PCR results of 5 differentially expressed miRNAs

表2 高通量測(cè)序文庫(kù)的小RNA片段質(zhì)量分類

Table 2 The classification of total small RNA tags by Solexa sequencing

分類Type卵泡期FP黃體期LP數(shù)量Count百分比/%Percent數(shù)量Count百分比/%PercentTotal_reads1131906911432846High_quality11269747100.0011382781100.003'adapter_null384580.34534190.47insert_null4700.003890.005'adapter_contaminants23670.0254350.05Smaller_than_18nt655200.583070842.70PolyA440.00160.00Clean_reads1116288899.051101643896.78

統(tǒng)計(jì)兩個(gè)文庫(kù)中序列的長(zhǎng)度分布(圖2)，圖2表明，卵泡期文庫(kù)中序列長(zhǎng)度分布主要位于20～30 nt，黃體期文庫(kù)中序列長(zhǎng)度分別主要位于20～23 nt；波峰與miRNA的典型長(zhǎng)度22 nt一致，在卵泡期和黃體期文庫(kù)中分別占26.42%和54.07%。動(dòng)物體中成熟的miRNA序列是Dicer酶的酶切產(chǎn)物，長(zhǎng)度分布是在22 nt左右，說(shuō)明本試驗(yàn)的小RNA的測(cè)序文庫(kù)長(zhǎng)度分布基本囊括了各類miRNA。

通過統(tǒng)計(jì)兩樣品間公共序列和特有序列的種類及數(shù)量，可以得到兩樣品間公共序列和特有序列的分布情況(圖3)。圖3表明，兩文庫(kù)間的公共序列有20 504 157條占總序列的92.45%，特有序列種類分別有659 839條和149 547條，分別占有75.65%和17.15%。測(cè)序結(jié)果表明，兩樣品間序列種類的差異比較大，但公共部分的序列其表達(dá)是比較集中的，這說(shuō)明兩樣品在測(cè)序整體上的一致性較好。

A.卵泡期; B.黃體期A.FP; B.LP圖2 測(cè)序結(jié)果的序列長(zhǎng)度分布Fig.2 Distribution of sequence lengths of the sequencing results

圖3 公共(A)和特有(B)sRNA種數(shù)Fig.3 Number of total (A) and unique (B) sRNA tags

2.2 sRNA分類注釋

將所有sRNA與各類RNA的比對(duì)情況進(jìn)行總結(jié)，得到了卵泡期純凈序列共722 640種，黃體期純凈序列共212 348種。去除各類小RNA(rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA)和重復(fù)序列后，參與后續(xù)的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的miRNA在卵泡期和黃體期中分別占36.44%和46.31%。但是在序列種類中，miRNA在卵泡期和黃體期文庫(kù)中僅占0.37%和1.55%，其余大部分序列主要是被歸類為未知序列。測(cè)序結(jié)果顯示miRNA的表達(dá)量占主要部分，而種類最多的未知序列的表達(dá)量非常低(圖4)。

2.3 已知miRNA比對(duì)和新miRNA預(yù)測(cè)

通過blast或bowtie將sRNA和miRBase 21.0數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，由于數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄山羊miRNA的相關(guān)信息，本試驗(yàn)是將測(cè)序文庫(kù)比對(duì)到山羊的miRNA的數(shù)據(jù)庫(kù)中，鑒定出卵泡期和黃體期分別得到368種和371種已知miRNA,分別得到8 482 909和5 108 138的序列表達(dá)量。這些已知miRNA可用于后續(xù)分析。使用mirdeep(該軟件適用動(dòng)物)對(duì)未注釋上任何RNA且比對(duì)上基因組外顯子反義鏈、內(nèi)含子、基因間區(qū)的sRNAs預(yù)測(cè)新miRNA，結(jié)果得到新miRNA卵泡期75種和黃體期125種，表達(dá)量分別為86 670和191 152。其中有46種在卵泡期和黃體期共同表達(dá)，且卵泡期和黃體期的新miRNA的表達(dá)量高于1 000拷貝數(shù)有5和8種，剩余大部分不高于100個(gè)拷貝數(shù)。

2.4 已知miRNA和新miRNA分析

2.4.1 已知miRNA和新miRNA的差異分析 對(duì)已知miRNA和新miRNA進(jìn)行差異分析，為找出已知miRNA和新miRNA兩種文庫(kù)的差異性，首先對(duì)兩種文庫(kù)各自特異性表達(dá)miRNA進(jìn)行分析。得到已知miRNA中，卵泡期和黃體期文庫(kù)分別得到148和150種差異表達(dá)的miRNA,有147種miRNA為共同表達(dá)，卵泡期特異性表達(dá)1種，黃體期特異性表達(dá)3種；新miRNA中卵泡期文庫(kù)和黃體期文庫(kù)分別得到52和95種差異表達(dá)的miRNA，有27種miRNA兩文庫(kù)共同表達(dá)，卵泡期特異性表達(dá)的有25種，黃體期特異性表達(dá)的有68種。兩種文庫(kù)中大部分的miRNA表達(dá)量較低，而且在已知miRNA文庫(kù)中特異性表達(dá)的miRNA不高于5。在新miRNA文庫(kù)中，特異性表達(dá)的有novel-miR-176表達(dá)量達(dá)到1 388和novel-miR-189的表達(dá)量為1 416，剩余的大部分都不高于100。而表達(dá)量高且差異顯著的miRNA中，各種miRNA的表達(dá)量差異較大，在兩種文庫(kù)中已知miRNA和新miRNA的表達(dá)量主要集中于少數(shù)幾個(gè)miRNA中。已知miRNA中卵泡期和黃體期文庫(kù)的表達(dá)量高于1 000的miRNA部分差異較大，且差異顯著；新miRNA中卵泡期和黃體期文庫(kù)分別有1個(gè)和3個(gè)miRNA的表達(dá)量高于1 000。見表3，4及圖5。

表3 已知miRNA中表達(dá)量超過1 000且差異顯著的miRNA

Table 3 Expressed level of higher than 1 000 and significant differently in the known miRNAs

miR_name卵泡期FPFP-expressedFP-stdmiR_name黃體期LPLP-expressedLP-stdchi-let-7f-5p11853420064.62chi-let-7f-5p1092904190313.30chi-let-7a-5p460537795.536chi-let-7a-5p26290845781.59chi-miR-10b-5p425217197.663chi-let-7e-5p16386728535.04chi-miR-129-3p143082421.96chi-miR-423-5p8474714757.45chi-let-7e-5p97321647.37chi-miR-222-3p252924404.23chi-miR-423-5p94161593.88chi-miR-296-3p189313296.56chi-miR-222-3p5244887.67chi-miR-200b139882435.81chi-miR-296-3p2768468.55chi-miR-10b-5p98091708.09chi-miR-200b3208543.03chi-miR-128-3p5447948.52chi-miR-485-5p3946687.14chi-miR-27a-3p3082536.69chi-miR-224-5p2690468.42chi-miR-877-5p2004348.97chi-miR-126-3p1752305.09chi-miR-129-3p1405244.66

表4 新miRNA中表達(dá)量超過1 000的miRNA

Table 4 Expressed level of higher than 1 000 and significant differently in the novel miRNAs

miR_name卵泡期FPFP-expressedFP-stdmiR_name黃體期LPLP-expressedLP-stdnovel_miR_20178281325.070novel_miR_159442337702.531novel_miR_15968661162.229novel_miR_201220133833.242novel_miR_1891416239.691novel_miR_5568981201.186novel_miR_1761388241.700

A、C.卵泡期文庫(kù)中所有序列和特有序列分布；B、D.黃體期文庫(kù)中所有序列和特有序列分布A， C.Total number of reads and unique sequences in the Fols；B,D.Total number of reads and unique sequences in the Luts圖4 高通量測(cè)序中小RNA的分類組成Fig.4 Composition of small RNA classes of the sequencing

圖5 已知miRNA (A)和新miRNA (B)表達(dá)的差異散點(diǎn)圖Fig.5 Differences of miRNA expression in the known (A) and novel miRNA libraries (B)

2.4.2 已知miRNA和新miRNA的表達(dá)模式聚類分析 將兩種文庫(kù)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行聚類分析后，將表達(dá)模式相似的miRNA進(jìn)行相互聚類，聚類圖中綠色表示miRNA在黃體期文庫(kù)中的表達(dá)水平高于卵泡期，紅色表示miRNA在卵泡期文庫(kù)中的表達(dá)水平高于黃體期，新miRNA文庫(kù)中差異表達(dá)的miRNA聚類如圖6。

2.4.3 已知miRNA和新miRNA的靶基因預(yù)測(cè) 對(duì)已知miRNA和新miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，使用RNAhybrid軟件對(duì)已知miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。已知miRNA中卵泡期和黃體期文庫(kù)差異表達(dá)的miRNA有151種，卵泡期和黃體期預(yù)測(cè)得到的靶基因位點(diǎn)數(shù)量為29 494；新miRNA中卵泡期文庫(kù)和黃體期文庫(kù)有120種差異表達(dá)的miRNA，卵泡期和黃體期預(yù)測(cè)得到的靶基因位點(diǎn)為29 494。

圖6 新miRNA文庫(kù)中差異表達(dá)miRNA聚類圖Fig.6 Clustering of miRNAs differentially expressed in novel miRNA libraries

2.4.4 GO富集與KEGG分析 本試驗(yàn)GO富集情況分析中，差異表達(dá)的已知miRNA的GO富集分析結(jié)果顯示，10 793個(gè)背景基因被映射到所處的細(xì)胞位置(Cellular component)部分，有2 045個(gè)差異表達(dá)的miRNA靶基因被映射到該部分，與背景基因的映射相比較，有2個(gè)條目(MHC protein complex，anchoring junction)顯著富集(P-value<0.05)；有10 487個(gè)背景基因被映射到分別描述基因的分子功能(Molecular function)部分，有1 955個(gè)miRNA的靶基因被映射到該部分，與背景基因的映射相比較，有1個(gè)條目(Receptor binding)顯著富集；而有10 020個(gè)背景基因被映射到參與的生物過程(Biological process)部分，有1 909個(gè)miRNA的靶基因被映射到該部分，與背景基因的映射相比較，有2個(gè)顯著富集條目(Membrane lipid metabolic process，hematopoietic progenitor cell differentiation)。

差異表達(dá)的新miRNA富集分析中各部分的背景基因與已知miRNA組相同。有2 435個(gè)miRNA的靶基因被映射到所處的細(xì)胞位置部分，有2個(gè)顯著富集條目(Cell division site，cell division site part)；有2 400個(gè)miRNA的靶基因被映射分別描述基因的分子功能部分，有2個(gè)條目顯著富集(Ras GTPase binding，small GTPase binding)；有2 285個(gè)miRNA的靶基因被映射到參與的生物過程部分，有3個(gè)條目顯著富集(Ribonucleoprotein complex assembly，response to light stimulus，ribonucleoprotein complex subunit organization)。GO功能分析針對(duì)的是靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果，通過對(duì)顯著富集term中的miRNA進(jìn)行GO功能分析，以基因的數(shù)量來(lái)推斷miRNA的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的已知miRNA和新miRNA文庫(kù)的功能分析結(jié)果圖中Cell的百分比最多，說(shuō)明樣品中miRNA主要是靶向與cell相關(guān)的基因(圖7)。

KEGG分析結(jié)果顯示，已知miRNA組和新miRNA組中都有22 885個(gè)山羊背景基因，在已知miRNA和新miRNA文庫(kù)中，分別被標(biāo)注到283和294個(gè)生物學(xué)過程中。對(duì)于卵泡期和黃體期兩文庫(kù)所測(cè)數(shù)據(jù)中，已知miRNA和新miRNA文庫(kù)中分別有4 251和5 241個(gè)miRNA的靶基因被標(biāo)注到相關(guān)的生物學(xué)通路中；并且與背景基因所參與的生物學(xué)過程相比較，分別有26和2個(gè)顯著富集通路(Q-value<0.05)。

圖7 差異表達(dá)的新miRNA靶基因GO分析(LP-vs-FP)Fig.7 GO classification annotated for the target gene of novel miRNA (LP-vs-FP)

3 討 論

山羊的經(jīng)濟(jì)效益主要取決于它的總生產(chǎn)力，母山羊的生產(chǎn)率更依賴于生殖力和產(chǎn)羔數(shù)[22-24]。但是，山羊的排卵率是比較低的，其遺傳力系數(shù)主要介于0.09～0.14，山羊的排卵率很難通過常規(guī)育種方法改善排卵率低。因此，研究人員希望通過分子輔助育種技術(shù)與miRNA的研究來(lái)提高山羊的排卵率[25]。垂體可以通過分泌FSH、LH和GnRH等激素調(diào)節(jié)卵泡的分泌，從而調(diào)節(jié)山羊的卵泡期到黃體期的轉(zhuǎn)變。通過對(duì)小鼠的下丘腦-垂體-卵巢軸研究發(fā)現(xiàn)，miR-200b和miR-429參與哺乳動(dòng)物生殖的調(diào)節(jié)及調(diào)節(jié)排卵[26]。在豬的垂體細(xì)胞中，上調(diào)miR-361-3p表達(dá)抑制FSH的分泌，下調(diào)miR-361-3p的表達(dá)可促進(jìn)FSH的分泌[27]。miR-21在卵巢顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)變成黃體細(xì)胞的過程中具有抗細(xì)胞凋亡作用，敲低miR-21的表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞調(diào)亡，排卵率明顯下降，這種作用依賴于LH的分泌[28]。測(cè)序發(fā)現(xiàn)卵泡期和黃體期文庫(kù)，分別得到148和150種差異表達(dá)的miRNA，有147種miRNA共同表達(dá)。在卵泡期和黃體期兩文庫(kù)中，分別預(yù)測(cè)得到52和95種差異表達(dá)的miRNA，有27種miRNA兩文庫(kù)共同表達(dá)。垂體在動(dòng)物生殖過程中起重要作用，本研究可進(jìn)一步探索垂體中miRNA在性激素分泌中所起到的作用，為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。

為尋找卵泡期和黃體期垂體中miRNA的差異表達(dá)情況，筆者建立了卵泡期和黃體期的miRNA的兩個(gè)文庫(kù)，用以尋找miRNA水平上的差異表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)各組特異性表達(dá)的miRNA參與相關(guān)通路的調(diào)節(jié)，但其表達(dá)量過低，而表達(dá)量高且差異顯著的miRNA研究發(fā)現(xiàn)，已知miRNA中l(wèi)et-7f在兩種文庫(kù)中表達(dá)量都最高，且差異極顯著；其次分別為let-7a、 let-7e，除let-7家族之外表達(dá)量較高的為miR-10b、miR-129、miR-423、miR-222。研究發(fā)現(xiàn)let-7家族的let-7a、let-7b、let-7c、let-7I在早期閉鎖、逐步閉鎖與健康豬卵泡相比卵巢的卵泡明顯下降，而let-7G在卵泡閉鎖呈高表達(dá)[29]。用豬垂體前葉細(xì)胞為模型，研究發(fā)現(xiàn)let-7a和let-7c可能起到調(diào)節(jié)FSH分泌的作用[27]。在前人對(duì)垂體的測(cè)序分析表明，miR-10b在上調(diào)基因中表達(dá)倍數(shù)最高，且在促性腺激素分泌垂體腺瘤中表達(dá)顯著差異[30]。本次對(duì)于垂體的測(cè)序結(jié)果表明，let-7f的表達(dá)量在卵泡期文庫(kù)顯著高于黃體期，且在差異表達(dá)的已知miRNA中l(wèi)et-7家族在LP組中占總表達(dá)量的28.9%,在FP組中占總表達(dá)量的16.8%。說(shuō)明let-7家族和miR-10b可能參與垂體性激素的分泌，為研究其在垂體性激素分泌的調(diào)節(jié)方面提供幫助。

GO富集情況分析表明，已知miRNA和新miRNA的GO富集分析分別有5和7個(gè)顯著富集條目。在GO功能分析表明，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的已知miRNA和新miRNA文庫(kù)的功能分析結(jié)果表明Cell的百分比最多，說(shuō)明樣品中miRNA主要是靶向與cell相關(guān)的基因。KEGG分析結(jié)果顯示，與背景基因所參與的生物學(xué)過程相比較，已知miRNA和新miRNA文庫(kù)所有的miRNA靶基因參與的生物學(xué)過程，分別有26個(gè)和2個(gè)通路顯著富集(Q-value<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)IL-6/C/EBPβ，P53/P21和P16通路在D-半乳糖處理老化垂體細(xì)胞中會(huì)被激活，但是慢性雌激素的治療這些通路可免疫垂體腫瘤[31]。D-半乳糖可導(dǎo)致大鼠亞急性衰老LH、FSH、GnRH明顯上升[32]。富集通路中，ko00511:Other glycan degradation、ko00052:Galactose metabolism、ko01100:Metabolic pathways、ko00030:Pentose phosphate pathway、ko00520:Amino sugar and nucleotide sugar metabolism 5個(gè)通路可能會(huì)通過參與D-半乳糖的代謝從而影響性激素的合成。

4 結(jié) 論

對(duì)卵泡期和黃體期山羊的垂體進(jìn)行小RNA文庫(kù)的構(gòu)建，分別得到148種和150種已知miRNA，有147種miRNA共同表達(dá)。在卵泡期和黃體期兩文庫(kù)中，分別預(yù)測(cè)得到59和95種新miRNA，有27種miRNA兩文庫(kù)共同表達(dá)。卵泡期和黃體期文庫(kù)中，已知miRNA中，let-7f在兩文庫(kù)差異極顯著，且表達(dá)量最高，其次分別為let-7a、miR-10b和let-7e；新miRNA中novel-miR-159在兩文庫(kù)差異極顯著，且表達(dá)量最高，其次為novel-miR-55。通路分析表明，ko00511、ko00052、ko01100、ko00030、ko00520通路可能影響性激素的合成。

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(編輯 程金華)

Comparative Profiling of Differentially Expressed microRNAs between the Follicular and Luteal Phases Pituitary of Goats

LING Ying-hui1,2,ZHU Long1,2,SUI Meng-hua1,2,ZHENG Qi1,2,WU Hao1,2,ZHANG Yun-hai1,2,ZHANG Xiao-rong1,2,3*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,China;2.LocalAnimalGeneticResourcesConservationandBiobreedingLaboratoryofAnhuiProvince,Hefei230036,China；3.EngineeringResearchCenterofReproductionandBreedinginSheepofAnhuiProvince,Hefei230036,China)

In this study, we used Solexa sequencing to screen and analyze the differentially expressed microRNAs (miRNAs) of Anhuai goat pituitary tissues in the follicular phase (Fols) and luteal phase (Luts), and explore the role of pituitary at post-transcriptional level of Fols to Luts transition occurred in goats. In total, 11 319 069 and 11 432 846 raw reads were obtained from the ovaries of Anhuai goats in Fols and Luts, respectively, after eliminating impurity, 11 162 888 and 11 016 138 clean reads. 147 known miRNAs were co-expressed in the two different periods phases, 148 and 150 known miRNAs were expressed in the ovary in the Fols and Luts, respectively. In addition, 27 novel miRNAs were co-expressed in the two phases, 52 and 95 novel miRNAs were expressed in the ovary in the Fols and Luts, respectively. Let-7f was the highest expressed significantly different known miRNAs in the two phases, and miR-159 was the highest expressed significantly different novel miRNAs in the two phases, which may participate in the follicular-luteal transition of Anhuai goats. In the KEGG pathway analysis, ko00511, ko00052, ko01100, ko00030 and ko00520 may be related to the synthesis of sex hormones. The study succeeded to construct the expression library of miRNAs which were abundant and differentially expressed in Anhuai goat pituitary tissues. The results will help to further understand the role of miRNAs which regulates secretion of hormone participate in goat pituitary. And some identified miRNAs will help to further understand the role of miRNAs in the regulation of follicular to luteal transition in goat ovaries.

miRNA;goat;follicular phase;luteal phase;pituitary;Solexa

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.009

2016-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301934;31372310);安徽省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(2016-2020)

凌英會(huì)(1981-)，男，安徽安慶人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：caaslyh@163.com

*通信作者：章孝榮，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物生殖調(diào)控研究， E-mail：zhangxiaorong01@163.com

S827.2

A

0366-6964(2016)11-2218-10